本發(fā)明涉及一種保護(hù)與修復(fù)線粒體(粒線體)及促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，特別是一種利用余甘子(Emblica Officinalis)萃取物保護(hù)與修復(fù)線粒體及促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法。

背景技術(shù)：

線粒體(Mitochondria)是細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷(ATP)的主要場所。由于三磷酸腺苷為細(xì)胞活動(dòng)的能量來源，所以線粒體又有“細(xì)胞能量工廠”之稱。除了為細(xì)胞提供能量外，線粒體還參與細(xì)胞分化、細(xì)胞信息傳遞和細(xì)胞凋亡等過程，并擁有調(diào)控細(xì)胞生長周期的能力。

然而，線粒體在進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的部份副產(chǎn)物對(duì)于線粒體的內(nèi)膜是有害的。長期累積下來，嚴(yán)重受損的線粒體內(nèi)膜將觸發(fā)線粒體崩解，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡。因此，如何修補(bǔ)與保護(hù)線粒體以減緩線粒體崩解所觸發(fā)的細(xì)胞凋亡的速度已成為一個(gè)重要的課題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種保護(hù)與修復(fù)線粒體及促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，使其可以利用余甘子(Emblica Officinalis)萃取物保護(hù)與修復(fù)線粒體及促進(jìn)干細(xì)胞增生，借此延緩線粒體崩解所觸發(fā)細(xì)胞凋亡的速度。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種保護(hù)與修復(fù)線粒體的方法，包含提供一余甘子(Emblica Officinalis)萃取物予一細(xì)胞的步驟，用以提高該細(xì)胞內(nèi)的多個(gè)線粒體進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)與三磷酸線苷(ATP)合成的能力。

其中，該余甘子萃取物的濃度為每毫升20至50微克(μg/ml)。

其中，提供該余甘子萃取物予該細(xì)胞的步驟包含食用該余甘子萃取物。

其中，食用的該余甘子萃取物的有效劑量為216毫克(mg)至540毫克。

其中，該余甘子萃取物提高該線粒體的預(yù)存耗氧能力(Spare Respiratory Capacity)。

其中，該余甘子萃取物提高該線粒體進(jìn)行該氧化磷酸化反應(yīng)的基礎(chǔ)耗氧量。

其中，該余甘子萃取物提高該線粒體進(jìn)行該氧化磷酸化反應(yīng)的基礎(chǔ)耗氧量中使用于合成三磷酸線苷的媒合效率(Coupling Efficiency)。

其中，該余甘子萃取物降低該線粒體的氫離子泄漏(Proton Leakage)。

其中，該余甘子萃取物提高該線粒體的三磷酸腺苷產(chǎn)量。

本發(fā)明還提供一種促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，包含提供一余甘子萃取物予一干細(xì)胞的步驟，用以增加該干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂的次數(shù)。

其中，該余甘子萃取物的濃度為每毫升50至1200微克(μg/ml)。

其中，提供該余甘子萃取物予該干細(xì)胞的步驟包含食用該余甘子萃取物。

其中，食用的該余甘子萃取物的有效劑量為540毫克(mg)至12960毫克。

根據(jù)上述本發(fā)明所公開的保護(hù)與修復(fù)線粒體及促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，提供余甘子萃取物予細(xì)胞可保護(hù)與修復(fù)線粒體的內(nèi)膜以延緩線粒體發(fā)生崩解的時(shí)間，提供余甘子萃取物予干細(xì)胞可增加干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂次數(shù)。如此一來，可減緩線粒體崩解觸發(fā)細(xì)胞凋亡的速度以及提供更多的具有高分化潛能的干細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞分化后取代受損或死去的細(xì)胞。

以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，但不作為對(duì)本發(fā)明的限定。

附圖說明

圖1為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。

圖2為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的基礎(chǔ)耗氧量示意圖。

圖3為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的克服自由基泄漏的耗氧量示意圖。

圖4為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的最大耗氧能力示意圖。

圖5為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的預(yù) 存耗氧能力示意圖。

圖6為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的線粒體的三磷酸線苷媒合效率示意圖。

圖7為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五與控制組的非線粒體耗氧量示意圖。

圖8為實(shí)施例三至實(shí)施例十與比較例六至比較例七的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度比示意圖。

具體實(shí)施方式

以下在實(shí)施方式中詳細(xì)敘述本發(fā)明的詳細(xì)特征以及優(yōu)點(diǎn)，其內(nèi)容足以使本領(lǐng)域技術(shù)人員了解本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容并據(jù)以實(shí)施，且根據(jù)本說明書所公開的內(nèi)容、權(quán)利要求及圖式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可輕易地理解本發(fā)明相關(guān)的目的及優(yōu)點(diǎn)。以下的實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明的觀點(diǎn)，但非以任何觀點(diǎn)限制本發(fā)明的范疇。

余甘子(Phyllanthus Emblica或Emblica Officinale)，又稱余柚子、油柑、庵摩勒(Amalaka)、馬六甲樹(Pokok Melaka)、印度醋栗(Indian Gooseberry)，屬于大戟科余甘子屬(Emblica)的落葉亞喬木，分布于自印度至馬來西亞地區(qū)及中國南部，一般認(rèn)為印度為原產(chǎn)地。

本發(fā)明使用的余甘子萃取物的取得方式例如以二氧化碳作為超臨界流體萃取余甘子果實(shí)，或者是以甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、重量百分濃度0.1至5％的氯化鈉水溶液、氯化鉀水溶液、氯化鈣水溶液、氯化鎂水溶液或重量百分濃度0.1至5％的氯化鈉乙醇溶液、氯化鉀乙醇溶液、氯化鈣乙醇溶液、氯化鎂乙醇溶液作為溶劑萃取余甘子果實(shí)而得到一初萃液。接著，將初萃液過濾純化后得到本發(fā)明所使用的余甘子萃取物。

當(dāng)提供濃度為每毫升20至50微克(μg/ml)的余甘子萃取物予細(xì)胞，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的余甘子萃取物可保護(hù)與修復(fù)線粒體的內(nèi)膜。如此一來，于線粒體內(nèi)膜進(jìn)行的氧化磷酸化反應(yīng)以合成三磷酸線苷的效率得到提升。詳細(xì)來說，經(jīng)余甘子萃取物修復(fù)的線粒體進(jìn)行氧化磷酸化反應(yīng)合成的三磷酸線苷數(shù)量提高，線粒體的基礎(chǔ)耗氧量提高，線粒體內(nèi)膜的氫離子泄漏量下降，粒線體的最大耗氧能力提高，線粒體的預(yù)存耗氧能力提高，線粒體的三磷酸線苷媒合效率提高。

提供余甘子萃取物予細(xì)胞的方法例如為以食用的方式由口攝取余甘子萃取物。以食用的方式提供余甘子萃取物予細(xì)胞時(shí)，余甘子萃取物的有效劑量為216毫克(mg)至540毫克。此處的有效劑量根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的有效劑量與人體公斤數(shù)的換算公式進(jìn)行換算得到。換算公式如下：人體有效劑量＝細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的有效劑量×小鼠體重×折算系數(shù)×人體公斤數(shù)。折算系數(shù)由動(dòng)物與人體的每公斤體重劑量折算系數(shù)表查表得到。當(dāng)小鼠體重為20克以及人體公斤數(shù)為60公斤時(shí)，折算系數(shù)為9.01。

再者，隨著線粒體的氧化磷酸化反應(yīng)合成三磷酸線苷數(shù)量提升，可供細(xì)胞生長與分裂使用的能量也跟著提升，有利于細(xì)胞進(jìn)行增生。因此，提供濃度為每毫升50至1200微克(μg/ml)的余甘子萃取物予干細(xì)胞后，干細(xì)胞的增生速度得到提升。其中，當(dāng)提供濃度為每毫升50至800微克(μg/ml)的余甘子萃取物予干細(xì)胞后，干細(xì)胞的增生速度提升效果更為顯著。

提供余甘子萃取物予干細(xì)胞的方法例如為以食用的方式由口攝取余甘子萃取物。以食用的方式提供余甘子萃取物予干細(xì)胞時(shí)，余甘子萃取物的有效劑量為540毫克(mg)至12960毫克。當(dāng)余甘子萃取物的有效劑量為540毫克至8640毫克時(shí)，干細(xì)胞的增生速度提升效果更為顯著。

為方便以食用的方式由口攝取余甘子萃取物，余甘子萃取物可制成例如液體狀、固體狀、顆粒狀、粉體狀、糊狀或凝膠狀的余甘子萃取物加工品。余甘子萃取物加工品中可搭配作為添加劑的賦形劑或呈味劑，以提升風(fēng)味與方便食用。

賦形劑例如為小麥淀粉、米淀粉、玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、糊精、環(huán)糊精等淀粉類；結(jié)晶纖維素類；乳糖、葡萄糖、砂糖、還原麥芽糖、飴糖、果寡糖、乳化寡糖等糖類；山梨糖醇、赤藻糖醇、木糖醇、乳糖醇、甘露醇等糖醇類。

呈味劑例如為龍眼萃取物、荔枝萃取物、柚子萃取物等各種果汁萃取物；蘋果汁、橘子汁、檸檬汁等各種果汁；桃子香料、梅子香料、酸奶酪香料等各種香料；乙?；前匪徕洝⒄崽撬?、赤藻糖醇、寡糖類、甘露糖、木糖醇、異構(gòu)化糖類等各種甜味劑；檸檬酸、蘋果酸、酒石酸、葡萄糖酸等各種酸味劑；綠茶、烏龍茶、巴拿巴茶(Banaba tea)、杜仲茶、鐵觀音茶、薏苡茶、七葉膽茶、茭白茶、昆布茶等各種茶成分等。

此外，著色劑、防腐劑、增黏劑、結(jié)合劑、崩解劑、分散劑、穩(wěn)定劑、膠 化劑、抗氧化劑、界面活性劑、防腐劑、pH值調(diào)整劑等符合政府單位規(guī)定的添加物亦可依照政府單位規(guī)定的劑量標(biāo)準(zhǔn)與加工生產(chǎn)的需求添加于余甘子萃取物加工品中。

以下借由本發(fā)明實(shí)施例一至二與比較例一至五說明本發(fā)明所公開的保護(hù)與修復(fù)線粒體的方法，并且進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試以說明本發(fā)明所公開的保護(hù)與修復(fù)線粒體的方法的功效。

實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為第六代(P6)的脂肪間葉干細(xì)胞(ADSC)。實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備方式為于孔盤的每一個(gè)孔中植入8000個(gè)脂肪間葉干細(xì)胞后培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。實(shí)驗(yàn)中，模擬線粒體受損狀況的方式為將細(xì)胞暴露于濃度200mM的H₂O₂中30分鐘，接著再以磷酸緩沖生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞。

于實(shí)驗(yàn)過程中，首先將預(yù)定濃度的余甘子萃取物加入孔中并浸泡24小時(shí)。接著，將濃度為200mM的H₂O₂加入孔中，使細(xì)胞浸泡于濃度為200mM的H₂O₂中30分鐘。接著，以磷酸緩沖生理食鹽水(Phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞。最后，以海馬生物能量測定儀量測孔中細(xì)胞的氧氣消耗量。

海馬生物能量測定儀的測量原理與流程如下。首先，檢測孔中細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧量。接著，加入三磷酸線苷合成酶抑制劑以抑制粒線體產(chǎn)生三磷酸線苷，此時(shí)減少的耗氧量即為合成三磷酸線苷的耗氧量。接著，加入適當(dāng)濃度的抗耦合劑，在不破壞線粒體內(nèi)膜的電子傳遞鏈的情況下，讓粒線體以極限狀況空轉(zhuǎn)以評(píng)估粒線體的最大耗氧能力。最后，加入電子傳遞鏈抑制劑已完全關(guān)閉粒線體的耗氧，借此確認(rèn)量測的背景值，亦即是非線粒體耗氧量。線粒體的基礎(chǔ)耗氧量等于細(xì)胞的基礎(chǔ)耗氧量減去非線粒體耗氧量。線粒體的基礎(chǔ)耗氧量減去合成三磷酸線苷消耗的氧氣量等于克服自由基泄漏的耗氧量。線粒體的最大耗氧能力減去線粒體的基礎(chǔ)耗氧量等于線粒體的預(yù)存耗氧能力。線粒體的三磷酸線苷媒合效率等于合成三磷酸線苷耗氧量除以線粒體的基礎(chǔ)耗氧量。

實(shí)施例一至實(shí)施例二與比較例一至比較例五的余甘子萃取物濃度與實(shí)驗(yàn)量測結(jié)果如表一所示。表一中呈現(xiàn)的實(shí)驗(yàn)量測結(jié)果為已對(duì)細(xì)胞量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化后的實(shí)驗(yàn)量測結(jié)果。

表一

請(qǐng)參照?qǐng)D1至圖8與表一。圖1為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的合成三磷酸線苷的耗氧量示意圖。圖2為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的線粒體的基礎(chǔ)耗氧量示意圖。圖3為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的克服自由基泄漏的耗氧量示意圖。圖4為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的線粒體的最大耗氧能力示意圖。圖5為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的線粒體的預(yù)存耗氧能力示意圖。圖6為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的線粒體的三磷酸線苷媒合效率示意圖。圖7為實(shí)施例一至實(shí)施例二、比較例一至比較例五的非線粒體耗氧量示意圖。

如圖1所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的合成三磷酸線苷的耗氧量高于比較例一至比較例五。如圖2所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體的基礎(chǔ)耗氧量高于比較例一至比較例五。如圖3所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的克服氫離子泄漏的耗氧量低于比較例一至比較例五。如圖4所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體的最大耗氧能力高于比較例一至比較例五。如圖5所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體的預(yù)存耗氧能力高于比較例一至比較例五。如圖6所示，實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體的三磷酸線苷媒合效率高于比較例一至比較例五。如圖7所示，實(shí)施例一、實(shí)施例二與比較例一至比較例五的非線粒體耗氧量無明顯變化，余甘子萃取物主要對(duì)線粒體的耗氧量產(chǎn)生影響，對(duì)細(xì)胞中其它胞器的耗氧量無明顯影響。因此，由圖1至圖7可知實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體增加的基礎(chǔ)耗氧量主要用作合成三磷酸線苷，使得三磷酸線苷的合成量增加，亦即是線粒體的三磷酸線苷媒合效率提高。同時(shí)，實(shí)施例一與實(shí)施例二的線粒體內(nèi)膜的氫離子泄漏量下降，使得線粒體重新將氫離子輸送至膜間隙的所消耗氧氣量減少，代表的是線粒體內(nèi)膜破損的情況受到余甘子萃取物的修復(fù)而改善。

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)測試結(jié)果，以濃度為20μg/ml至50μg/ml的余甘子萃取物處理后的線粒體受到余甘子萃取物的保護(hù)而降低線粒體內(nèi)膜受到氧化劑的破壞。同時(shí)，線粒體內(nèi)膜也受到余甘子萃取物的修復(fù)，使得自膜間隙穿過破損的內(nèi)膜泄漏至基質(zhì)中的氫離子量下降，進(jìn)而使得線粒體重新將氫離子輸送至膜間隙所消耗氧氣量減少。

以下借由本發(fā)明實(shí)施例三至實(shí)施例十與比較例六至比較例七說明本發(fā)明所公開的促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，并且進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測試以說明本發(fā)明所公開的促進(jìn) 干細(xì)胞增生的方法的功效。

實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為脂肪間葉干細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)樣品準(zhǔn)備方式為于孔盤的每一個(gè)孔中植入2000個(gè)脂肪間葉干細(xì)胞后培養(yǎng)24個(gè)小時(shí)。

于實(shí)驗(yàn)過程中，首先將預(yù)定濃度的余甘子萃取物加入孔中并浸泡24小時(shí)。接著，孔中的培養(yǎng)基更換為含有10％Alamar Blue試劑的培養(yǎng)基并培養(yǎng)4小時(shí)。干細(xì)胞中線粒體內(nèi)的酵素(NADH)將原本深藍(lán)色無熒旋光性的Alamar Blue還原成粉紅色高熒旋光性的產(chǎn)物。最后，判讀孔中的熒光強(qiáng)度。

實(shí)施例三至實(shí)施例十與比較例六至比較例七的余甘子萃取物濃度如表二所示。

表二

請(qǐng)參照?qǐng)D8與表二。圖8為實(shí)施例三至實(shí)施例十與比較例六至比較例七的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度比示意圖。如圖8所示，以比較例六的未給予余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度作為基準(zhǔn)，實(shí)施例三浸泡濃度為50μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.20倍。實(shí)施例四浸泡濃度為100μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.22倍。實(shí)施例五浸泡濃度為200μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.27倍。實(shí)施例六浸泡濃度為400μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.28倍。實(shí)施例七浸泡濃度為600μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.28倍。實(shí)施例八浸泡濃 度為800μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.23倍。實(shí)施例九浸泡濃度為1000μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.12倍。實(shí)施例十浸泡濃度為1200μg/ml的余甘子萃取物的干細(xì)胞發(fā)出的熒光強(qiáng)度為比較例六的1.10倍。熒光強(qiáng)度越強(qiáng)代表被干細(xì)胞線粒體內(nèi)的酵素還原成粉紅色高熒旋光性產(chǎn)物的Alamar Blue的數(shù)量越多，代表線粒體的數(shù)量越多進(jìn)而可推得干細(xì)胞的數(shù)量越多。因此，由圖8的熒光強(qiáng)度比可知提供濃度50μg/ml至1200μg/ml的余甘子萃取物予干細(xì)胞可增加干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂的次數(shù)以得到更多的干細(xì)胞，且當(dāng)余甘子萃取物濃度為50μg/ml至800μg/ml時(shí)，可達(dá)到更佳的細(xì)胞增生效果。

根據(jù)上述本發(fā)明所公開的保護(hù)與修復(fù)線粒體的方法，提供余甘子萃取物予細(xì)胞以保護(hù)與修復(fù)線粒體的內(nèi)膜以延緩線粒體發(fā)生崩解的時(shí)間。如此一來，可減緩線粒體崩解觸發(fā)細(xì)胞凋亡的速度。

再者，根據(jù)上述本發(fā)明所公開的促進(jìn)干細(xì)胞增生的方法，提供余甘子萃取物予干細(xì)胞以增加干細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分裂次數(shù)。如此一來，可提供更多的具有高分化潛能的干細(xì)胞，以便進(jìn)行細(xì)胞分化后取代受損或死去的細(xì)胞。

當(dāng)然，本發(fā)明還可有其它多種實(shí)施例，在不背離本發(fā)明精神及其實(shí)質(zhì)的情況下，熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明作出各種相應(yīng)的改變和變形，但這些相應(yīng)的改變和變形都應(yīng)屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍。