本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥，具體涉及DC-CIK(樹突狀細(xì)胞-細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞)細(xì)胞的制備及其在制備治療卵巢癌藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(Cytokine-induced killer,CIK)是將人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)在體外用多種細(xì)胞因子(抗CD3McAb、IL-2、IFN-γ、IL-1α等)共同培養(yǎng)一段時間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞。其中CD3+/CD56+細(xì)胞是CIK細(xì)胞群體中主要的效應(yīng)細(xì)胞，被稱為NK樣T淋巴細(xì)胞，兼具有T淋巴細(xì)胞強大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC(主要組織相容性復(fù)合體)限制性殺瘤優(yōu)點。樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells,DC)是機(jī)體功能最強的專職抗原遞呈細(xì)胞(Antigen presenting cells,APC)，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細(xì)胞，處于啟動、調(diào)控、并維持免疫應(yīng)答的中心環(huán)節(jié)。同時，成熟的DC可以通過II型組織相容性抗原(MHC-II)等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。DC聯(lián)合CIK(DC-CIK)過繼性免疫治療惡性腫瘤是一種新興的免疫治療手段，能有效抑制和殺滅腫瘤細(xì)胞且無明顯不良反應(yīng)，降低腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移風(fēng)險，提高患者的自身免疫 力及生活質(zhì)量，其安全性得到了廣泛認(rèn)可。已經(jīng)明確DC-CIK細(xì)胞抗腫瘤作用有以下幾點：一，CIK細(xì)胞可以通過不同的機(jī)制識別腫瘤細(xì)胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的裂解，起到直接殺傷腫瘤細(xì)胞的作用；二，CIK細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不僅對腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷腫瘤細(xì)胞；三，CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過程中表達(dá)FasL(II型跨膜糖蛋白)通過與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Fas(I型跨膜糖蛋白)結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；四，DC-CIK可以殺傷多種腫瘤細(xì)胞且對于對多重耐藥腫瘤細(xì)胞同樣敏感；五，DC-CIK殺瘤活性不受CsA(環(huán)孢霉素A)和FK506(普樂可復(fù))等免疫抑制劑的影響且對正常骨髓造血前體細(xì)胞毒性很小(約為25％)。在DC-CIK治療手段中，DC就像“雷達(dá)”，能識別抗原，激活免疫應(yīng)答。而CIK就像“導(dǎo)彈”，能通過發(fā)揮自身細(xì)胞毒性，分泌細(xì)胞因子，精確殺傷腫瘤細(xì)胞。因而，DC-CIK產(chǎn)生了一個高效的免疫系統(tǒng)，經(jīng)誘導(dǎo)、增殖、活化后，再回輸?shù)交颊唧w內(nèi)，可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞的生長、增殖，幫助機(jī)體恢復(fù)同腫瘤細(xì)胞作斗爭的能力，最大限度地調(diào)動人體免疫功能，全方位的防止復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，明顯改善患者的生活質(zhì)量，有效延長生存期。

雖然，DC-CIK細(xì)胞治療存在顯著的優(yōu)點，但是，尚無報道DC-CIK細(xì)胞治療手段對腫瘤干細(xì)胞的殺傷作用；其次，異體移植DC-CIK細(xì)胞仍然存在很大的免疫排斥風(fēng)險，因此，制約其臨床應(yīng)用。目前DC-CIK細(xì)胞來源主要是從患者靜脈穿刺途徑獲得，但反復(fù)收集穿刺收集外周 血，對于免疫力低下的病人來說，創(chuàng)傷大且容易造成二次感染。目前，已發(fā)現(xiàn)人卵巢癌干細(xì)胞(Ovarian cancer stem cells,OCSCs)是導(dǎo)致卵巢癌細(xì)胞對化療藥物耐受以及產(chǎn)生卵巢癌易于轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)后不佳的主要原因。然而OCSCs增值侵蝕的深層機(jī)制尚不清楚，也沒有有效的醫(yī)療手段進(jìn)行抑制。本發(fā)明人研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌病人經(jīng)血中含有足量的PBMC(單個核細(xì)胞)，在體外用運用IL-2和IFN-γ誘導(dǎo)后獲得DC-CIK細(xì)胞，對腫瘤干細(xì)胞具有顯著的殺傷作用，因此，宜進(jìn)行研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服上述不足之處，研究設(shè)計從卵巢癌病人經(jīng)血中收集PBMC，進(jìn)一步獲得DC-CIK細(xì)胞，設(shè)計通過殺傷卵巢癌干細(xì)胞的治療藥物。

本發(fā)明提供了一種DC-CIK細(xì)胞的制備方法。

該方法為：從卵巢癌病人經(jīng)血中收集PBMC，在體外運用IL-2和IFN-γ誘導(dǎo)后獲得DC-CIK細(xì)胞。

具體的，該方法包括下列步驟：

(1)從卵巢癌病人經(jīng)血中獲得PBMC細(xì)胞：

收集卵巢癌病人的月經(jīng)倒入內(nèi)含抗凝液0.2ml的無菌離心管，加入等體積的PBS稀釋；吸取稀釋血液，加到PBMC分離液，使稀釋血液疊于分層液上，保持兩者界面清晰；所述稀釋血液與分層液體積比例為2:1，于18℃-20℃，水平離心機(jī)以2000rpm離心20min，離心 后其中的內(nèi)容物分為四層，上層為血漿內(nèi)含血小板，中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，在上、中層液體界面處即為乳白色混濁的PBMC層(單個核細(xì)胞薄層)；吸取PBMC層液體，移入另一離心管中，加入5ml的PBS(磷酸緩沖液，購自碧云天生物技術(shù)研究所)洗滌2次，1500rpm離心10min，吸棄上清，沉淀即為PBMC細(xì)胞；

(2)IL-2和IFN-γ刺激誘導(dǎo)CIK增殖：

A、DC細(xì)胞制備：步驟(1)得到的PBMC細(xì)胞經(jīng)過12小時IL-2100U/ml，和IFN-γ1000U/ml刺激后(每5ml反應(yīng)體系中，PBMC細(xì)胞濃度為1×10⁵/ml，IL-2用量為500U，IFN-γ用量為5000U)，將PBMC細(xì)胞于DMEM+10％胎牛血清+IL-2+IFN-γ的完全培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12小時，(每5ml DMEM+10％胎牛血清培養(yǎng)體系中，PBMC細(xì)胞濃度為1×10⁵/ml，IL-2用量為500U，IFN-γ用量為5000U)即完成細(xì)胞刺激，得到細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD83(eBioscience)單克隆抗體，一并混勻至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；在原有的細(xì)胞懸液中再加入0.4ml PBS(磷酸緩沖液)，流式細(xì)胞儀分選操作(Flow Cytometric，BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)，即可獲得純化的CD83+的DC細(xì)胞，即DC細(xì)胞；(CD83是DC細(xì)胞的標(biāo)志物，CD83+的DC簡稱為DC細(xì)胞)

B、CIK細(xì)胞的制備：用與步驟A相同方法得到細(xì)胞懸液于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩 沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD3抗體和4μl碘化丙啶標(biāo)記的鼠抗人CD56抗體(eBioscience)，一并混勻(至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml)，于4℃避光反應(yīng)30分鐘，將細(xì)胞懸液0.5ml，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選操作(Flow Cytometric，BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)，即可獲得純化的CD3+/CD56+CIK細(xì)胞，即CIK細(xì)胞；(CD3+/CD56+是CIK細(xì)胞的標(biāo)志物，CD3+/CD56+的CIK簡稱為CIK細(xì)胞)

C、將上述步驟A獲得的DC細(xì)胞與步驟B獲得的CIK細(xì)胞以1:1比例混合，即為DC-CIK細(xì)胞。

本發(fā)明的另一目的是提供了DC-CIK細(xì)胞在制備治療卵巢癌干細(xì)胞藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明通過ELISA檢測結(jié)果提示，DC-CIK細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，要比單獨培養(yǎng)CIK細(xì)胞釋放更多的殺傷腫瘤細(xì)胞的因子。并且應(yīng)用檢測OCSCs(卵巢癌腫瘤干細(xì)胞)細(xì)胞增值抑制率來檢測各種組合對該腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性(殺傷效率)。實驗結(jié)果表明，在同一種細(xì)胞濃度比例組合下，DC-CIK細(xì)胞對OCSCs的細(xì)胞毒性最強、殺傷效率最高。證明本發(fā)明DC-CIK細(xì)胞可以用于制備殺傷卵巢癌干細(xì)胞的藥物。

本發(fā)明所述藥物為由DC-CIK細(xì)胞作為活性成分與藥用輔料組成的藥物組合物。

本發(fā)明所述藥物組合物為口服制劑或注射劑。

本發(fā)明提供的DC-CIK細(xì)胞的制備方法有以下顯著優(yōu)點：

(1)卵巢癌病人經(jīng)血中含有足量的PBMC，在體外用運用IL-2和IFN-γ誘導(dǎo)后，獲得的DC-CIK細(xì)胞對卵巢癌病人自體來源的腫瘤干細(xì)胞具有顯著的殺傷作用(細(xì)胞毒性顯著)；

(2)通過本發(fā)明方法制備的DC-CIK細(xì)胞不僅效率不會下降，而且完全無創(chuàng)傷性；

(3)本發(fā)明方法可以方便地以卵巢癌病人經(jīng)血制備獲得DC-CIK細(xì)胞用于殺傷腫瘤干細(xì)胞。

本發(fā)明為治療卵巢癌提供了新的途徑，為臨床治療卵巢癌提供了新的藥物，有較好的應(yīng)用前景，有較大的社會效益。

附圖說明

圖1實施例2.IL-2和IFN-γ刺激誘導(dǎo)CD3+/CD56+CIK增殖。

圖中，黑色柱狀圖為誘導(dǎo)后CIK細(xì)胞數(shù)，無色柱狀圖為未誘導(dǎo)的CIK細(xì)胞數(shù)；橫坐標(biāo)為誘導(dǎo)分組(誘導(dǎo)后組、未誘導(dǎo)組)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)(×10²/ml)。

圖2實施例3.DC-CIK在體外培養(yǎng)中釋放多種腫瘤殺傷因子。

圖中，黑色柱狀圖為誘導(dǎo)后DC-CIK組，灰色柱狀圖為CIK組；橫坐標(biāo)為細(xì)胞因子(從左到右依次為TGF-β、INF-γ、TNF-α、IL-2和IL-10)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞釋放因子濃度(pg/ml)。

圖3實施例4.DC-CIK在體外對OCSCs具有典型的細(xì)胞毒性。

圖中，左上角為1:1細(xì)胞數(shù)混合；右上角為5:1細(xì)胞數(shù)混合；左下角為10:1細(xì)胞數(shù)混合；右下角為50:1細(xì)胞數(shù)混合；各圖中，橫坐 標(biāo)為細(xì)胞混合分組(從左到右依次為OCSCs組、DC-OCSCs組、CIK-OCSCs組和DC-CIK-OCSCs組)，縱坐標(biāo)為細(xì)胞毒性抑制率(％)。

具體實施方式

以下實施例涉及的卵巢癌病人病例均來自于上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院(2014年2月-2015年4月)

實施例1.

(1)從病人經(jīng)血中獲得PBMC細(xì)胞：

分別收集6個卵巢癌病人(病人情況見表1)的10ml月經(jīng)，通過梯度密度離心方法收集離心液中間層細(xì)胞：用6支肝素鈉抗凝管(內(nèi)含抗凝液0.2ml)收集月經(jīng)血總量達(dá)10ml左右，顛倒混勻，4℃放置不超過4小時；取6支無菌的15ml離心管，分別加入冰預(yù)冷的人淋巴細(xì)胞分離液(碧云天生物技術(shù)研究所)各8ml，然后小心的在其上面沿管壁滴加月經(jīng)血(每管6ml)；趁血液未完全滲透到分離液液面下方前，以4℃，水平離心機(jī)以1500r/min，離心15min，離心后其中的內(nèi)容物分為四層，上層為血漿(內(nèi)含血小板)，中間層為分層液，底層為紅細(xì)胞和粒細(xì)胞，在上、中層液體界面處乳白色混濁的PBMC(單個核細(xì)胞薄)層；用毛細(xì)血管吸取單個核細(xì)胞，移入另一離心管中，加入5ml的PBS洗滌2次，1500rpm離心10min，吸棄上清，沉淀即為PBMC細(xì)胞(5×10⁴/ml)。

(2)IL-2和IFN-γ刺激誘導(dǎo)CIK增殖：

A、DC細(xì)胞制備：步驟(1)利用2ml DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(內(nèi)含10％胎 牛血清)重懸PBMC細(xì)胞(5×10⁴/ml)，同時加入20μl的IL-2(終濃度100U/ml)以及20μl IFN-γ(終濃度1000U/ml)，培養(yǎng)于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中12小時(37℃)，即完成細(xì)胞刺激。并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD83(eBioscience)單克隆抗體，混勻(至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml)，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；反應(yīng)完畢，細(xì)胞懸液加入1ml冰預(yù)冷無菌的PBS，并且顛倒混勻數(shù)次，于4℃，1500r/min，離心5min；離心完畢，棄上清，細(xì)胞沉淀加入1ml冰預(yù)冷無菌的PBS，并且吹打混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選操作(Flow Cytometric，BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)，開啟FL1通道分選模式，并且調(diào)節(jié)補償，收集CD83-FITC+的細(xì)胞亞群；最終，可以獲得500μl純化的DC細(xì)胞(5×10³/ml)。

B、得到CIK細(xì)胞的方法：

取從上述步驟(1)卵巢癌病人經(jīng)血中獲得的PBMC細(xì)胞1ml(5×10⁴/ml)于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，細(xì)胞沉淀(5×10⁴)用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD3抗體和4μl碘化丙啶標(biāo)記的鼠抗人CD56抗體(eBioscience)，一并混勻(至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml)，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；反應(yīng)完畢，細(xì)胞懸液加入1ml冰預(yù)冷無菌的PBS，并且顛倒混勻數(shù)次，于4℃，1500r/min，離心5min；離心完畢，棄上清，細(xì)胞沉淀加入1ml冰預(yù)冷無菌的PBS，并且吹打混勻，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分選操作(Flow Cytometric，BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)，開啟FL1/FL2雙通道分選模式，并且調(diào)節(jié)補償，收集CD3-FITC+/CD56-PI+雙陽性細(xì)胞亞群；最終，可以獲得500μl純化的CIK細(xì)胞(為2×10³/ml)。

將上述步驟A獲得的0.5ml DC細(xì)胞(2×10³/ml)與步驟B獲得的0.5ml CIK細(xì)胞(2×10³/ml)以1:1比例加入到無菌的15ml離心管內(nèi)混合，即為DC-CIK細(xì)胞(最終體積為1ml，最終細(xì)胞數(shù)量為4×10³/ml)。

表1卵巢癌病人特征

表2卵巢癌病人經(jīng)血來源PBMC細(xì)胞總數(shù)

表2為卵巢癌病人經(jīng)血來源PBMC細(xì)胞總數(shù)。

取10ul步驟(1)從卵巢癌病人經(jīng)血中獲得PBMC細(xì)胞，用1.0ml瑞氏染液染色1分鐘后，滴入血球計數(shù)板(XB.K.25，上海求精生化試劑儀器)，于顯微鏡下計數(shù)得細(xì)胞總數(shù)在5×10⁵/ml左右，顯著低于正常人的數(shù)量，推測是由于卵巢癌導(dǎo)致免疫低下的緣故。

實施例2.IL-2和IFN-γ刺激誘導(dǎo)CIK增殖：

實施例1所有病人經(jīng)血來源的PBMC細(xì)胞同上述操作，將PBMC細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM+10％胎牛血清+IL-2+IFN-γ的完全培養(yǎng)基中12小時，即完成細(xì)胞刺激實驗，流式細(xì)胞術(shù)檢測：于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD83(eBioscience)單克隆抗體，一并混勻(至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml)，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；在原有的細(xì)胞懸液中再加入0.4ml PBS(磷酸緩沖液)，將細(xì)胞懸液體積控制在0.5ml，然后利用流式細(xì)胞儀檢測CD3+/CD56+雙陽性細(xì)胞比例，F(xiàn)C 500三色通道分析性流式細(xì)胞儀，貝克曼庫爾特生物儀器公司)結(jié)果提示，500μl CD3+/CD56+雙陽性的PBSC即為CIK細(xì)胞(為2×10³/ml)。其CIK數(shù)量均顯著高于未刺激組細(xì)胞的數(shù)量，并存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.01,n＝6)，實驗結(jié)果表明，利用IL-2和IFN-γ 刺激成功在體外誘導(dǎo)經(jīng)血來源的CIK增殖(圖1)。

確定CIK的方法：分別用FITC標(biāo)記的抗人CD3抗體和PE標(biāo)記的抗人CD56抗體與PBMC細(xì)胞在4℃下共孵育30分鐘，然后利用流式細(xì)胞儀檢測CD3+/CD56+雙陽性細(xì)胞數(shù)量，此細(xì)胞群即為CIK細(xì)胞。

DC細(xì)胞制備：同上述實施例1操作，PBMC細(xì)胞5×10⁴/ml經(jīng)過12小時IL-2100U/ml，和IFN-γ1000U/ml刺激后，將PBMC細(xì)胞(5×10⁴/ml，200μg)培養(yǎng)于4ml DMEM+10％胎牛血清+IL-2+IFN-γ的完全培養(yǎng)基接種于25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶中12小時(37℃)，即完成細(xì)胞刺激，得到細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD83(eBioscience)單克隆抗體，一并混勻至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；在原有的細(xì)胞懸液中再加入0.4ml PBS(磷酸緩沖液)，流式細(xì)胞儀分選操作(Flow Cytometric，BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)，即可獲得純化的CD83+的DC細(xì)胞，即DC細(xì)胞(100μg；5×10³/ml)(CD83是DC細(xì)胞的標(biāo)志物，CD83+的DC簡稱為DC細(xì)胞)。

確定DC的方法：PBMC細(xì)胞懸液于1500rpm，離心5分鐘，棄上清，沉淀用0.1ml的4℃PBS(磷酸緩沖液)重懸，并加入4μl異硫氰酸胍標(biāo)記的兔抗人CD83(eBioscience)單克隆抗體，一并混勻(至反應(yīng)終濃度為0.01mg/ml)，于4℃避光反應(yīng)30分鐘；在原有的細(xì)胞懸液中再加入0.4ml PBS(磷酸緩沖液)，將細(xì)胞懸液體積控制在0.5ml，然后利用流式細(xì)胞儀檢測CD83+細(xì)胞數(shù)量，此細(xì)胞群即 為DC細(xì)胞。

將CD3+/CD56+雙陽性細(xì)胞數(shù)和CD83+陽性細(xì)胞數(shù)相加，即為DC-CIK細(xì)胞數(shù)量。(200μg)

(通過流式細(xì)胞儀將CD83+、CD3+/CD56+的細(xì)胞分選出來，參考文獻(xiàn)：[1]Shan CC,Shi LR,Ding MQ,Zhu YB,Li XD,Xu B,Jiang JT,Wu CP.Cytokine-induced killer cells co-cultured with dendritic cells loaded with the protein lysate produced by radiofrequency ablation induce a specific antitumor response.Oncol Lett.2015Apr；9(4):1549-1556.

[2]Yang L,Ren B,Li H,Yu J,Cao S,Hao X,Ren X.Enhanced antitumor effects of DC-activated CIKs to chemotherapy treatment in a single cohort of advanced non-small-cell lung cancer patients.ancer Immunol Immunother.2013Jan；62(1):65-73.)

實施例3.DC-CIK細(xì)胞在體外培養(yǎng)中釋放多種腫瘤殺傷因子：

用實施例2得到的DC-CIK細(xì)胞(1×10⁴/ml)1500rpm離心5分鐘，收集各組細(xì)胞沉淀，根據(jù)TGF-β、IL-2、IL-10、TNF-α和INF-γELISA kit(酶聯(lián)免疫吸附檢驗試劑盒，武漢博士德生物科技有限公司)的描述來進(jìn)行檢測。各組細(xì)胞用蛋白抽提液(碧云天生物公司)裂解后，取100μl總蛋白上清液，分別加入預(yù)先包被的96孔檢測板中，于37℃孵育60分鐘。同時，按照說明書的要求加入梯度稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白，于37℃孵育60分鐘。反應(yīng)完成后，棄液體，利用清洗液洗板3次，加入HRP標(biāo)記的檢測抗體于37℃孵育60分鐘。隨后，加入反應(yīng)終止液。96孔板在波長450nm處測定吸光度。

ELISA(酶聯(lián)免疫吸附檢驗)檢測(使用酶標(biāo)儀在450nm處測定吸光度，Biotek酶標(biāo)儀，SynergyH4,美國biotek生化儀器公司)結(jié)果提示，DC-CIK細(xì)胞在體外培養(yǎng)過程中，要比單獨培養(yǎng)CIK細(xì)胞釋放更多的殺傷腫瘤細(xì)胞的因子，且存在顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(p<0.05,n＝6)(圖2)。

實施例4.DC-CIK在體外對OCSCs具有典型的細(xì)胞毒性：

將(實施例2)的DC-CIK細(xì)胞與OCSCs(6個卵巢癌病人行手術(shù)切除卵巢癌組織10g(表1中的病人卵巢癌組織樣本)，本實驗將手術(shù)切下的卵巢癌組織收集在無菌離心管中，用0.25％胰酶10ml消化成單細(xì)胞懸液，每100μL卵巢癌細(xì)胞懸液加入4μL的CD44(兔抗人CD44-PE，eBioscience公司)和CD117單克隆抗體(小鼠抗人CD117-FITC,eBioscience公司)，細(xì)胞于4℃條件下孵育30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗1次，然后用流式細(xì)胞儀(BD FACS Aria,BD Bioscience,CA,USA)分離CD44+/CD117+的OCSCs細(xì)胞亞群)共培養(yǎng)，以DC-CIK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，OCSCs為靶細(xì)胞，效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞之間的比例為A1:1,B5:1，C10:1,D50:1。將DC-CIK細(xì)胞和OCSCs細(xì)胞分別以下列體系在15ml無菌離心管中混勻(A組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁴個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；B組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；C組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；D組： 1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁶個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個))，細(xì)胞混懸液于37℃，5％CO₂環(huán)境下培養(yǎng)24小時，加入MTT試劑(噻唑蘭)100μl(碧云天生物科技有限公司)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時，棄培養(yǎng)液，每孔加入150微升二甲基亞砜,置搖床上低速振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀上讀出OD＝490nm處的吸光值。按照公式：殺傷率(％)＝[1-(效應(yīng)細(xì)胞OD490吸光度值/靶細(xì)胞OD490吸光度值)]×100％，計算殺傷率。

在體外，將效應(yīng)細(xì)胞(DC-CIK細(xì)胞或者單純的CIK細(xì)胞)與靶細(xì)胞(OCSCs細(xì)胞)之間的比例為A1:1,B5:1，C10:1,D50:1；將DC-CIK細(xì)胞或CIK細(xì)胞和OCSCs細(xì)胞分別以下列體系在15ml無菌離心管中混勻(A組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁴個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)以及1ml CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁴個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；B組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)以及1ml CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；C組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)以及1ml CIK細(xì)胞(濃度為5×10⁵個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)；D組：1ml DC-CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁶個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個)以及1ml CIK細(xì)胞(濃度為2.5×10⁶個)加上1ml OCSCs細(xì)胞混勻(濃度為5×10⁴個))細(xì)胞混懸液于37℃，5％CO₂環(huán)境下培養(yǎng)24小時，)，通過檢測(使用酶標(biāo)儀在490nm處測定吸光度，Biotek 酶標(biāo)儀，SynergyH4,美國biotek生化儀器公司)OCSCs細(xì)胞增值抑制率來檢測各種組合對該腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞毒性(殺傷效率)。實驗結(jié)果表明，在同一種細(xì)胞濃度比例組合下，DC-CIK對OCSCs的細(xì)胞毒性最強、殺傷效率最高(p<0.05,n＝6)；而隨著DC-CIK細(xì)胞濃度的增加，其細(xì)胞毒性和殺傷效率也增加(圖3)。