本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法。

背景技術(shù)：

荷斯坦奶牛乳汁固體物(蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì))含量為13-16％，而水牛乳汁高達18-23％；水牛奶的乳脂率平均為8.5％，是荷斯坦牛奶的2倍多，通過長期選育，雖然水牛的產(chǎn)奶量有了很大的提高，但是仍舊遠遠低于荷斯坦奶牛，因此，乳腺生物學(xué)及泌乳功能的基礎(chǔ)性研究對提高水牛的產(chǎn)奶量具有十分重要的意義。但是，目前仍舊沒有成熟的商品化水牛乳腺上皮細胞，只能通過原代分離的方法獲得。奶牛的原代乳腺上皮細胞分離的方法有4種，分別為組織塊貼壁法、酶消化法、機械剪切法和乳汁分離法，目前，水牛乳腺上皮細胞已通過組織塊貼壁法、胰酶消化法和機械剪切法成功分離，但是，組織塊貼壁法、胰酶消化法和機械剪切法都需要水牛乳腺組織，而水牛乳腺組織的獲得主要有兩種途徑，一種通過對健康高產(chǎn)奶水牛進行穿刺或手術(shù)，另一種取自屠宰場。前者可以選擇供體水牛，但對水牛有傷害，經(jīng)濟成本高；后者水牛一般為淘汰母牛，其生產(chǎn)性能和生理狀態(tài)都較差，不能排除是否患有乳腺炎，嚴重影響細胞的分離。且此三種分離方法在分離過程中對細胞損傷較大。

目前，利用乳汁分離法分離乳腺上皮細胞的研究，主要還是在奶牛乳汁中進行，對水牛乳汁的乳腺上皮細胞分離未見相關(guān)報道，例如，申請?zhí)枮?01410412690.1的中國專利，公開了從乳汁中分離和培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的方法及專用培養(yǎng)基,該方法主要是對奶牛乳汁進行乳腺上皮細胞進行分離；又例如，《生物技術(shù)通報》2013年第3期第107-113頁，《牛奶中乳腺上皮細胞的分離培養(yǎng)及鑒定》一文中也指出了從奶牛乳汁純化分離和培養(yǎng)乳腺上皮細胞，但是，目前還沒有關(guān)于從水牛乳汁中直接分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的報道，而且，也沒有公開如何培養(yǎng)可以提高水牛乳腺上皮細胞的存活率；水牛乳汁中的固體物比奶牛乳汁中的固體物含量要多，乳脂率更大，乳汁中含有更多的脂肪，乳腺上皮細胞含量少，因此，分離乳腺上皮細胞的難度更大，由于水牛的乳腺上皮細胞在水牛乳汁中含量少，因此，體外培養(yǎng)時如何進行分離、避免細胞氧化損傷，提高細胞活力也成了水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)必須解決的技術(shù)難題。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鑒于上述內(nèi)容，有必要提供一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法，能有效的從水牛乳汁中分離水牛乳腺上皮細胞，同時還能提高乳腺上皮細胞在體外培養(yǎng)時的活力，避免細胞損傷。

為達到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法，所述方法包括如下步驟：

(1)收集水牛乳汁：選取乳汁體細胞數(shù)為2萬/mL-20萬/mL的高產(chǎn)泌乳期的水牛，用體積百分數(shù)為75％(v/v)-90％(v/v)的酒精浸泡紗布，用完全浸濕后的紗布對水牛的乳房進行消毒，消毒時紗布從乳頭向乳房基部擦拭3-5次，棄去前2-3把乳汁，然后將乳汁直接擠入400mL-800mL的無菌玻璃瓶內(nèi)，擰緊瓶蓋，將乳汁保藏后立刻帶回實驗室，得到新鮮水牛乳汁；

(2)分離水牛乳汁：水牛乳汁經(jīng)過第一次、第二次離心分離獲得水牛乳腺上皮細胞；所述第一次離心分離方法為：將步驟(1)的新鮮水牛乳汁與A培養(yǎng)液按體積比為1-2:1混合均勻后進行第一次離心，離心后除去上層半凝固狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余4mL-5mL停止，完成第一次離心分離，得到第一次離心剩余混合物；所述第二次離心分離方法為：將第一次離心剩余混合物與A培養(yǎng)液按體積比為1-2:1的比例重懸后進行第二次離心，離心后除去上層環(huán)狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余0.5mL-1.5mL停止，完成第二次離心分離，得到第二次離心分離剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)和純化：將步驟(2)第二次離心分離剩余混合物接種于含有5ml-8mlB培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，接種后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃-37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，11h-13h后，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，取液體外觀呈粉紅渾濁狀且無蠟樣物質(zhì)的培養(yǎng)皿，將磷酸緩沖鹽溶液加入培養(yǎng)皿中對培養(yǎng)皿內(nèi)的液體進行清洗直至液體由粉紅渾濁狀轉(zhuǎn)為澄清透明；然后再加入4mL的B培養(yǎng)液，然后每兩天更換一次B培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6d時，將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察、并刮除培養(yǎng)皿內(nèi)的非乳腺上皮細胞并去除培養(yǎng)皿內(nèi)的B培養(yǎng)液，再用磷酸緩沖鹽溶液對去B培養(yǎng)液后的液體進行清洗3次-5次，清洗后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃-37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，繼續(xù)觀察，直至細胞的融合度為80％時，再將細胞進行消化傳代或凍存、培養(yǎng)獲得水牛乳腺上皮細胞；

所述A培養(yǎng)液為：含有0.1mg/mL-0.15mg/mL青霉素和0.05mg/mL-0.1mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所述B培養(yǎng)液制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為8-9：1混勻，然后加入1mmol/L-1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L-0.5mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U-150U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U-150U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL-1.5μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL-1.5μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL-10μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL-10μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL-15ng/mL表皮細胞生長因子。

進一步的，所述A培養(yǎng)液為：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；所述B培養(yǎng)液制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9：1混勻，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子。

進一步的，其特征在于，所述B培養(yǎng)液中非必需氨基酸由以下物質(zhì)組成：0.1mmol/L-0.3mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-絲氨酸。

進一步的，所述B培養(yǎng)液中非必需氨基酸由以下物質(zhì)組成：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸。

進一步的，所述B培養(yǎng)液中的抗氧化劑為β-巰基乙醇或中藥抗氧化劑。

進一步的，所述中藥抗氧化劑由同等質(zhì)量份的王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠組成；所述中藥抗氧化劑由以下方法制得：將所述中藥材混合后加入與混合物同等質(zhì)量比的蒸餾水煮沸，然后轉(zhuǎn)文火進行煎煮60min-70min，再進行過濾，取濾液進行濃縮直至生藥含量為0.2g/mL-0.4g/mL，再進行離心，取離心之后的上清液調(diào)節(jié)pH值為7.5，然后再用微孔濾膜進行過濾、除菌、冷卻至2℃-4℃制得中藥抗氧化劑；所述離心條件為：離心轉(zhuǎn)速為2000r/min-3000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為10min-20min。

進一步的，所述步驟(1)中乳汁保藏方法為在37℃下進行恒溫水浴。

進一步的，所述步驟(2)中第一次離心的離心條件為：離心轉(zhuǎn)速為2000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為20min；第二次離心的離心條件為：離心轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心溫度為室溫，離心時間為15min。

本發(fā)明具有如下有益效果：

1、本發(fā)明采用從水牛乳汁中分離水牛乳腺上皮細胞的方法，材料為水牛乳汁，采集方式為人工擠奶，取材方便，經(jīng)濟便捷，本發(fā)明選擇乳汁中細胞數(shù)量在2萬/mL-20萬/mL的奶水牛，確保了乳汁中細胞的數(shù)量，同時減少細胞污染的可能性，其次，本發(fā)明采用乳汁和含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液按1-2：1的比例混勻離心后，減低乳汁中各成分的濃度，使乳脂、乳蛋白更容易被去除，保證將乳脂去除干凈，促進細胞貼壁，而且在收集乳腺上皮細胞的過程中，對離心的乳汁的收集包括了沉淀部分和中層白色渾濁液的少部分最大程度上的收集了細胞，解決了水牛乳汁中，乳腺上皮細胞含量少不易收集的問題；同時，為了減少對水牛乳腺上皮細胞的損害，增加水牛上皮細胞的體外增殖，經(jīng)發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)，添加非必需氨基酸可以增強水牛乳腺上皮細胞的體外增殖，加快水牛乳腺上皮細胞的生長、富集；同時，為了提高乳腺上皮細胞抗氧化酶活性，增強細胞的抗氧化能力，在乳腺上皮細胞培養(yǎng)基中，發(fā)明人還添加了抗氧化劑來保證細胞的生長，達到平衡氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)有效的避免細胞氧化損傷，提高細胞活力。

2、本發(fā)明的非必需氨基酸主要是甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-絲氨酸；其中，甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-絲氨酸能夠調(diào)節(jié)奶牛乳腺上皮細胞的增殖和凋亡，低濃度的甘氨酸對細胞增殖具有促進作用，高濃度的甘氨酸對細胞增殖具有抑制作用能促進細胞的凋亡，發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酰、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-脯氨酸和L-絲氨酸的含量分別為0.1mmol/L-0.3mmol/L時能有效促進乳腺上皮細胞向S期轉(zhuǎn)化，促進細胞分裂。

3、本發(fā)明的抗氧化劑主要是β-巰基乙醇和中藥物質(zhì)；其中，β-巰基乙醇能有效去除氧化代謝中的活性氧，起到抗氧化作用有效提高細胞活性；本發(fā)明的中藥物質(zhì)主要由王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠制得，這幾種中藥混合熬煮后含有豐富的黃酮槲皮素等活性成分能夠促進奶牛乳腺上皮細胞增殖，提高細胞抗氧化水平，上調(diào)奶牛乳腺上皮細胞存活率，提高抗氧化和抗凋亡的能力。

【附圖說明】

圖1是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，接種12h后在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下培養(yǎng)皿內(nèi)液體沉淀的形態(tài)圖；

圖2是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，接種12h后在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下培養(yǎng)皿內(nèi)上清液的形態(tài)圖；

圖3是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，接種12h培養(yǎng)6d后在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下培養(yǎng)皿內(nèi)乳腺上皮的形態(tài)圖；

圖4是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，經(jīng)過消化、傳代后在低密度培養(yǎng)條件下，在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下呈鋪路石樣的形態(tài)圖；

圖5是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，經(jīng)過消化、傳代后在低密度培養(yǎng)條件下，在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下呈短梭形或多角形的形態(tài)圖；

圖6是本發(fā)明實施例中乳腺上皮細胞經(jīng)吉姆薩染色后，處于分裂期的形態(tài)圖；

圖7是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，經(jīng)過消化、傳代后，高密度培養(yǎng)10d后，在放大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下呈圓頂乳頭狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)圖；

圖8是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，經(jīng)過消化、傳代后，在大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下呈圓乳滴狀結(jié)構(gòu)的形態(tài)圖；

圖9是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞分離純化培養(yǎng)的形態(tài)驗證過程，細胞生長緊密時，在大倍數(shù)為10×倒置顯微鏡下呈分層生長的形態(tài)圖；

圖10是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞免疫熒光鑒定圖。

圖11是本發(fā)明實施例水牛乳腺上皮細胞的生長曲線圖。

附圖說明：圖10中，A是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮細胞角蛋白18的熒光表達圖；B是本發(fā)明實施例中水牛乳腺上皮Hoechest 33342染核的熒光表達圖。

【具體實施方式】

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實施方式做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節(jié)以便于充分理解本發(fā)明。但是本發(fā)明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在不違背本發(fā)明內(nèi)涵的情況下做類似改進，因此本發(fā)明不受下面公開的具體實施的限制。

實施例1：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9：1混勻，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為β-巰基乙醇。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法包括以下步驟：

(1)收集水牛乳汁：選取乳汁體細胞數(shù)為2萬/mL的高產(chǎn)泌乳期的水牛，用體積百分數(shù)為75％(v/v)的酒精浸泡紗布，用完全浸濕后的紗布對水牛的乳房進行消毒，消毒時紗布從乳頭向乳房基部擦拭3次，棄去前2把乳汁，然后將乳汁直接擠入500mL的無菌玻璃瓶內(nèi)，擰緊瓶蓋，將乳汁在37℃下進行恒溫水浴保藏后立刻帶回實驗室，得到新鮮水牛乳汁；

(2)分離水牛乳汁：水牛乳汁經(jīng)過第一次、第二次離心分離獲得水牛乳腺上皮細胞；其中，第一次離心分離方法為：將步驟(1)的新鮮水牛乳汁與A培養(yǎng)液按體積比為2:1混合均勻后在離心轉(zhuǎn)速為2000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為20min的條件下進行第一次離心，離心后除去上層半凝固狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余5mL停止，完成第一次離心分離，得到第一次離心剩余混合物；其中，第二次離心分離方法為：將第一次離心剩余混合物與A培養(yǎng)液按體積比為2:1的比例重懸后在離心轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心溫度為室溫，離心時間為15min的條件下進行第二次離心，離心后除去上層環(huán)狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余1mL停止，完成第二次離心分離，得到第二次離心分離剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)和純化：將步驟(2)第二次離心分離剩余混合物接種于含有5mlB培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，接種后將培養(yǎng)皿放在溫度為37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，12h后，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，取液體外觀呈粉紅渾濁狀且無蠟樣物質(zhì)的培養(yǎng)皿，將磷酸緩沖鹽溶液加入培養(yǎng)皿中對培養(yǎng)皿內(nèi)的液體進行清洗直至液體由粉紅渾濁狀轉(zhuǎn)為澄清透明；然后再加入4mL的B培養(yǎng)液，然后每兩天更換一次B培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6d時，將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察、并刮除培養(yǎng)皿內(nèi)的非乳腺上皮細胞并去除培養(yǎng)皿內(nèi)的B培養(yǎng)液，再用磷酸緩沖鹽溶液對去B培養(yǎng)液后的液體進行清洗3次，清洗后將培養(yǎng)皿放在溫度為37℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，繼續(xù)觀察，直至細胞的融合度為80％時，再將細胞進行消化傳代或凍存,培養(yǎng)獲得水牛乳腺上皮細胞。

實施例2：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.15mg/mL青霉素和0.1mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為8：2混勻，然后加入1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.5mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為150U的青霉素溶液、酶活單位最終為150U的鏈霉素溶液、終濃度為1.5μg/mL的氫化可的松、終濃度為1.5μg/mL孕酮、終濃度為10μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為10μg/mL胰島素和終濃度為15ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.3mmol/L的甘氨酸、0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.3mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為β-巰基乙醇。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法包括以下步驟：

(1)收集水牛乳汁：選取乳汁體細胞數(shù)為20萬/mL的高產(chǎn)泌乳期的水牛，用體積百分數(shù)為90％(v/v)的酒精浸泡紗布，用完全浸濕后的紗布對水牛的乳房進行消毒，消毒時紗布從乳頭向乳房基部擦拭5次，棄去前3把乳汁，然后將乳汁直接擠入400mL的無菌玻璃瓶內(nèi)，擰緊瓶蓋，將乳汁在37℃下進行恒溫水浴保藏后立刻帶回實驗室，得到新鮮水牛乳汁；

(2)分離水牛乳汁：水牛乳汁經(jīng)過第一次、第二次離心分離獲得水牛乳腺上皮細胞；其中，第一次離心分離方法為：將步驟(1)的新鮮水牛乳汁與A培養(yǎng)液按體積比為1:1混合均勻后在離心轉(zhuǎn)速為2000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為20min的條件下進行第一次離心，離心后除去上層半凝固狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余4ml停止，完成第一次離心分離，得到第一次離心剩余混合物；其中，第二次離心分離方法為：將第一次離心剩余混合物與A培養(yǎng)液按體積比為1:1的比例重懸后在離心轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心溫度為室溫，離心時間為15min的條件下進行第二次離心，離心后除去上層環(huán)狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余0.5mL停止，完成第二次離心分離，得到第二次離心分離剩余混合物；

(3)水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)和純化：將步驟(2)第二次離心分離剩余混合物接種于含有8mLB培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，接種后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，13h后，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，取液體外觀呈粉紅渾濁狀且無蠟樣物質(zhì)的培養(yǎng)皿，將磷酸緩沖鹽溶液加入培養(yǎng)皿中對培養(yǎng)皿內(nèi)的液體進行清洗直至液體由粉紅渾濁狀轉(zhuǎn)為澄清透明；然后再加入4mL的B培養(yǎng)液，然后每兩天更換一次B培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6d時，將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察、并刮除培養(yǎng)皿內(nèi)的非乳腺上皮細胞并去除培養(yǎng)皿內(nèi)的B培養(yǎng)液，再用磷酸緩沖鹽溶液對去B培養(yǎng)液后的液體進行清洗5次，清洗后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，繼續(xù)觀察，直至細胞的融合度為80％時，再將細胞進行消化傳代或凍存、培養(yǎng)獲得水牛乳腺上皮細胞。

實施例3：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.12mg/mL青霉素和0.08mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為8.5：1.5混勻，然后加入1.2mmol/L的L-谷胺酰胺、0.3mmol/L的非必需氨基酸、0.3mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為120U的青霉素溶液、酶活單位最終為120U的鏈霉素溶液、終濃度為1.3μg/mL的氫化可的松、終濃度為1.3μg/mL孕酮、終濃度為8μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為8μg/mL胰島素和終濃度為12ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.2mmol/L的甘氨酸、0.2mmol/L的L-丙氨酸、0.2mmol/L的L-天冬氨酰、0.2mmol/L的L-天冬氨酸、0.2mmol/L的L-谷氨酸、0.2mmol/L的L-脯氨酸和0.2mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為β-巰基乙醇。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法包括以下步驟：

(1)收集水牛乳汁：選取乳汁體細胞數(shù)為15萬/mL的高產(chǎn)泌乳期的水牛，用體積百分數(shù)為80％(v/v)的酒精浸泡紗布，用完全浸濕后的紗布對水牛的乳房進行消毒，消毒時紗布從乳頭向乳房基部擦拭3-5次，棄去前3把乳汁，然后將乳汁直接擠入800mL的無菌玻璃瓶內(nèi)，擰緊瓶蓋，將乳汁在37℃下進行恒溫水浴保藏后立刻帶回實驗室，得到新鮮水牛乳汁；

(2)分離水牛乳汁：水牛乳汁經(jīng)過第一次、第二次離心分離獲得水牛乳腺上皮細胞；其中，第一次離心分離方法為：將步驟(1)的新鮮水牛乳汁與A培養(yǎng)液按體積比為1.5:1混合均勻后在離心轉(zhuǎn)速為2000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為20min的條件下進行第一次離心，離心后除去上層半凝固狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余4.5mL停止，完成第一次離心分離，得到第一次離心剩余混合物；其中，第二次離心分離方法為：將第一次離心剩余混合物與A培養(yǎng)液按體積比為1.5:1的比例重懸后在離心轉(zhuǎn)速為1500r/min，離心溫度為室溫，離心時間為15min的條件下進行第二次離心，離心后除去上層環(huán)狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體，直至中層白色渾濁液體剩余1.3mL停止，完成第二次離心分離，得到第二次離心分離剩余混合物；(3)水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)和純化：將步驟(2)第二次離心分離剩余混合物接種于含有6mL的B培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，接種后將培養(yǎng)皿放在溫度為36℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，11h后，觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的液體，取液體外觀呈粉紅渾濁狀且無蠟樣物質(zhì)的培養(yǎng)皿，將磷酸緩沖鹽溶液加入培養(yǎng)皿中對培養(yǎng)皿內(nèi)的液體進行清洗直至液體由粉紅渾濁狀轉(zhuǎn)為澄清透明；然后再加入4mL的B培養(yǎng)液，然后每兩天更換一次B培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第6d時，將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察、并刮除培養(yǎng)皿內(nèi)的非乳腺上皮細胞并去除培養(yǎng)皿內(nèi)的B培養(yǎng)液，再用磷酸緩沖鹽溶液對去B培養(yǎng)液后的液體進行清洗4次，清洗后將培養(yǎng)皿放在溫度為36℃，5％CO₂飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng)，繼續(xù)觀察，直至細胞的融合度為80％時，再將細胞進行消化傳代或凍存、培養(yǎng)獲得水牛乳腺上皮細胞。

實施例4：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9：1混勻，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為中藥抗氧化劑；

其中，中藥抗氧化劑由同等質(zhì)量份的王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法為：將所述中藥材混合后加入與混合物同等質(zhì)量比的蒸餾水煮沸，然后轉(zhuǎn)文火進行煎煮60min，再進行過濾，取濾液進行濃縮直至生藥含量為0.2g/mL，然后在離心轉(zhuǎn)速為2000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為10min的條件下進行離心，取離心之后的上清液調(diào)節(jié)pH值為7.5，然后再用微孔濾膜進行過濾、除菌、冷卻至2℃制得。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法與實施例1完全相同。

實施例5：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9：1混勻，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為中藥抗氧化劑；

其中，中藥抗氧化劑由同等質(zhì)量份的王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法為：將所述中藥材混合后加入與混合物同等質(zhì)量比的蒸餾水煮沸，然后轉(zhuǎn)文火進行煎煮70min，再進行過濾，取濾液進行濃縮直至生藥含量為0.4g/mL，然后在離心轉(zhuǎn)速為3000r/min，離心溫度為室溫，離心時間為10min-20min的條件下進行離心，取離心之后的上清液調(diào)節(jié)pH值為7.5，然后再用微孔濾膜進行過濾、除菌、冷卻至4℃制得。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法與實施例1完全相同。

實施例6：

1、實施例的A、B培養(yǎng)液配方：

本實施例所使用的A培養(yǎng)液配方為：含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液；

所使用的B培養(yǎng)液配方和制備方法為：將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9：1混勻，然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子；其中，上述的非必需氨基酸組成配方為：0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸；其中，上述的抗氧化劑為中藥抗氧化劑；

其中，中藥抗氧化劑由同等質(zhì)量份的王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠制得；

制作方法為：將所述中藥材混合后加入與混合物同等質(zhì)量比的蒸餾水煮沸，然后轉(zhuǎn)文火進行煎煮65min，再進行過濾，取濾液進行濃縮直至生藥含量為0.3g/mL，然后在離心轉(zhuǎn)速為2500r/min，離心溫度為室溫，離心時間為12min的條件下進行離心，取離心之后的上清液調(diào)節(jié)pH值為7.5，然后再用微孔濾膜進行過濾、除菌、冷卻至3℃制得。

2、本實施例使用上述A、B培養(yǎng)液從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法與實施例1完全相同。

驗證試驗：

以實施例1做為一個例子，利用顯微鏡對分離純化過程中的上皮細胞進行細胞形態(tài)觀察、利用免疫細胞化學(xué)鑒定對水牛的上皮細胞進行驗證檢驗并繪制細胞的生長曲線：

1、分離純化過程中的上皮細胞進行細胞形態(tài)觀察：

將實施例1第二次離心分離后的細胞在直徑為60mm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)接種培養(yǎng)12h后，選取培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)液為粉紅渾濁液體，無蠟樣物質(zhì)漂浮的培養(yǎng)皿液體，用2mL磷酸緩沖鹽溶液清洗細胞直至液體澄清透明，加入4mL的B培養(yǎng)液，此時乳汁沉淀皿內(nèi)有較多貼壁的細胞，但雜質(zhì)較多(如圖1所示)；而乳汁上清皿內(nèi)貼壁較少，雜質(zhì)也較少(如圖2所示)。此后每兩天更換一次培養(yǎng)液。培養(yǎng)至6d時，在10×倒置顯微鏡下觀察，乳汁上清皿內(nèi)出現(xiàn)有單個細胞增殖而形成的單克隆(如圖3所示)，乳汁沉淀皿內(nèi)出現(xiàn)多個克隆集落，而極少會出現(xiàn)非乳腺上皮細胞，出現(xiàn)時用記號筆圈出。在體式解剖顯微鏡下，用10μL槍頭將圈出的細胞刮除，于10×倒置顯微鏡下觀察確認刮除干凈；棄去培養(yǎng)液，用磷酸緩沖鹽溶液洗3次，確認無非乳腺上皮細胞懸浮細胞，添加4mL B培養(yǎng)液，置于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞長至80％融合時，棄去培養(yǎng)液后加入1mL TrypLE胰蛋白酶混勻，37℃消化10min，吸去培養(yǎng)皿內(nèi)的TrypLE胰蛋白酶，再加入1mL TrypLE胰蛋白酶混勻，37℃消化約20min。細胞傳代后，低密度培養(yǎng)時細胞呈鋪路石樣(如圖4所示)、短梭形或多角形(如圖5所示)，高密度培養(yǎng)10d以后出現(xiàn)圓頂乳頭狀結(jié)構(gòu)(如圖7所示)、有豐富乳滴(如圖8所示)。乳腺上皮細胞經(jīng)吉姆薩染色后，可觀察到多處于分裂期，且細胞為含有3-6個核仁(如圖6所示)。當(dāng)水牛乳腺上皮細胞生長緊密時，出現(xiàn)分層生長(如圖9所示)。

2、水牛乳腺上皮細胞性質(zhì)的免疫細胞化學(xué)鑒定：

水牛乳腺上皮細胞經(jīng)體積百分數(shù)為4％多聚甲醛中固定20min后，溶于含質(zhì)量百分數(shù)為2％牛血清白蛋白磷酸緩沖鹽溶液中，在室溫下培養(yǎng)30min，然后再加入細胞角蛋白18抗體，其中細胞角蛋白18抗體與上述的磷酸緩沖鹽溶液體積比為1:200，混合均勻后在4℃過夜培養(yǎng)，再加入青霉素/鏈霉素雙抗溶液，雙抗溶液與混合液體積比為1:800，混合均勻后在室溫條件下避光孵育60min，然后取出培養(yǎng)液，并用磷酸緩沖鹽溶液洗滌，再用Hoechest 33342對水牛乳腺上皮細胞染核，洗滌后于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照，經(jīng)免疫細胞化學(xué)鑒定表明，所獲得的水牛乳腺上皮細胞表達細胞角蛋白18(圖10)，進而證實該細胞為水牛乳腺上皮細胞。

3、繪制水牛乳腺上皮細胞的生長曲線：將分離純化的水牛乳腺上皮細胞按1×10³接種于24孔板，置于37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)。用細胞計數(shù)儀連續(xù)計數(shù)12天，并以時間為橫坐標，細胞個數(shù)為縱坐標，繪制細胞生長曲線。細胞在前7d內(nèi)生長緩慢；8d至11d細胞較快增殖；11d后細胞數(shù)量變化很小。細胞生長曲線呈“S”形,較符合細胞生長的一般生物學(xué)規(guī)律(圖11)。

綜上所述，使用本發(fā)明的方法能安全、高效的從水牛乳汁中分離水牛乳腺上皮細胞，而且水牛乳腺上皮細胞在體外進行培養(yǎng)時還不會造成細胞損傷。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對本發(fā)明范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準。