1.一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:
(1)收集水牛乳汁:選取乳汁體細胞數(shù)為2萬/mL-20萬/mL的高產(chǎn)泌乳期的水牛,用體積百分數(shù)為75%(v/v)-90%(v/v)的酒精浸泡紗布,用完全浸濕后的紗布對水牛的乳房進行消毒,消毒時紗布從乳頭向乳房基部擦拭3-5次,棄去前2-3把乳汁,然后將乳汁直接擠入400mL-800mL的無菌玻璃瓶內(nèi),擰緊瓶蓋,將乳汁保藏后立刻帶回實驗室,得到新鮮水牛乳汁;
(2)分離水牛乳汁:水牛乳汁經(jīng)過第一次、第二次離心分離獲得水牛乳腺上皮細胞;所述第一次離心分離方法為:將步驟(1)的新鮮水牛乳汁與A培養(yǎng)液按體積比為1-2:1混合均勻后進行第一次離心,離心后除去上層半凝固狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體,直至中層白色渾濁液體剩余4mL-5mL停止,完成第一次離心分離,得到第一次離心剩余混合物;所述第二次離心分離方法為:將第一次離心剩余混合物與A培養(yǎng)液按體積比為1-2:1的比例重懸后進行第二次離心,離心后除去上層環(huán)狀的脂肪層和中層乳白色渾濁液體,直至中層白色渾濁液體剩余0.5mL-1.5mL停止,完成第二次離心分離,得到第二次離心分離剩余混合物;
(3)水牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)和純化:將步驟(2)第二次離心分離剩余混合物接種于含有5mL-8mLB培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,接種后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃-37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng),11h-13h后,觀察培養(yǎng)皿內(nèi)的液體,取液體外觀呈粉紅渾濁狀且無蠟樣物質(zhì)的培養(yǎng)皿,將磷酸緩沖鹽溶液加入培養(yǎng)皿中對培養(yǎng)皿內(nèi)的液體進行清洗直至液體由粉紅渾濁狀轉(zhuǎn)為澄清透明;然后再加入4mL的B培養(yǎng)液,然后每兩天更換一次B培養(yǎng)液,培養(yǎng)至第6d時,將培養(yǎng)皿放在顯微鏡下觀察、并刮除培養(yǎng)皿內(nèi)的非乳腺上皮細胞并去除培養(yǎng)皿內(nèi)的B培養(yǎng)液,再用磷酸緩沖鹽溶液對去B培養(yǎng)液后的液體進行清洗3次-5次,清洗后將培養(yǎng)皿放在溫度為35℃-37℃,5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)進行培養(yǎng),繼續(xù)觀察,直至細胞的融合度為80%時,將細胞進行消化傳代或凍存;
所述A培養(yǎng)液為:含有0.1mg/mL-0.15mg/mL青霉素和0.05mg/mL-0.1mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液;
所述B培養(yǎng)液由以下方法制得:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為8-9:1混勻,然后加入1mmol/L-1.5mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L-0.5mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L-0.5mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U-150U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U-150U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL-1.5μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL-1.5μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL-10μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL-10μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL-15ng/mL表皮細胞生長因子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述A培養(yǎng)液為:含有0.1mg/mL青霉素和0.05mg/mL鏈霉素的磷酸緩沖鹽溶液;所述B培養(yǎng)液制備方法為:將DMEM/DF12培養(yǎng)基和胚胎牛血清按照體積比為9:1混勻,然后加入1mmol/L的L-谷胺酰胺、0.1mmol/L的非必需氨基酸、0.1mmol/L的抗氧化劑、酶活單位最終為100U的青霉素溶液、酶活單位最終為100U的鏈霉素溶液、終濃度為1μg/mL的氫化可的松、終濃度為1μg/mL孕酮、終濃度為5μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白、終濃度為5μg/mL胰島素和終濃度為10ng/mL表皮細胞生長因子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述B培養(yǎng)液中非必需氨基酸由以下物質(zhì)組成:0.1mmol/L-0.3mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L-0.3mmol/L的L-絲氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述B培養(yǎng)液中非必需氨基酸由以下物質(zhì)組成:0.1mmol/L的甘氨酸、0.1mmol/L的L-丙氨酸、0.1mmol/L的L-天冬氨酰、0.1mmol/L的L-天冬氨酸、0.1mmol/L的L-谷氨酸、0.1mmol/L的L-脯氨酸和0.1mmol/L的L-絲氨酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述B培養(yǎng)液中的抗氧化劑為β-巰基乙醇或中藥抗氧化劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述中藥抗氧化劑由同等質(zhì)量份的王不留行、苜蓿、黃芪、丹參、漏蘆、木通、通草、新鮮仙人掌、蒲公英和甲珠組成;所述中藥抗氧化劑由以下方法制得:將所述中藥材混合后加入與混合物同等質(zhì)量比的蒸餾水煮沸,然后轉(zhuǎn)文火進行煎煮60min-70min,再進行過濾,取濾液進行濃縮直至生藥含量為0.2g/mL-0.4g/mL,再進行離心,取離心之后的上清液調(diào)節(jié)pH值為7.5,然后再用微孔濾膜進行過濾、除菌、冷卻至2℃-4℃制得中藥抗氧化劑;所述離心條件為:離心轉(zhuǎn)速為2000r/min-3000r/min,離心溫度為室溫,離心時間為10min-20min。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述步驟(1)中乳汁保藏方法為在37℃下進行恒溫水浴。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種從水牛乳汁中分離培養(yǎng)水牛乳腺上皮細胞的方法,其特征在于,所述步驟(2)中第一次離心的離心條件為:離心轉(zhuǎn)速為2000r/min,離心溫度為室溫,離心時間為20min;第二次離心的離心條件為:離心轉(zhuǎn)速為1500r/min,離心溫度為室溫,離心時間為15min。