本發(fā)明屬于制藥工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及到青霉生物催化制備醫(yī)藥中間體2，3，5-3羥基-苯酸的技術(shù)。

背景技術(shù)：

生物催化具有催化效率高、選擇性強(qiáng)、條件溫和、環(huán)境友好等突出優(yōu)點(diǎn),是可持續(xù)發(fā)展過程中替代和拓展傳統(tǒng)有機(jī)化學(xué)合成的重要方法。其中微生物催化是生物催化最具吸引力的應(yīng)用領(lǐng)域之一,在工業(yè)生物催化中一直扮演著重要角色。

芳烴的羧化反應(yīng)是一類重要的反應(yīng)，其產(chǎn)物為芳烴羥基羧酸，是重要的藥物合成起始原料。但是，現(xiàn)在的生產(chǎn)采用傳統(tǒng)的化學(xué)合成，用芳烴與CO₂反應(yīng)，反應(yīng)壓力高達(dá)10MPa，溫度高達(dá)140-380℃，反應(yīng)選擇性差，副產(chǎn)物多。采用微生物催化，則可能改變這種狀況。采用微生物催化，可以在常溫、常壓下反應(yīng)生產(chǎn)芳烴羥基羧酸，條件溫和，選擇性高，副反應(yīng)少，產(chǎn)率高。

本發(fā)明將采用微生物催化反應(yīng)，生產(chǎn)芳烴羥基羧酸：2，3，5-3羥基-苯酸。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明采用青霉催化制備2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)式如下：

底物1，2，3-3羥基苯 （1）經(jīng)青霉催化反應(yīng)，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸（2）。有多種微生物可以催化此反應(yīng)，經(jīng)過大量實(shí)驗(yàn)篩選，最終確定采用青霉作為催化劑，因?yàn)槠浯呋磻?yīng)的效果最好，副產(chǎn)物極少，反應(yīng)收率高。

許多霉菌都可以進(jìn)行生物催化此反應(yīng)，然而，其效果不同，相差很大，經(jīng)實(shí)驗(yàn)，本發(fā)明選用青霉菌株為IFO 9501 ，其催化反應(yīng)效果最佳。

由于底物溶解度較低，所以，加入表面活性劑以增加底物的溶解度。盡管表面活性劑增加了底物溶解度，底物仍然不能很好溶解，屬于液-液2相反應(yīng)，底物、產(chǎn)物的相間傳質(zhì)為反應(yīng)的限制環(huán)節(jié)，所以，還需采取措施，以提高反應(yīng)速度。增加非均相反應(yīng)的反應(yīng)界面，是提高非均相反應(yīng)的有效措施之一。加入表面活性劑后，在強(qiáng)烈攪拌下，反應(yīng)液成為乳液，使得催化反應(yīng)界面大幅度增加，從而大幅度提高反應(yīng)速度。特別是，加入的表面活性劑，必須生物相容，不抑制微生物的催化活性，所以，表面活性劑種類和濃度的選擇，是非常重要的。大量實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入吐溫80 15-16g/L是最佳的。

反應(yīng)結(jié)束后，用有機(jī)溶劑萃取產(chǎn)物。需要破乳，有多種方法可以破乳，包括鹽析法：加入氯化鈉、硫酸銨或氯化鈣、氯化鎂、硫酸鈣、硫酸鎂；凝聚法：加入聚合氯化鋁、明礬等；或者將上述2類混合加入；加熱等。不同產(chǎn)物，所用的方法不同，實(shí)驗(yàn)表明，對(duì)于本反應(yīng)，加入1.7%的硫酸銨+0.036%的聚合氯化鋁是最佳的。

羧化反應(yīng)中，采用NaHCO₃提供CO₂,實(shí)際上，有多種物質(zhì)可以提供CO₂,但是，通過大量實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)于本發(fā)明，使用NaHCO₃是最佳的。由于加入NaHCO₃會(huì)使反應(yīng)液的pH升高，而適宜的pH，對(duì)微生物催化反應(yīng)致關(guān)重要，所以，不能一次加入，必須采用流加方式加入NaHCO₃。然而，即使流加NaHCO₃，反應(yīng)液的pH仍然升高，所以，還必須采取措施，維持反應(yīng)液處于適宜的pH，使微生物能夠正常發(fā)揮生物催化作用。通過大量實(shí)驗(yàn)表明，流加鹽酸水溶液是適宜的方法，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，可以使溶液的pH處于最佳范圍，使生物催化反應(yīng)正常進(jìn)行。

可以明顯看出，本發(fā)明所涉及的微生物菌株選擇、表面活性劑選擇、破乳劑選擇、CO₂供體選擇，還有反應(yīng)溫度，反應(yīng)時(shí)間，反應(yīng)pH，底物濃度，生物催化反應(yīng)液成分確定等，眾多因素均需考慮，并且，它們相互影響。特別是，需要從實(shí)驗(yàn)室小試、中試，直到工業(yè)規(guī)模反應(yīng)，更是大幅度增加了工作難度、工作量。所以，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)至管重要，如此多的因素，生物催化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論分析和實(shí)驗(yàn)工作量巨大。

培養(yǎng)介質(zhì)：

1、種子培養(yǎng)基成份為: 酵母提取物10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，麥芽浸膏25-30 g，硫酸銨0.5-0.7g/L;配制固體培養(yǎng)基時(shí)添加15g/L的瓊脂粉。

2、培養(yǎng)液成份：玉米漿( 以干物質(zhì)計(jì))含量為36-40g/L， 酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖19-21 g/L，麥芽浸膏21-23g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 6.1。

2、固體培養(yǎng)基成份： 在液體培養(yǎng)基中加入2%的瓊脂粉。

微生物發(fā)酵液制備。青霉IFO 9501經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至29-31℃，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V?分鐘，29-31℃培養(yǎng)36-40小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃度為90-95g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應(yīng)催化劑。

用HPLC測(cè)產(chǎn)品收率及純度，C18柱，紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)254nm，流動(dòng)相為pH3的磷酸緩沖液：甲醇=90:10。

生物催化反應(yīng)：發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物1，2，3-3羥基苯，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為44-48小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時(shí)流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用0.2倍反應(yīng)液體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.8-99.4％，產(chǎn)品收率95.7-96.9％。

實(shí)施例1

培養(yǎng)液成份：玉米漿( 以干物質(zhì)計(jì))含量為36-40g/L， 酵母浸膏7-8 g/L，葡萄糖19-21 g/L，麥芽浸膏21-23g，硫酸銨0.5-0.7g/L，硫酸鎂0.3-0.4g/L，磷酸二氧鉀1.8-2.3g/L，碳酸鈣 0.7 g/L,硫酸亞鐵 0.18 g/L,硫酸錳 0.025 g/L;pH 6.1。

微生物發(fā)酵液制備。青霉IFO 9501經(jīng)斜面、搖瓶、種子罐培養(yǎng)得到種子液；發(fā)酵罐加入培養(yǎng)液，裝料系數(shù)為0.6-0.7，121℃高壓滅菌30分鐘冷卻至29-31℃，將青霉菌種子液接種至發(fā)酵罐，接種比例為8-9％，通氣比為1-1.2V/V?分鐘，29-31℃培養(yǎng)36-40小時(shí)，發(fā)酵液中濕酵母細(xì)胞濃度為90-95g/L，此發(fā)酵液用作生物催化反應(yīng)催化劑。

生物催化反應(yīng)：15L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物 1，2，3-3羥基苯 ，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時(shí)，攪拌乳化，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為44-48小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時(shí)流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用0.2倍反應(yīng)液體積乙酸乙酯萃取反應(yīng)液萃取3次，合并有機(jī)相，有機(jī)相蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.8-99.4％，產(chǎn)品收率95.7-96.9％。

實(shí)施例2

培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。

生物催化反應(yīng)：150L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物1，2，3-3羥基苯，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為44-48小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時(shí)流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī)相，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率98.4％，產(chǎn)品收率96.1％。

實(shí)施例 3

培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。

生物催化反應(yīng)：1000L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物1，2，3-3羥基苯，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為44-48小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時(shí)流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，分別用0.2倍、0.15倍、0.1倍反應(yīng)液體積的乙酸乙酯萃取反應(yīng)液各萃取1次，合并有機(jī)相，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率97.8％，產(chǎn)品收率95.7％。

實(shí)施例 4

培養(yǎng)液成份及微生物發(fā)酵液制備同實(shí)施例1。

生物催化反應(yīng)：15000L發(fā)酵罐,即制備微生物發(fā)酵液發(fā)酵罐，在其發(fā)酵液中加入底物1，2，3-3羥基苯，使?jié)舛葹?0-95g/L，補(bǔ)加以下成份，使?jié)舛葹椋和聹?0 15-16g/L，木糖20-24g/L、蔗糖25-28g/L、麥芽糖12-15g/L、黑豆粉18-22 g/L，121℃高壓滅菌30分鐘；冷卻至36-37℃時(shí)，攪拌乳化，進(jìn)行生物催化反應(yīng)，反應(yīng)時(shí)間為44-48小時(shí)；反應(yīng)開始時(shí)，立即流加濃度為5％的NaHCO₃水溶液，同時(shí)流加濃度為1％的鹽酸水溶液，調(diào)節(jié)NaHCO₃與鹽酸水溶液的流加速率，維持pH6.1-6.4，所加入的物料均經(jīng)過滅菌處理；通氣比為0.7-0.8V/V?分鐘,即每分鐘通氣量為0.7-0.8倍反應(yīng)液體積，反應(yīng)結(jié)束后，破乳，用逆流萃取機(jī)萃取，萃取液為乙酸乙酯，蒸出有機(jī)相的乙酸乙酯，蒸出乙酸乙酯，得到產(chǎn)物2，3，5-3羥基-苯酸，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率99.4％，產(chǎn)品收率96.9％。