本發(fā)明屬于生物工程及能源化工領(lǐng)域，具體涉及一種利用磁性納米顆粒固定化脂肪酶催化制備生物柴油的方法。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟發(fā)展和社會進步，化石能源尤其是石油能源的消費迅速增長，開發(fā)新型生物能源作為石化柴油替代產(chǎn)品，能促進新型能源發(fā)展、保障能源安全和國家安全。生物柴油不僅具有跟石化柴油相似的燃燒特性，還具有環(huán)境友好、較高安全性、良好潤滑性及可再生可生物降解等優(yōu)良特性。

生物柴油各生產(chǎn)工藝中，化學(xué)堿催化法已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，雖然其催化劑相對廉價、反應(yīng)時間短，轉(zhuǎn)化率較高的優(yōu)點，但仍存在一系列固有的缺陷：(1)對原料品質(zhì)要求較高，對廢油脂、工業(yè)下腳料回收利用率低；(2)工藝復(fù)雜，能耗高；(3)醇用量大且不易回收利用；(4)副產(chǎn)物甘油難回收利用，催化劑難與產(chǎn)物分離，增大了后續(xù)處理的成本，廢堿液排放形成新的環(huán)境污染源。堿催化法利用精煉油同甲醇合成生物柴油，雖然在一定程度上緩解了能源壓力，但是該工藝的固有缺陷決定了它不是最節(jié)能環(huán)保的，因此更具有環(huán)保優(yōu)勢的綠色能源工藝——脂肪酶催化工藝必然是今后發(fā)展的趨勢。

脂肪酶催化法對原料的選擇性低，可利用酸值較高的廢油及工業(yè)下腳料，且反應(yīng)條件溫和，能耗低；醇用量小，產(chǎn)物及副產(chǎn)物較易分離且無污染排放，克服了堿催化法的嚴重缺陷，是一種理想的節(jié)能環(huán)保型工藝。但是，脂肪酶催化的化學(xué)反應(yīng)工藝條件，通常是在各種有機溶劑介質(zhì)(如生物柴油生產(chǎn)中使用的短鏈醇)、極端酸堿(如廢紙脫墨工業(yè)中的強堿性)等條件下，容易導(dǎo)致天然脂肪酶的失活，從而限制了脂肪酶大規(guī)模應(yīng)用，脂肪酶的穩(wěn)定性差主要體現(xiàn)在游離酶直接暴露在反應(yīng)體系中，甲醇或乙醇作為?；荏w制備生物柴油時，與油脂的混溶性較差，反應(yīng)所需量的甲醇或乙醇未溶解的部分將引起酶失活。

脂肪酶的制備方法對生物柴油制備工藝有重要影響。游離酶在有機反應(yīng)體系內(nèi)易產(chǎn)生聚集，不利于酶與反應(yīng)物的接觸，反應(yīng)效率很低，穩(wěn)定性差。反應(yīng)物甲醇等短鏈脂肪醇和副產(chǎn)物甘油對酶有毒性作用，降低了酶的使用壽命和轉(zhuǎn)化率。大量的游離酶無法得到多次的利用，回收困難，加之脂肪酶本身的價格就十分昂貴，使得酶法生產(chǎn)生物柴油的成本很高，無法用于工業(yè)的推廣使用。通過物理吸附法脂肪酶損失小，且保留了脂肪酶的特異性，但固定化脂肪酶的穩(wěn)定性差，不易儲藏；交聯(lián)法脂肪酶損失較大，但固定化脂肪酶的穩(wěn)定性較好，3個月后保留62.5％的活力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上酶法制備生物柴油存在的問題，本發(fā)明旨在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種磁性載體固定化脂肪酶制備生物柴油的方法，通過固定化實現(xiàn)脂肪酶的重復(fù)利用，降低酶法催化生產(chǎn)生物柴油的生產(chǎn)成本。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下方式來實現(xiàn)：

一種磁性載體固定化脂肪酶制備生物柴油的方法，該方法利用固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑對反應(yīng)進行催化，所述固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑由磁性納米顆粒作為載體采用共價交聯(lián)的方法對產(chǎn)脂肪酶菌進行固定化制備而成。

所述的磁性納米顆粒按照下述步驟進行制備：

1)Fe₃O₄@SiO₂磁性復(fù)合納米顆粒的制備：稱取Fe₃O₄納米顆粒放入含有無水乙醇、蒸餾水和氨水混合液的三口燒瓶中，通過超聲波處理1h后，保持在30℃恒溫下進行機械攪拌30min，滴加正硅酸乙酯(TEOS)，再機械攪拌反應(yīng)24h，用磁鐵進行磁分離，分別再用蒸餾水和無水乙醇進行充分洗滌，磁分離，真空抽濾干燥至質(zhì)量不變，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂磁性復(fù)合納米顆粒；

2)Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性納米顆粒的制備：稱取步驟1)中制備的Fe₃O₄@SiO₂磁性復(fù)合納米顆粒放入含有無水乙醇和氨水混合液的三口燒瓶中，通過超聲波處理1h后，保持在30℃恒溫下滴加γ-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，機械攪拌反應(yīng)24h，用磁鐵進行磁分離，然后分別用蒸餾水和無水乙醇進行充分洗滌，磁分離，真空抽濾干燥至質(zhì)量不變，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂–NH₂氨基化磁性納米顆粒；

3)Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性納米顆粒的制備：再稱取步驟2)制備的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性納米顆放入含有戊二醛溶液的三口燒瓶中，通過超聲波處理30min后，保持在30℃恒溫下機械攪拌12h，用磁鐵進行磁分離，再利用磷酸緩沖液充分洗滌，去除多余的戊二醛，真空抽濾干燥至質(zhì)量不變，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性納米顆粒。

所述的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑的制備，具體包括以下步驟：

1)將產(chǎn)脂肪酶在以下條件進行培養(yǎng)：2.845g/L的葡萄糖，1.2％的橄欖油添加量，初始pH為7.2、1.5％的牛肉膏、0.1％的(NH₄)₂SO₄、接種量2.5％和0.15％的K₂HPO₄.3H₂O，保持在30℃恒溫下，發(fā)酵48h；

2)將步驟1)中培養(yǎng)好的發(fā)酵酶菌液在12000rpm轉(zhuǎn)速下離心10min，收集上清液，將Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性納米顆粒、pH7.0的磷酸緩沖液和發(fā)酵酶菌液混合于三角瓶中，通過超聲波處理，并在40℃的條件下?lián)u床反應(yīng)4h進行固定化，然后用磁鐵進行磁分離，用磷酸緩沖液充分洗滌，真空抽濾干燥即得到固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑。

本發(fā)明利用磁性固定化酶催化劑制備生物柴油時，按照摩爾比4:1-12:1加入醇油，加入占油醇和水總體積的10-15％的水和占油、醇、水和催化劑總質(zhì)量的2-8％的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑，置于反應(yīng)溫度為30-50℃的搖床中進行反應(yīng)4h。所述油選用橄欖油或者地溝油；所述醇為甲醇。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的有益效果：本發(fā)明所使用的高產(chǎn)脂肪酶菌株經(jīng)最優(yōu)發(fā)酵條件發(fā)酵后，所產(chǎn)脂肪酶活性較高，固定化工藝與傳統(tǒng)的固定化脂肪酶催化轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油相比，本發(fā)明提供的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑，直接利用微生物發(fā)酵液，無需進行脂肪酶的純化，工藝簡單，成本低廉；選用磁性材料便于分離，實現(xiàn)多次重復(fù)利用，酯化反應(yīng)結(jié)束后，利用永磁鐵將催化劑從反應(yīng)產(chǎn)物中分離出來，可直接投放于新的反應(yīng)物中進行反應(yīng)；具有高的使用壽命、傳質(zhì)效率及轉(zhuǎn)化率：由于催化劑具有磁學(xué)效應(yīng)，因此能夠?qū)⒋呋瘎┓湃刖哂写艌龅姆磻?yīng)器中進行反應(yīng)，這樣能夠使催化劑分布更加均勻，減少沉降碰撞，達到提高傳質(zhì)效率及轉(zhuǎn)化率的效果，轉(zhuǎn)酯反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)時間短，轉(zhuǎn)酯效率高。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑掃描電鏡照片。

圖2是實例1使用橄欖油制備生物柴油GC-MS色譜圖。

圖3是實例2使用地溝油制備生物柴油GC-MS色譜圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的具體實施方式作進一步詳細的說明，但本發(fā)明的內(nèi)容不僅限于實施例所涉及的內(nèi)容。

稱取2g的Fe₃O₄納米顆粒放入含有200ml無水乙醇、50ml蒸餾水和氨5ml水混合液的三口燒瓶中，通過超聲波處理1h后，保持在30℃恒溫下進行機械攪拌30min，緩慢加入5ml的正硅酸乙酯，連續(xù)攪拌反應(yīng)24h，磁分離，分別再用蒸餾水和無水乙醇進行充分洗滌，磁分離，真空干燥，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂；稱取2g的Fe₃O₄@SiO₂放入含有150ml無水乙醇和15ml氨水混合液的三口燒瓶中，超聲波分散，保持在30℃恒溫下滴加10ml的γ-氨丙基三乙氧基硅烷，機械攪拌反應(yīng)24h，磁分離，分別用蒸餾水和無水乙醇進行充分洗滌，磁分離，真空干燥，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂–NH₂氨基化磁性納米顆粒；再稱取2g的Fe₃O₄@SiO₂-NH₂氨基化磁性納米顆放入含有100ml的10％戊二醛溶液的三口燒瓶中，通過超聲波處理30min后，保持在30℃恒溫下機械攪拌12h，磁分離，再利用磷酸緩沖液充分洗滌，去除多余的戊二醛，真空干燥，得松散的粉末狀Fe₃O₄@SiO₂-CHO活化磁性納米顆粒，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

再稱取50mg的Fe3O4@SiO2–CHO活化磁性納米顆粒，將20ml濃度為1mol/L的pH7.0的磷酸緩沖液和30ml的發(fā)酵酶菌液混合于三角瓶中，通過超聲波處理，并在40℃的條件下?lián)u床反應(yīng)4h進行固定化，然后用磁鐵進行磁分離，用磷酸緩沖液充分洗滌，真空干燥即得到固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑。

實施例1催化橄欖油轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油

以橄欖油為原料，以制備的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑進行轉(zhuǎn)酯化試驗。將2ml橄欖油和330ml甲醇(醇油摩爾比4:1)混合物裝于試管中，加入10％的水(占油醇和水總體積的10％)，再分別加入5％的上述催化劑(占油、醇、水、催化劑總質(zhì)量的5％)，置于搖床中進行反應(yīng)，溫度40℃，轉(zhuǎn)速160rpm進行反應(yīng)4h。反應(yīng)完成后，取出樣品在轉(zhuǎn)速為10000rpm離心2min后取上層液體測定甲酯含量，測得轉(zhuǎn)酯效率為98.84％。

實施例2催化地溝油轉(zhuǎn)酯化制備生物柴油

以地溝油為原料，以制備的固定化脂肪酶磁性納米顆粒催化劑進行轉(zhuǎn)酯化試驗。地溝油原料由成都蜀豐有限公司提供，經(jīng)過機械除雜、膨潤土吸附劑吸附過濾、水洗及高速旋轉(zhuǎn)離心除去水分后，用甲醇酯化進行降酸后直接使用。地溝油主要特性如下：酸值28.87mgKOH/g；游離脂肪酸10.27％；平均分子量為885.68。將地溝油和甲醇(醇油摩爾比12:1)混合物裝于試管中，加入15％的水(占油醇和水總體積的15％)，再分別加入8％的上述催化劑(占油、醇、水、催化劑總質(zhì)量的8％)，置于搖床中進行反應(yīng)，溫度50℃，轉(zhuǎn)速160rpm進行反應(yīng)4h。取出的樣品在轉(zhuǎn)速為10000rpm離心2min后取上層液體測定甲酯含量，測得轉(zhuǎn)酯效率為97.19％。

本發(fā)明中，以該經(jīng)活化后的氨基化磁性納米復(fù)合材料為載體，通過共價偶聯(lián)方式固定高產(chǎn)脂肪酶菌株所產(chǎn)脂肪酶獲得的固定化酶催化劑，在催化橄欖油和地溝油作為底物催化制備生物柴油，經(jīng)4h轉(zhuǎn)酯反應(yīng)后，轉(zhuǎn)酯效率分別高達98.84％和97.19％。轉(zhuǎn)酯產(chǎn)物主要是棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、硬脂酸甲酯，均為生物柴油的主要成分。

轉(zhuǎn)酯效率即脂肪酸甲酯得率采用色譜法分析，氣相色譜操作條件：FID檢測器，毛細管氣相色譜柱HP-88，進樣量1μl，柱流速1ml/min，升溫速度10℃/min，程序升溫60℃-230℃。

以上對本發(fā)明做了示例性的描述，應(yīng)該說明的是，在不脫離本發(fā)明的核心的情況下，任何簡單的變形、修改或者其他本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠不花費創(chuàng)造性勞動的等同替換均落入本發(fā)明的保護范圍。