本發(fā)明屬于固定化酶技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種固定化漆酶載體的制備方法和降解微量有機(jī)污染物的方法。

背景技術(shù)：

微量有機(jī)污染物具有濃度低、毒性大的特點(diǎn)，其化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能持久存在于自然環(huán)境中，脂溶性強(qiáng)、極易被機(jī)體吸收，但不易被機(jī)體降解。相關(guān)研究顯示種類繁多的有機(jī)污染物的致突變性和致癌性之間存在一定的相關(guān)性。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，在各種環(huán)境樣品如地表水、地下水、污泥沉積物甚至在飲用水中微量有機(jī)污染物都能被檢測出來，其濃度從ng/L到μg/L不等。因此，如何有效地降解環(huán)境中的微量有機(jī)污染物近年來受到了極大關(guān)注。與采用膜技術(shù)、反滲透技術(shù)、高級(jí)氧化技術(shù)和電化學(xué)技術(shù)等處理微量有機(jī)污染物的技術(shù)相比，采用酶處理降解微量有機(jī)污染物被認(rèn)為是目前最有前景的技術(shù)，它的反應(yīng)條件溫和，具有較高反應(yīng)特異性和速率，與大多數(shù)化學(xué)催化過程相比，酶處理消耗的能量較少，成本低廉。

漆酶(Laccase EC 1.10.3.2)是一種含銅多酚氧化酶，其作用主要是催化氧化還原反應(yīng)。漆酶主要分為：真菌漆酶與細(xì)菌漆酶。大多數(shù)漆酶有4有個(gè)銅離子，共同構(gòu)成漆酶的活性中心，在催化反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。這四個(gè)銅離子結(jié)合在蛋白內(nèi)高度保守區(qū)域，根據(jù)其電子順磁共振和光譜特征可分為以下三類：1個(gè)Ⅰ型銅離子，1個(gè)Ⅱ型銅離子和2個(gè)Ⅲ型銅離子。漆酶對(duì)底物的催化主要通過四個(gè)銅離子的協(xié)同作用完成。大量研究表明，Ⅰ型銅離子是漆酶催化氧化底物、接受底物電子的“入口”，而Ⅱ型和Ⅲ型銅離子構(gòu)成的三核銅離子簇則是氧氣還原為水的位置。電子在漆酶分子內(nèi)是由Ⅰ型銅離子向三核銅離子族傳遞。漆酶能將分子氧直接還原為水，在沒有過氧化氫和其它次級(jí)代謝產(chǎn)物存在下,可催化大量的酚類和芳香胺類化合物的氧化降解，是一種環(huán)境友好型的酶，在廢水處理、造紙工業(yè)、環(huán)境保護(hù)等方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。

游離的漆酶在使用過程中易隨環(huán)境的變化而變性失活，儲(chǔ)存穩(wěn)定性低，易摻入雜質(zhì)分離回收困難，這些都進(jìn)一步限制了漆酶的推廣和應(yīng)用。固定化酶技術(shù)是近十幾年發(fā)展起來的酶應(yīng)用技術(shù)，固定化酶在保持其高效專一性及溫和的酶催化反應(yīng)特性的同時(shí)，又克服了酶的不足之處，故對(duì)漆酶進(jìn)行固定化是改善游離態(tài)漆酶的穩(wěn)定性和實(shí)現(xiàn)循環(huán)利用的有效方法。目前酶固定化載體的材料主要為殼聚糖、硅膠、活性炭、高分子濾膜和電紡纖維等，但現(xiàn)有的酶固定化載體不同程度存在酶結(jié)合率低、分離效果差、重復(fù)使用率低、制備工藝復(fù)雜和成本較高等問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種固定化漆酶載體的制備方法，其制備工藝簡單，而且由此得到的固定化漆酶活性穩(wěn)定、重復(fù)使用率高，可有效應(yīng)用于降解環(huán)境中的微量有機(jī)污染物。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供了一種固定化漆酶載體的制備方法，包括以下步驟：

a)將二氧化硅置于3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中，反應(yīng)，得到3-氨丙基三乙氧基硅烷表面修飾的二氧化硅；

b)將步驟a)中得到的3-氨丙基三乙氧基硅烷表面修飾的二氧化硅置于交聯(lián)劑中進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，得到所述固定化漆酶載體。

優(yōu)選的，步驟b)中所述交聯(lián)劑為戊二醛、順丁烯二酸酐或碳化二亞胺。

更優(yōu)選的，所述戊二醛為戊二醛和磷酸鉀緩沖液的混合溶液；

所述混合溶液中戊二醛的體積百分比濃度為2.5％～10％；

更優(yōu)選的，所述交聯(lián)反應(yīng)的時(shí)間為1h～6h，所述交聯(lián)反應(yīng)的溫度為25℃-40℃。

優(yōu)選的，步驟a)中所述3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液為3-氨丙基三乙氧基硅烷的丙酮溶液；

所述3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液中3-氨丙基三乙氧基硅烷的體積百分比濃度為2％～10％。

優(yōu)選的，步驟a)中所述二氧化硅為二氧化硅小球；

所述二氧化硅小球的直徑為1～2cm。

本發(fā)明還提供了一種固定化漆酶的制備方法，將上述制備方法得到的固定化漆酶載體和漆酶溶液混合，得到所述固定化漆酶。

優(yōu)選的，所述漆酶的活度為1.5～3.0U/mL。

優(yōu)選的，所述混合在搖床上進(jìn)行，其轉(zhuǎn)速為90rpm～120rpm；

所述混合的時(shí)間為24h～48h。

本發(fā)明還提供了一種降解微量有機(jī)污染物的方法，將前述制備方法得到的固定化漆酶和含微量有機(jī)污染物的樣品混合，降解微量有機(jī)污染物。

優(yōu)選的，所述降解的溫度為30～80℃，pH為2～8；

所述降解的時(shí)間為4h～10h。

綜上所述，本發(fā)明提供了一種固定化漆酶載體的制備方法，其制備工藝簡單，成本低廉，得到的固定化漆酶載體與酶的結(jié)合率高，不僅維持了漆酶自身的反應(yīng)活性，還改善了漆酶的穩(wěn)定性和實(shí)現(xiàn)了漆酶循環(huán)使用的目的。本發(fā)明還提供了一種固定化漆酶的制備方法，通過將前述固定化漆酶載體和漆酶混合固定得到，制備過程簡單，得到的固定化漆酶具有活性穩(wěn)定、可長期保存、易于分離回收和可循環(huán)使用等優(yōu)點(diǎn)；將其應(yīng)用于降解環(huán)境樣品中的微量有機(jī)污染物時(shí)，其降解效率高達(dá)92％，降解時(shí)間短，而且降解產(chǎn)物無二次污染，綠色環(huán)保。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)提供的附圖獲得其他的附圖。

圖1為實(shí)施例3中固定化漆酶對(duì)2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷的降解率和漆酶活性的影響；

圖2為實(shí)施例4中固定化漆酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性考察結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例只是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行修改或者對(duì)部分技術(shù)特征進(jìn)行同等替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明保護(hù)的范圍中。

實(shí)施例1固定化漆酶的制備

1)取均勻分布有蜂窩狀微孔的市售礦石SiO₂，磨制成多個(gè)質(zhì)量約為0.5g、直徑約為1.1cm的SiO₂小球(比表面積為1.7005m²/g)；接著，采用去離子水洗滌SiO₂小球，并將其置于電熱鼓風(fēng)干燥箱中以45℃條件干燥24h，待用。

2)將步驟1)中經(jīng)干燥后的SiO₂小球浸沒于12.5mL濃度為6vol％的3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液(APTES)中進(jìn)行表面修飾24h，然后用去離子水沖洗4次以清洗停留在載體表面的有機(jī)相，再置于45℃溫度條件下干燥24h。

3)將步驟2)中經(jīng)表面修飾后的SiO₂小球浸沒于12.5mL濃度為7.5vol％的戊二醛溶液中，并置于軌道式搖床上30℃、90rpm交聯(lián)2h,然后用50mL去離子水清洗數(shù)次，再在45℃條件下干燥48h，得到固定化漆酶載體。

4)將步驟3)中得到的固定化漆酶載體置于5mL活度為2U/mL的漆酶溶液中，置于軌道搖床上以30℃、100rpm振蕩24h，使得漆酶能均勻地固定在載體上，得到固定化漆酶。

對(duì)步驟4)中得到的固定化漆酶進(jìn)行酶活性測試，以2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)為底物，然后通過紫外可見分光光度計(jì)測定ABTS在420nm(ε_max＝3.6×10⁴M^-1cm^-1)處的吸光度的變化來測定酶對(duì)其的氧化速度。具體過程為：在室溫下，將步驟(4)中得到的固定化漆酶和3mL的0.001mol/LABTS(pH＝4.5)溶液混勻，置于軌道式搖床以120rpm搖勻，5min后收集溶液立即采用紫外分光光度計(jì)測量其吸光度，得到固定化漆酶的活性。

實(shí)施例2考察APTES、戊二醛對(duì)SiO₂小球與漆酶固定化結(jié)合率的影響

1)配制體積百分比濃度分別為2％、4％、6％、8％和10％的APTES溶液。

2)配制體積百分比濃度分別為2.5％、5.0％、7.5％和10.0％的戊二醛溶液。

3)將實(shí)施例1步驟1)中經(jīng)干燥后的SiO₂小球分別浸沒于步驟1)配制的5種APTES溶液中，然后按照實(shí)施例1中的步驟2)至步驟4)所述過程制備固定化漆酶，接著采用紫外可見分光光度計(jì)測定595nm處的吸光度，根據(jù)吸光度的變化來測定固定化漆酶載體上的蛋白質(zhì)含量，從而計(jì)算漆酶和載體的結(jié)合率，結(jié)果如表1所示，表明采用濃度為6vol％的APTES溶液得到的固定化漆酶載體的結(jié)合率最高。

4)將實(shí)施例1步驟1)中經(jīng)干燥后的SiO₂小球分別浸沒于步驟2)配制的5種戊二醛溶液中，然后按照實(shí)施例1中的步驟2)和步驟4)所述過程制備固定化漆酶，接著采用紫外可見分光光度計(jì)測定595nm處的吸光度，根據(jù)吸光度的變化來測定固定化漆酶載體上的蛋白質(zhì)含量，從而計(jì)算漆酶和載體的結(jié)合率，結(jié)果如表2所示，表明采用濃度為7.5vol％的戊二醛溶液得到的固定化漆酶載體的結(jié)合率最高。

表1

表2

實(shí)施例3固定化漆酶對(duì)BPA的降解率及漆酶活性的影響

以活度為2U/mL的游離態(tài)漆酶作為對(duì)照，考察實(shí)施例1中得到的固定化漆酶對(duì)2,2-雙(4-羥基苯基)丙烷(BPA)的降解效率以及漆酶活性的影響。在50℃下，將固定化漆酶和BPA溶于檸檬酸鹽緩沖液(0.05mol/L,pH4.5)中，BPA的終濃度為100mg/L。然后，每隔1h取樣并采用高效液相分析待測溶液中BPA的濃度變化。結(jié)果顯示，1h后，固定化漆酶對(duì)BPA的降解率達(dá)71％，游離態(tài)漆酶對(duì)BPA的降解率為61％，固定化漆酶的活性為初始活性的78％，而游離態(tài)漆酶僅為初始活性的40％。6h后，BPA的降解率已達(dá)92％，此時(shí)固定化漆酶的活性為53％，仍能維持相對(duì)較高的活性；而游離態(tài)漆酶的活性僅有16％，BPA的降解效率也只達(dá)85％。結(jié)果如圖1所示，與游離態(tài)漆酶相比，固定化漆酶在酶活、穩(wěn)定性與降解BPA效率上都有顯著的提升，因此本發(fā)明制備的固定化漆酶可通過重復(fù)使用與提高降解效率達(dá)到降低處理成本的要求。

實(shí)施例4

將實(shí)施例1中的固定化漆酶保存于磷酸鉀緩沖液(0.5mol/L,pH＝7.0)中，于4℃冰箱保存，每隔一周，測試漆酶的活性。測定結(jié)果如圖2所示，第3周的固定化漆酶相對(duì)活性為90％，高出游離態(tài)漆酶29％；第7、8周的游離態(tài)漆酶相對(duì)活性分別為15％、9％，固定化漆酶的相對(duì)活性為81％、79％，表明固定化漆酶儲(chǔ)存穩(wěn)定性相較于游離態(tài)漆酶有大幅度的提升。