本發(fā)明涉及一種單克隆抗體、分泌該單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株、以及該單克隆抗體的用途。

背景技術(shù)：

鴨甲型肝炎病毒(DHAV)可引起雛鴨發(fā)生急性、高度致死性傳染病，主要感染4周齡以下的雛鴨，其中1周齡以內(nèi)的雛鴨死亡率高達(dá)95％，主要特征病變?yōu)榛疾▲喌母闻K腫大和出血。根據(jù)基因組特征和抗原中和試驗(yàn)，將鴨甲型肝炎病毒分為3個(gè)基因型或血清型，即鴨甲型肝炎病毒1型(DHAV-1)、2型(DHAV-2)和3型(DHAV-3)。其中鴨甲型肝炎病毒1型與2型不產(chǎn)生交叉保護(hù)作用，與3型有部分交叉中和反應(yīng)。目前我國(guó)養(yǎng)鴨生產(chǎn)中均有1型和3型鴨甲型肝炎的發(fā)生和流行，但尋找1型和3型鴨甲型肝炎病毒的共同抗體并建立能同時(shí)檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的簡(jiǎn)便快速檢測(cè)方法一直是學(xué)術(shù)界和生產(chǎn)中沒有很好解決的難題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于研制既能識(shí)別1型鴨甲型肝炎病毒、也能識(shí)別3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供廣譜、特異性強(qiáng)、親和力高的檢測(cè)抗體。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，經(jīng)研究，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

1.雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1，保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201701。

2.由雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體。

3.所述單克隆抗體在制備單獨(dú)檢測(cè)1型或3型鴨甲型肝炎病毒以及同時(shí)檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的試劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明以純化的1型鴨甲型肝炎病毒作為免疫原及篩選抗原，通過(guò)單克隆抗體技術(shù)篩選出了能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該雜交瘤細(xì)胞株穩(wěn)定性好，經(jīng)過(guò)體外傳代以及細(xì)胞凍存復(fù)蘇仍能穩(wěn)定分泌單克隆抗體；所分泌的單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別1型和3型鴨甲型肝炎病毒，與1型鴨甲型肝炎病毒的親和常數(shù)在10⁹數(shù)量級(jí)以上，且不與鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌發(fā)生特異性反應(yīng)，從而為臨床和基層單位不漏檢1型或3型鴨甲型肝炎病毒提供了廣譜、特異性強(qiáng)、親和力高的檢測(cè)抗體，可用于制備單獨(dú)檢測(cè)1型或3型鴨甲型肝炎病毒以及同時(shí)檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的試劑。

生物材料保藏

雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1于2017年1月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201701。

附圖說(shuō)明

圖1為免疫小鼠脾細(xì)胞、SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，其中a為免疫小鼠脾細(xì)胞，b為培養(yǎng)24h的飼養(yǎng)細(xì)胞，c為培養(yǎng)7d的飼養(yǎng)細(xì)胞，d為SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞。

圖2為融合后的雜交瘤細(xì)胞，其中1為培養(yǎng)5d后的雜交瘤細(xì)胞；2為培養(yǎng)9d后的雜交瘤細(xì)胞。

圖3為純化腹水的SDS-PAGE分析，其中M為蛋白Marker，1為雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1的純化腹水。

圖4為單克隆抗體的親和力常數(shù)測(cè)定。

圖5為膠體金顆粒與金標(biāo)單克隆抗體的紫外光譜。

圖6為膠體金試紙條的組裝示意圖。

圖7為膠體金試紙條的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗包被濃度優(yōu)化，1-6分別為多抗?jié)舛?.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL、1.2mg/mL、1.4mg/mL和1.6mg/mL。

圖8為膠體金試紙條的羊抗鼠IgG包被濃度優(yōu)化，1-6分別為羊抗鼠IgG濃度0.2mg/mL、0.6mg/mL、1.0mg/mL、1.4mg/mL、1.8mg/mL和2.0mg/mL，7為陰性。

圖9為膠體金試紙條的金標(biāo)單克隆抗體包被濃度優(yōu)化，1-8分別為1mL金標(biāo)單克隆抗體溶液離心后的沉淀用100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL和450μL金標(biāo)抗體重懸液稀釋。

圖10為膠體金試紙條檢測(cè)1型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，1-9分別為陽(yáng)性鴨胚尿囊液(0.6mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128和1:256稀釋，10為陰性對(duì)照。

圖11為膠體金試紙條檢測(cè)3型鴨甲型肝炎病毒的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果，1-7分別為陽(yáng)性鴨胚尿囊液(0.3mg/mL)按1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32和1:64稀釋，8為陰性對(duì)照。

圖12為膠體金試紙條檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的特異性試驗(yàn)結(jié)果，1-5和7分別為3型鴨甲型肝炎病毒CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株，6和8-10分別為1型鴨甲型肝炎病毒BZB株、CD1231株、DY0903株和X株，11為陰性對(duì)照。

圖13為膠體金試紙條檢測(cè)鴨常見的其它致病病原的特異性試驗(yàn)結(jié)果。

圖14為膠體金試紙條檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果，1-3分別為第1、2、3批次的膠體金試紙條，a為檢測(cè)1型鴨甲型肝炎病毒；b為檢測(cè)3型鴨甲型肝炎病。

圖15為膠體金試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果，1-3分別為保存1、2、3個(gè)月。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，下面將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。

優(yōu)選實(shí)施例中使用的主要材料如下：

1、細(xì)胞、菌株與毒株

SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；1型鴨甲型肝炎病毒(BZB株、CD1231株、DY0903株和X株)、3型鴨甲型肝炎病毒(CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株)、鴨病毒性腸炎病毒(DPV CHv株)、鴨乙肝病毒(DHBV)、鴨坦布蘇病毒(DTMUV)、小鵝瘟病毒(GPV)、鴨大腸桿菌(E.coli,保藏號(hào)：CVCC83003)、鴨沙門氏菌(SE,保藏號(hào)：CMCC50083)、鴨疫里默氏桿菌(RA CH-1株)均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心保存提供。

2、試驗(yàn)動(dòng)物

6-8周齡和10-12周齡SPF BALB/c雌性小鼠購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；10日齡鴨胚購(gòu)自四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)場(chǎng)。

3、試劑與材料

HAT培養(yǎng)基添加劑(50×)、聚乙二醇(PEG 1450)、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)和RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)為BIOSHARP公司產(chǎn)品；鼠單克隆抗體Ig類亞類鑒定酶標(biāo)二抗套裝購(gòu)自北京博奧龍免疫技術(shù)有限公司；一次性細(xì)胞瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板和ELISA酶標(biāo)板購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病防治研究中心保存提供；20nm膠體金溶液、玻璃纖維素膜(MA0280、GL0194)、硝酸纖維素(NC)膜(Sartorius CN140，Sartorius CN95，vivid 170和Millipore 135)、樣品墊(GL-b03和GL-b04)、吸收墊(H5072)、底板(DB-6)、白色塑料卡(A-9)和銜接膠帶均購(gòu)自上海杰一生物技術(shù)有限公司；玻璃纖維素膜(CB-0801、SB06、VL78)購(gòu)自上海金標(biāo)生物科技有限公司。

4、儀器設(shè)備

超純水儀(WaterPro，美國(guó)Labconco公司)；核酸蛋白檢測(cè)儀(SmartSpec 3000，美國(guó)Bio-rad公司)；凝膠成相系統(tǒng)(GelDoc 3000，美國(guó)Bio-rad公司)；倒置熒光顯微鏡(TE2000-U，日本Nikon公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(3951Reach-In，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；酶標(biāo)儀(MODEL 680，美國(guó)Bio-rad公司)。

三維平面點(diǎn)膜噴金儀(HM3030，上海金標(biāo)生物科技有限公司)；壓殼機(jī)(YK725，上海金標(biāo)生物科技有限公司)；微電腦自動(dòng)斬切機(jī)(上海金標(biāo)生物科技有限公司)。

實(shí)施例1、雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1的獲得與鑒定

一、1型鴨甲型肝炎病毒的繁殖及純化

將1型鴨甲型肝炎病毒X株(保藏號(hào)為CCTCC NO：C201538)的病毒液用生理鹽水做適當(dāng)稀釋，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，通過(guò)尿囊腔接種于10日齡的鴨胚，0.1mL/枚；另取5枚10日齡的鴨胚作為對(duì)照組接種生理鹽水；37℃條件下孵育，棄去接種24h內(nèi)死亡鴨胚，以后每天照蛋2次，觀察3-5d；收集接種后36-72h死亡并且病變明顯的鴨胚尿囊液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

取上述凍存的鴨胚尿囊液，反復(fù)凍融3次后，于4℃、6000r/min離心15min，棄去沉淀；在上清液中加入等量氯仿強(qiáng)烈振搖20min，于4℃、6000r/min離心20min，取上清液，重復(fù)上述氯仿抽提操作3次以除去脂類及一些雜蛋白；將上清液于4℃、40000r/min離心2h，收獲沉淀并懸浮于0.01mol/L、pH7.4的PBS中，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在260nm和280nm處的光密度，計(jì)算純化的1型鴨甲型肝炎病毒的濃度，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

二、小鼠免疫

以純化的1型鴨甲型肝炎病毒為免疫原，免疫6-8周齡的BALB/c雌性小鼠。首次免疫(第1d)，按照每只小鼠100μg 1型鴨甲型肝炎病毒的劑量與弗氏完全佐劑等體積混合并充分乳化，背部皮下多點(diǎn)注射；第二次免疫(第14d)，用弗氏不完全佐劑處理相同劑量的1型鴨甲型肝炎病毒進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射；第三次免疫(第28d)，用弗氏不完全佐劑處理相同劑量的1型鴨甲型肝炎病毒進(jìn)行背部皮下多點(diǎn)注射。第三次免疫后10d，從小鼠尾靜脈采血，37℃靜置2h，4℃過(guò)夜，之后5000r/min離心10min分離血清，采用間接ELISA方法檢測(cè)血清抗體效價(jià)，選取血清效價(jià)達(dá)到1:10⁴以上的BALB/c小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。細(xì)胞融合前3d，小鼠腹腔注射無(wú)佐劑1型鴨甲型肝炎病毒50μg/只進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

間接ELISA方法如下：將純化的1型鴨甲型肝炎病毒用0.05mol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液按體積比1:800稀釋后加入酶標(biāo)板，100μL/孔(187.5ng/孔)，4℃包被過(guò)夜，PBS-T洗滌，每孔加入0.01g/mL BSA溶液200μL，37℃封閉2h，PBS-T洗滌，每孔加入100μL用0.01mol/L、pH7.4的PBS按體積比1:800稀釋的免疫小鼠血清為一抗，37℃孵育30min，PBS-T洗滌，每孔加入100μL用0.01mol/L、pH7.4的PBS按體積比1:5000稀釋的HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG，37℃孵育1h，洗滌液洗滌，每孔加入TMB顯色液100μL，37℃顯色10min，每孔加入2mol/L H₂SO₄溶液50μL終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀以雙波長(zhǎng)形式讀取OD₄₅₀-OD₆₃₀值。試驗(yàn)孔的OD₄₅₀-OD₆₃₀值記為P，陰性對(duì)照孔的OD₄₅₀-OD₆₃₀值記為N，計(jì)算P/N值，若P/N值≥2.1為陽(yáng)性，反之為陰性。

三、細(xì)胞融合

將SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫小鼠脾細(xì)胞按1:5的比例混勻，放入50mL離心管中，1800r/min離心5min，棄去上清液，將離心管置37℃水浴中，在60s-90s間緩慢勻速滴加37℃預(yù)熱的PEG 1450 1mL，加畢在37℃水浴中靜置90s，再加入37℃預(yù)熱的無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液終止融合作用，800r/min離心5min，棄去上清液，細(xì)胞沉淀用37℃預(yù)熱的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌后，用含20％胎牛血清的HAT選擇培養(yǎng)液重懸，加入到含有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔細(xì)胞板中，100μL/孔，置37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

飼養(yǎng)細(xì)胞制備：取10-12周齡以上未免疫的BALB/c小鼠，拉頸處死，流動(dòng)清水沖洗，浸泡于75％酒精中5-10min進(jìn)行消毒，將消毒后的小鼠置超凈工作臺(tái)上，剪開腹部皮膚，使腹膜暴露出來(lái)，用鑷子提起腹膜，將37℃預(yù)熱的培養(yǎng)液約5mL注射到小鼠腹腔內(nèi)，小心按摩小鼠腹部約3min，抽出，重復(fù)操作幾次，抽出液置10mL離心管內(nèi)，1500r/min離心，棄去上清液，細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液重懸，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整至細(xì)胞數(shù)為2-3×10⁵個(gè)/mL，按100μL/孔加入96孔細(xì)胞板中，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，次日觀察無(wú)污染即可使用。

觀察發(fā)現(xiàn)，免疫小鼠脾細(xì)胞呈圓形，較小，與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞的形態(tài)相似；小鼠腹腔飼養(yǎng)細(xì)胞在過(guò)夜培養(yǎng)后呈梭形，梭形細(xì)胞數(shù)量越多說(shuō)明飼養(yǎng)細(xì)胞的狀態(tài)越好，為融合細(xì)胞生長(zhǎng)提供的條件也越好(圖1)。

四、雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆

融合后的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)一周后用HAT選擇培養(yǎng)液進(jìn)行半換液，2d后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，采用前述間接ELISA方法進(jìn)行陽(yáng)性孔的篩選。篩選出的陽(yáng)性孔細(xì)胞采用有限稀釋法進(jìn)行3-4次亞克隆，使陽(yáng)性細(xì)胞率達(dá)到100％。將能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。

雜交瘤細(xì)胞融合后第3d可見克隆細(xì)胞集團(tuán)，大部分的培養(yǎng)孔中生長(zhǎng)的克隆細(xì)胞集團(tuán)數(shù)多于2個(gè)，隨著時(shí)間推移，克隆細(xì)胞集團(tuán)數(shù)量繼續(xù)增多(見圖2)。陽(yáng)性孔細(xì)胞經(jīng)過(guò)3次亞克隆以后，最終得到5株能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。

五、雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1的穩(wěn)定性測(cè)定

將5株雜交瘤細(xì)胞株中命名為DHAV-MAb1的雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行連續(xù)的傳代培養(yǎng)，分別取其第1代、第5代和第10代細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，以及凍存1個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞的培養(yǎng)上清液，以SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對(duì)照，采用前述間接ELISA方法對(duì)該雜交瘤細(xì)胞株進(jìn)行抗體分泌穩(wěn)定性檢測(cè)。

結(jié)果見表1，第1代、第5代、第10代細(xì)胞培養(yǎng)上清液和凍存1個(gè)月后復(fù)蘇細(xì)胞培養(yǎng)上清液的OD₄₅₀-OD₆₃₀值無(wú)明顯差異，表明雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1具有穩(wěn)定分泌單克隆抗體的能力。

表1 雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1傳代和凍存后穩(wěn)定性測(cè)定

雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1于2017年1月18日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱CCTCC，地址：湖北省武漢市武昌區(qū)八一路299號(hào)武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為CCTCC NO：C201701。

實(shí)施例2、單克隆抗體的制備與鑒定

一、單克隆抗體的大量制備與純化

取10-12周齡的BALB/c雌性小鼠，預(yù)先用弗氏不完全佐劑致敏，0.5mL/只，5d后腹腔注入雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1 0.5mL/只(2.0×10⁶個(gè)/mL)，7-10d后，當(dāng)小鼠腹部顯著增大時(shí)，抽取小鼠腹水，37℃放置2h，4℃過(guò)夜，次日以3000r/min離心15min，收集上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｃ扛?d可以抽取腹水1次，可以反復(fù)抽取小鼠腹水多次。將保存的腹水先用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，再用rProtein A/G Beads過(guò)柱純化，得到純化腹水。

取純化腹水，采用SDS-PAGE檢測(cè)單克隆抗體的純化效果，結(jié)果見圖3。

二、單克隆抗體的亞型鑒定

將雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1培養(yǎng)上清液和純化腹水作倍比稀釋，按照鼠單克隆抗體Ig類亞類鑒定酶標(biāo)二抗套裝說(shuō)明書，采用前述間接ELISA方法進(jìn)行單克隆抗體Ig亞型的鑒定，OD₄₅₀-OD₆₃₀值最高孔所對(duì)應(yīng)的酶標(biāo)二抗為雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體亞型。

結(jié)果見表2，雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體的亞型屬于Ig G1。

表2 單克隆抗體的亞型鑒定結(jié)果

三、單克隆抗體的效價(jià)測(cè)定

將雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1培養(yǎng)上清液和純化腹水作倍比稀釋，采用前述間接ELISA方法測(cè)定單克隆抗體的效價(jià)，用SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和陰性腹水平行稀釋作為陰性對(duì)照。

結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1培養(yǎng)上清液的單克隆抗體效價(jià)為1:1280；純化腹水的單克隆抗體效價(jià)為1:819200。

四、單克隆抗體的特異性鑒定

在37℃、180r/min恒定條件下，對(duì)常見鴨致病菌(鴨疫里默氏桿菌、鴨沙門氏菌、鴨大腸桿菌)進(jìn)行增殖培養(yǎng)24h后，超聲破碎，離心，取各菌株培養(yǎng)上清液包被酶標(biāo)板；將鴨致病病毒(1型鴨甲型肝炎病毒、3型鴨甲型肝炎病毒、鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒)的病毒液包被酶標(biāo)板；以PBS為空白對(duì)照；以雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1培養(yǎng)上清液為一抗，同時(shí)以SP2/0小鼠骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液為陰性對(duì)照，采用前述間接ELISA方法進(jìn)行單克隆抗體特異性鑒定。

結(jié)果見表3，雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體不與鴨病毒性腸炎病毒、鴨乙肝病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌、鴨沙門氏菌發(fā)生特異性反應(yīng)，但與3型鴨甲型肝炎病毒發(fā)生交叉反應(yīng)，說(shuō)明雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體可以同時(shí)識(shí)別1型和3型鴨甲型肝炎病毒并具有較好的特異性。

表3 單克隆抗體的特異性鑒定結(jié)果

五、單克隆抗體的親和常數(shù)測(cè)定

將雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1培養(yǎng)上清液作倍比稀釋，100μL/孔，37℃孵育2h，采用前述間接ELISA方法測(cè)定OD₄₅₀-OD₆₃₀值，繪制抗體稀釋倍數(shù)與OD₄₅₀-OD₆₃₀值的關(guān)系曲線，根據(jù)曲線中50％OD_450-630nm值所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)，按公式Kaff(L/mol)≈150000×A/[Ag]計(jì)算親和常數(shù)(Kaff)，式中A為50％OD₄₅₀-OD₆₃₀值所對(duì)應(yīng)的抗體稀釋倍數(shù)，[Ag]為抗體濃度。

結(jié)果見圖4，雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1分泌的單克隆抗體的親和常數(shù)為2.4×10¹⁰L/mol，具有較好的抗原結(jié)合能力。

實(shí)施例3、膠體金試紙條的制備與性能評(píng)價(jià)

一、金標(biāo)單克隆抗體的制備和純化

1、單克隆抗體的處理

將純化的雜交瘤細(xì)胞株DHAV-MAb1誘生腹水置透析袋中，在0.01mol/L、pH7.4的PBS中4℃透析過(guò)夜，每隔4h更換透析液，然后4℃、10000r/min離心30min，取上清液，測(cè)定蛋白含量，即得同時(shí)識(shí)別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體，分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、金標(biāo)單克隆抗體的制備

取20nm膠體金溶液1mL，加入0.1mol/L K₂CO₃溶液12μL，攪拌混勻，加入同時(shí)識(shí)別1型和3型鴨甲型肝炎病毒的單克隆抗體34μg，攪拌混勻，靜置30min，再加入0.1g/mL BSA溶液至終濃度為0.01g/mL，攪拌混勻，靜置15min，得到金標(biāo)單克隆抗體溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3、金標(biāo)單克隆抗體的純化

取1mL金標(biāo)單克隆抗體溶液，于4℃、2000r/min離心15min，收集上清液，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用金標(biāo)抗體重懸液(由1g BSA、10g蔗糖、5g海藻糖、0.05g酪蛋白、0.1g疊氮化鈉和1g PEG 20000用0.01mol/L、pH8.0的PBS 100mL溶解制得)稀釋至原體積，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀重復(fù)上述操作1-2次，最后用金標(biāo)抗體重懸液稀釋，4℃密封保存。

取純化的金標(biāo)單克隆抗體，在波長(zhǎng)400-660nm范圍內(nèi)掃描紫外光譜。結(jié)果見圖5，與未標(biāo)記的膠體金顆粒相比，金標(biāo)單克隆抗體的最大吸收峰向右移動(dòng)了4nm，說(shuō)明單克隆抗體已經(jīng)成功被膠體金標(biāo)記。

二、膠體金試紙條的制備

制備采用雙抗體夾心法同時(shí)檢測(cè)1型和3型鴨甲型肝炎病毒的膠體金試紙條。試紙條由底板、硝酸纖維素(NC)膜、樣品墊、金標(biāo)墊和吸收墊5個(gè)部分組成，其中NC膜上的質(zhì)控線(C線)包被羊抗鼠IgG，檢測(cè)線(T線)包被兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗；金標(biāo)墊包被金標(biāo)單克隆抗體(見圖6)。當(dāng)待測(cè)樣品中含有1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒時(shí)，在層析過(guò)程中，病毒抗原先與金標(biāo)墊上的金標(biāo)單克隆抗體特異性結(jié)合，再與檢測(cè)線上的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗特異性結(jié)合，從而使檢測(cè)線呈現(xiàn)紅色條帶，而未與病毒抗原結(jié)合的金標(biāo)單克隆抗體與質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG特異性結(jié)合，從而使質(zhì)控線也呈現(xiàn)紅色條帶；當(dāng)待測(cè)樣品中不含有或含有低于最低檢測(cè)量的1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒時(shí)，則檢測(cè)線不呈現(xiàn)紅色條帶，僅質(zhì)控線呈現(xiàn)紅色條帶。

膠體金試紙條的具體制備方法如下：將羊抗鼠IgG和純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗分別用0.01mol/L、pH7.4的PBS稀釋后，分別包被于NC膜上形成質(zhì)控線和檢測(cè)線，37℃干燥過(guò)夜，再將NC膜用0.01g/mL BSA溶液于37℃封閉，干燥，4℃密封保存?zhèn)溆?；將純化的金?biāo)單克隆抗體溶液滴加于玻璃纖維素膜上，37℃干燥過(guò)夜，得到金標(biāo)墊；將已包被并封閉處理的NC膜、金標(biāo)墊、樣品墊、吸收墊干燥后依次粘在底板上，即制得膠體金試紙條。

1、純化的兔抗1型鴨甲型肝炎多抗的包被濃度優(yōu)化

將兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗先用辛酸-硫酸銨沉淀法進(jìn)行粗提，再用rProtein A/GBeads過(guò)柱純化，得到純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗。將純化的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗用0.01mol/L、pH7.4的PBS稀釋至濃度分別為0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6mg/mL，包被于NC膜上形成檢測(cè)線，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達(dá)到試紙條敏感度要求的兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的最佳包被濃度。結(jié)果見圖7，當(dāng)兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的包被濃度為0.8mg/mL時(shí)，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗(yàn)結(jié)果，因此兔抗1型鴨甲型肝炎病毒多抗的最佳包被濃度為1.0mg/mL。

2、羊抗鼠IgG的包被濃度優(yōu)化

將羊抗鼠IgG用0.01mol/L、pH7.4的PBS稀釋至濃度分別為0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0mg/mL，包被于NC膜上形成質(zhì)控線，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達(dá)到試紙條敏感度要求的羊抗鼠IgG的最佳包被濃度。結(jié)果見圖8，當(dāng)羊抗鼠IgG的包被濃度為0.6mg/mL時(shí)，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗(yàn)結(jié)果，因此羊抗鼠IgG的最佳包被濃度為1.0mg/mL。

3、金標(biāo)單克隆抗體的包被濃度優(yōu)化

取1mL金標(biāo)單克隆抗體溶液，于4℃、2000r/min離心15min，收集上清液，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀用金標(biāo)抗體重懸液稀釋至原體積，于4℃、9000r/min離心20min，棄去上清液，沉淀重復(fù)上述操作1-2次，最后分別用100、150、200、250、300、350、400、450μL金標(biāo)抗體重懸液稀釋，得到純化的金標(biāo)單克隆抗體溶液。將不同濃度的純化的金標(biāo)單克隆抗體溶液分別滴加在相同大小的玻璃纖維素膜上形成金標(biāo)墊，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定達(dá)到試紙條敏感度要求的金標(biāo)單克隆抗體的最佳包被濃度。結(jié)果見圖9，當(dāng)1mL金標(biāo)單克隆抗體溶液離心后的沉淀用450μL的金標(biāo)抗體重懸液稀釋時(shí)，試紙條的顯色顏色較淺，不易觀察試驗(yàn)結(jié)果，因此金標(biāo)單克隆抗體的最佳包被濃度為1mL金標(biāo)單克隆抗體溶液離心后的沉淀用400μL金標(biāo)抗體重懸液稀釋。

4、NC膜的優(yōu)化

分別采用Sartorius CN140、Sartorius CN95、vivid 170和Millipore 135這4種型號(hào)的NC膜，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況。結(jié)果見表4，Sartorius CN140和Millipore 135顯色均較快，在10min內(nèi)均可顯色，但是Sartorius CN140顯色后背景不干凈，有層析不完全的現(xiàn)象，因此優(yōu)選Millipore 135(系孔徑為8μm、層析速度為120-150s/4cm的NC膜)。

表4 NC膜的優(yōu)化結(jié)果

5、玻璃纖維素膜的優(yōu)化

分別采用CB 0801、SB 06、VL 78、MA0280、GL 0194這5種型號(hào)的玻璃纖維素膜制備金標(biāo)墊，再在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察不同玻璃纖維素膜上金標(biāo)單克隆抗體的釋放情況。結(jié)果顯示，CB0801、SB06、VL78和GL0194上的金標(biāo)單克隆抗體釋放不完全，有較多金標(biāo)單克隆抗體殘留在膜上，且CB0801上的金標(biāo)單克隆抗體釋放速度極慢，而MA0208上的金標(biāo)單克隆抗體釋放完全，因此優(yōu)選MA0208(系厚度為0.40±0.05mm、克重為68±10g/m²的聚酯纖維素膜)。

6、樣品墊的優(yōu)化

分別采用GL-b03和GL-b04兩個(gè)貨號(hào)的樣品墊，在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，將陰性、陽(yáng)性鴨胚尿囊液滴加在樣品墊上，觀察兩種樣品墊的釋放情況。結(jié)果顯示，樣品在GL-03上流動(dòng)速度較慢，不利于樣品與金標(biāo)單克隆抗體的結(jié)合，因此優(yōu)選GL-04(系厚度為0.78±0.05mm、克重為92±10g/m²的玻璃纖維素膜)。

7、NC膜封閉時(shí)間的優(yōu)化

為了降低NC膜的非特異性吸附，在NC膜完成包被處理并干燥后，用0.01g/mL BSA溶液于37℃分別封閉0、30、60、120min，干燥，然后在其他條件不變的情況下制得膠體金試紙條，觀察試紙條的顯色情況，確定NC膜的最佳封閉時(shí)間。結(jié)果顯示，封閉0min和30min的試紙條拖帶比較嚴(yán)重，而封閉60min和120min的試紙條顯色效果均較好，二者無(wú)明顯差異，因此NC膜的最佳封閉時(shí)間為60min。

三、膠體金試紙條的性能評(píng)價(jià)

1、膠體金試紙條的檢測(cè)方法及結(jié)果判定

取100μL樣品滴加到樣品墊上，5-10min后觀察顯色結(jié)果。如果試紙條的檢測(cè)線和質(zhì)控線均顯示出清晰的紅色條帶，則判定檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，樣品中1型和/或3型鴨甲型肝炎病毒的含量越高，檢測(cè)線顯色就越深；如果試紙條只有質(zhì)控線顯示出紅色條帶，則判定檢測(cè)結(jié)果為陰性；如果試紙條的質(zhì)控線未顯示出紅色條帶，則判定本次檢測(cè)失敗，需重新進(jìn)行檢測(cè)。

2、鴨胚尿囊液或菌體培養(yǎng)液的裂解處理

向鴨胚尿囊液或菌體培養(yǎng)液樣品中加入等體積的裂解液(0.01mol/L、pH7.4的PBS，含2％Triton X-100)，作用5min，劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min，收集上清液用于檢測(cè)。

3、膠體金試紙條的靈敏度試驗(yàn)

將1型或3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液經(jīng)裂解處理后，用BCA法測(cè)定病毒蛋白的濃度，按照1:1、1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64和1:128倍比稀釋后，用膠體金試紙條按前述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察顯色結(jié)果。

1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液的檢測(cè)結(jié)果見圖10，經(jīng)裂解處理后測(cè)得的病毒蛋白濃度為0.6mg/mL，按照1:64稀釋時(shí)顯色較淺，按照1:128稀釋時(shí)只有質(zhì)控線顯色，因此，膠體金試紙條對(duì)1型鴨甲型肝炎病毒的最低檢出量為0.9μg。3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液的檢測(cè)結(jié)果見圖11，經(jīng)裂解處理后測(cè)得的病毒蛋白濃度為0.3mg/mL，按照1:16稀釋時(shí)顯色較淺，按照1:32稀釋時(shí)只有質(zhì)控線顯色，因此，膠體金試紙條對(duì)3型鴨甲型肝炎病毒的最低檢出量為1.8μg。上述結(jié)果表明，本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的檢測(cè)靈敏度。

4、膠體金試紙條的特異性試驗(yàn)

用膠體金試紙條按前述檢測(cè)方法分別檢測(cè)經(jīng)裂解處理的正常鴨胚尿囊液、1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、鴨病毒性腸炎病毒感染鴨胚尿囊液、鴨坦布蘇病毒感染鴨胚尿囊液、小鵝瘟病毒感染鴨胚尿囊液、鴨疫里默氏桿菌的菌體培養(yǎng)液、鴨大腸桿菌的菌體培養(yǎng)液和鴨沙門氏菌的菌體培養(yǎng)液，觀察顯色結(jié)果。

1型或3型鴨甲型肝炎病毒的檢測(cè)結(jié)果見圖12，膠體金試紙條對(duì)4株1型鴨甲型肝炎病毒(BZB株、CD1231株、DY0903株和X株)和6株3型鴨甲型肝炎病毒(CZ160312株、QL株、QL13株、MY02株、YA151006株和SD151227株)的檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性。鴨常見的其它致病病原的檢測(cè)結(jié)果見圖13，膠體金試紙條對(duì)正常鴨胚尿囊液、鴨病毒性腸炎病毒、鴨坦布蘇病毒、小鵝瘟病毒、鴨疫里默氏桿菌、鴨大腸桿菌和鴨沙門氏菌的檢測(cè)結(jié)果均呈陰性。上述結(jié)果表明，本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的檢測(cè)特異性。

5、膠體金試紙條的重復(fù)性試驗(yàn)

用3個(gè)不同批次的膠體金試紙條，按前述檢測(cè)方法分別同時(shí)檢測(cè)陽(yáng)性鴨胚尿囊液(1型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液、3型鴨甲型肝炎病毒感染鴨胚尿囊液)及陰性鴨胚尿囊液，每個(gè)批次重復(fù)檢測(cè)3次，觀察顯色結(jié)果。

結(jié)果見圖14，3個(gè)不同批次膠體金試紙條各重復(fù)3次的檢測(cè)結(jié)果之間無(wú)明顯差異，表明本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的批間和批內(nèi)檢測(cè)重復(fù)性。

6、膠體金試紙條的穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將膠體金試紙條密封保存于4℃、室溫和37℃，每隔一個(gè)月分別用鴨甲型肝炎病毒陰性鴨胚尿囊液和1型鴨甲型肝炎病毒陽(yáng)性鴨胚尿囊液按前述檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)，觀察顯色結(jié)果。

結(jié)果見圖15，膠體金試紙條在4℃、室溫和37℃分別保存1、2、3個(gè)月后的陰性、陽(yáng)性檢測(cè)效果均較好，檢測(cè)結(jié)果間無(wú)明顯差異，表明本發(fā)明制備的膠體金試紙條具有良好的穩(wěn)定性，在4-37℃至少可以保存3個(gè)月。

7、臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的162份樣品，無(wú)菌采集鴨病料后，剪碎，放入盛有約500μL生理鹽水的滅菌EP管中，反復(fù)凍融3次，劇烈振蕩1-3min，加入等體積的裂解液(0.01mol/L、pH7.4的PBS，含2％Triton X-100)，作用5min，劇烈振蕩，4℃、8000r/min離心5min，收集上清液，分別用膠體金試紙條與RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

結(jié)果見表5，在RT-PCR中檢測(cè)出的115個(gè)陽(yáng)性樣品中，膠體金試紙條檢測(cè)出111個(gè)陽(yáng)性；在RT-PCR檢測(cè)出的47個(gè)陰性樣品中，膠體金試紙條檢測(cè)出1個(gè)陽(yáng)性，46個(gè)陰性；兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性符合率為96.5％(111/115)，陰性符合率為97.9％(46/47)。

表5 膠體金試紙條對(duì)臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

最后說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明內(nèi)容的限制。盡管通過(guò)上述實(shí)施例已經(jīng)對(duì)本發(fā)明做了較為詳細(xì)的例舉，但本領(lǐng)域技術(shù)人員仍然可以根據(jù)發(fā)明內(nèi)容部分和實(shí)施例部分所描述的技術(shù)內(nèi)容，在形式上和細(xì)節(jié)上對(duì)其作出各種各樣的改變，而不偏離所附權(quán)利要求書所限定的本發(fā)明的精神和范圍。