本發(fā)明屬于病毒分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離噬菌體用載體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的大密度養(yǎng)殖以及抗生素的廣泛使用，導(dǎo)致大量耐藥菌株出現(xiàn)，噬菌體作為一種更有效的治療手段，正越來越受到關(guān)注。因此，快速噬菌體分離是開展噬菌體治療研究首要的一步。噬菌體廣泛存在于自然環(huán)境中，凡是有細(xì)菌的場所，就可能有相應(yīng)噬菌體的存在。如在人和動(dòng)物的排泄物或污染的井水、河水中，就常有腸道菌的噬菌體。噬菌體也廣泛存在于海洋環(huán)境中，海洋中的細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌及真核微生物都發(fā)現(xiàn)有其相應(yīng)的噬菌體存在。

目前噬菌體的分離純化方法為直接法、間接法和誘導(dǎo)法，直接法指直接從宿主菌生活的生物體上取樣尋找噬菌體。間接法指根據(jù)對象菌的特性，從相應(yīng)的非生物環(huán)境中采集樣品尋找噬菌體，如對消化道致病菌，通常從人和動(dòng)物的排泄物或者生活污水中釆樣；水產(chǎn)致病菌，通常從養(yǎng)殖廢水或自然水域中分離。誘導(dǎo)法指利用對象菌感染相應(yīng)的生物，并取樣尋找噬菌體，與直接法類似，所不同的是有誘導(dǎo)這一步驟。誘導(dǎo)法的可行性在于對象菌可以從患病生物中分離，能夠更容易找到噬菌體。但是采用傳統(tǒng)的噬菌體分離方法，在噬菌體含量低于10²/m³的污水、底泥、海水中等分離噬菌體的成功率很低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種分離噬菌體用載體的制備方法，能夠提高噬菌體分離的成功率。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

一種分離噬菌體用載體，包括陶瓷類載體和負(fù)載在所述陶瓷類載體上的副溶血性弧菌。

本發(fā)明提供了上述技術(shù)方案所述的分離噬菌體用載體的制備方法，包括以下步驟：

1)將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到宿主菌培養(yǎng)液；

2)將陶瓷類載體浸沒于所述步驟1)得到的宿主菌培養(yǎng)液中，將浸泡后的陶瓷類載體干燥至含水率為45～55％，得到分離噬菌體用載體。

優(yōu)選的，所述步驟1)得到的宿主菌培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含量為10⁸～10¹²cfu/ml。

優(yōu)選的，所述步驟2)得到的陶瓷類載體上副溶血性弧菌的含菌量為10¹⁰～10¹⁶cfu/g。

優(yōu)選的，所述陶瓷類載體的孔隙率大于92％，所述陶瓷類載體的最大比表面積為350～450m²/m³。

優(yōu)選的，所述步驟2)中浸泡時(shí)，載體的質(zhì)量與宿主菌培養(yǎng)液的體積比為(0.5～1.5)g:(0.5～1.5)ml。

優(yōu)選的，所述步驟1)中培養(yǎng)的條件包括：所述培養(yǎng)的溫度為28～35℃，所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速為150～200rpm，所述培養(yǎng)的時(shí)間為14～24h。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案制備得到的載體在分離水體中噬菌體的應(yīng)用，包括：將上述技術(shù)方案制備得到的分離噬菌體用載體放入水體中3～7h，分離得到噬菌體。

優(yōu)選的，所述分離噬菌體用載體放入水體中的深度≤0.5～1.5m。

優(yōu)選的，所述分離噬菌體用載體放入水體中被取回后還包括：

將載體取回后再次放入宿主菌培養(yǎng)液中，得到噬菌體富集液；

將所述宿主菌培養(yǎng)液涂布于LB或NB平板上，再將所述噬菌體富集液滴于所述平板上，培養(yǎng)14～24h，得出分離結(jié)果。

本發(fā)明提供了一種分離噬菌體用載體，包括陶瓷類載體和負(fù)載在所述陶瓷類載體上的副溶血性弧菌。本發(fā)明利用載體可以附著大量副溶血弧菌的原理，通過水流的不斷流動(dòng)，與載體的巨大的比表面積接觸，大大增加了宿主菌與噬菌體相遇并吸附的幾率，從而捕獲噬菌體。采用本發(fā)明的分離噬菌體用的載體能夠快速分離海水、淡水和污水中副溶血性弧菌的噬菌體，分離的效率達(dá)到80％。經(jīng)鑒定分離到的噬菌體為副溶血弧菌噬菌體。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種分離噬菌體用載體，包括陶瓷類載體和負(fù)載在所述陶瓷類載體上的副溶血性弧菌。在本發(fā)明中，所述陶瓷類載體的孔隙率優(yōu)選大于92％，更優(yōu)選93～97％，最優(yōu)選為95％；所述陶瓷類載體的最大比表面積優(yōu)選為350～450m²/m³，更優(yōu)選為375～425m²/m³，最優(yōu)選為400m²/m³。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述陶瓷類載體的來源為市售產(chǎn)品，如昆山恒潤凈水設(shè)備有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為3-5的陶瓷類載體。

在本發(fā)明中，所述分離噬菌體用載體上副溶血性弧菌的含量優(yōu)選為10¹⁰～10¹⁶cfu/g，更優(yōu)選為10¹²～10¹⁴cfu/g，最優(yōu)選為10¹⁵cfu/g。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述的分離噬菌體用載體的制備方法，包括以下步驟：

1)將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到宿主菌培養(yǎng)液；

2)將陶瓷類載體浸沒于所述步驟1)得到的宿主菌培養(yǎng)液中，將浸泡后的陶瓷類載體干燥至含水率為45～55％，得到分離噬菌體用載體。

本發(fā)明將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到宿主菌培養(yǎng)液。在本發(fā)明中，所述宿主菌培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下含量的組分：牛肉膏1～8g/L、蛋白胨5～15g/L、氯化鈉15～55g/L、余量為水或酵母浸膏1～8g/L、胰蛋白胨5～15g/L、氯化鈉20～60g/L、余量為水；更優(yōu)選包括牛肉膏3～6g/L、蛋白胨8～12g/L、氯化鈉20～50g/L、余量為水或酵母浸膏3～6g/L、胰蛋白胨8～12g/L、氯化鈉25～55g/L、余量為水；最優(yōu)選包括牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉25～45g/L、余量為水或酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉30～50g/L、余量為水。

在本發(fā)明中，對所述宿主菌培養(yǎng)基在使用前優(yōu)選進(jìn)行滅菌，本發(fā)明對所述滅菌的方法沒有特殊限定，在實(shí)施例中可具體為115～121℃滅菌15～30min。

將所述副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，本發(fā)明對所述副溶血性弧菌的接種方法和接種量沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的接種方法和接種量即可。

在本發(fā)明中，所述副溶血性弧菌在宿主菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)優(yōu)選在振蕩條件下培養(yǎng)，所述培養(yǎng)的條件包括：所述所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為28～35℃，，更優(yōu)選為30～34℃，最優(yōu)選為31～33℃；所述培養(yǎng)的轉(zhuǎn)速優(yōu)選為150～200rpm，更優(yōu)選為160～190rpm，最優(yōu)選為170～180rpm；所述培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為14～24h，更優(yōu)選為16～22h，最優(yōu)選為18～20h。

在本發(fā)明中，所述培養(yǎng)完成后，所述宿主菌培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含菌量優(yōu)選為10⁸～10¹²cfu/ml，更優(yōu)選為10¹⁰～10¹¹cfu/ml。

得到宿主菌培養(yǎng)液，本發(fā)明將陶瓷類載體浸沒于所述步驟1)得到的宿主菌培養(yǎng)液中浸泡。在本發(fā)明中，所述陶瓷類載體的孔隙率優(yōu)選大于92％，更優(yōu)選93～97％，最優(yōu)選為95％；所述陶瓷類載體的最大比表面積優(yōu)選為350～450m²/m³，更優(yōu)選為375～425m²/m³，最優(yōu)選為400m²/m³。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述陶瓷類載體的來源為市售產(chǎn)品，如昆山恒潤凈水設(shè)備有限公司生產(chǎn)的型號(hào)為3-5的陶瓷類載體。

在本發(fā)明中，所述陶瓷類載體的質(zhì)量與所述宿主菌培養(yǎng)液的體積比優(yōu)選為(0.5～1.5)g:(0.5～1.5)ml，更優(yōu)選為(0.8～1.2)g:(0.8～1.2)ml，最優(yōu)選為1g:1ml。

在本發(fā)明中，所述陶瓷類載體在宿主菌培養(yǎng)液中浸泡的時(shí)間優(yōu)選為0.5～3h，更優(yōu)選為1～2.5h，最優(yōu)選為1.5～2h。

所述浸泡后，本發(fā)明將得到的陶瓷類載體干燥至含水率為45～55％，得到分離噬菌體用載體。在本發(fā)明中，所述含水率優(yōu)選為45～55％，更優(yōu)選為48～52％，最優(yōu)選為50％。

本發(fā)明優(yōu)選重復(fù)上述技術(shù)方案所述浸泡和干燥步驟1～5次，更優(yōu)選為2～4次，最優(yōu)選為3次，得到分離噬菌體用載體。

在本發(fā)明中，所述浸泡和干燥后，得到分離噬菌體用載體，所述分離噬菌體用載體上副溶血性弧菌的含量優(yōu)選為10¹⁰～10¹⁶cfu/ml，更優(yōu)選為10¹²～10¹⁴cfu/ml，最優(yōu)選為10¹⁵cfu/ml。

在本發(fā)明中，所述分離噬菌體用載體在使用前優(yōu)選用20～60目紗網(wǎng)進(jìn)行緊密包裹后，再放入水體中。所述紗網(wǎng)的粒度優(yōu)選為30～50目，更優(yōu)選為40目。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案制備得到的載體在分離水體中噬菌體的應(yīng)用，具體為將制備得到的分離噬菌體用載體放入水體中3～7h，分離得到噬菌體，所述放入水中的時(shí)間優(yōu)選為4～6h，最優(yōu)選為5h。

在本發(fā)明實(shí)施例中，所述水體的種類優(yōu)選為海水、淡水或污水。

在本發(fā)明中，所述分離噬菌體用載體放入水體中的深度優(yōu)選為≤0.5～1.5m，更優(yōu)選為≤0.8～1.2m，最優(yōu)選為≤1m。

本發(fā)明將所述分離優(yōu)選包括：

將所述載體取回再次放入宿主菌培養(yǎng)液中，得到噬菌體富集液；將所述宿主菌培養(yǎng)液涂布于LB或NB平板上，再將所述噬菌體富集液滴于所述平板上，培養(yǎng)14～24h，得出分離結(jié)果。

在本發(fā)明中，將所述取回的載體再次放入宿主菌培養(yǎng)液中進(jìn)行富集，所述富集的時(shí)間優(yōu)選為6～14h，更優(yōu)選為8～12h，最優(yōu)選為10～11h；所述富集的溫度優(yōu)選為20～40℃，更優(yōu)選為28～35℃，最優(yōu)選為30～32℃。

本發(fā)明將所述宿主菌培養(yǎng)液涂布于LB或NB平板上，所述LB或NB平板的直徑優(yōu)選為6～15cm，更優(yōu)選為8～12cm，最優(yōu)選為10cm；所述LB或NB平板的厚度優(yōu)選為3～15mm，更優(yōu)選為5～12mm，最優(yōu)選為8mm；所述宿主菌培養(yǎng)液涂布的量優(yōu)選為150～250μl，更優(yōu)選為180～220μl，最優(yōu)選為200μl。本發(fā)明將所述宿主菌培養(yǎng)液涂布于LB或NB平板上后靜置10～25min，優(yōu)選為15～20min，更優(yōu)選為16～18min；

將所述宿主菌培養(yǎng)液涂布于LB或NB平板上靜置后，再將所述噬菌體富集液滴2～5滴于所述平板上，優(yōu)選待所述噬菌體富集液被所述平板吸收后進(jìn)行培養(yǎng)。所述培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25～37℃，更優(yōu)選為28～35℃，最優(yōu)選為30～33℃；所述培養(yǎng)的時(shí)間優(yōu)選為14～24h，更優(yōu)選為16～22h，最優(yōu)選為18～20h。

在本發(fā)明中，所述平板上有噬菌斑出現(xiàn)，并且在出現(xiàn)噬菌斑后的24～48h內(nèi)，所述噬菌斑的直徑不超過3mm，表明本申請制備的分離噬菌體用載體分離到了副溶血性弧菌的噬菌體；若無噬菌斑出現(xiàn)，表明未分離到副溶血性弧菌的噬菌體。

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明提供的一種分離噬菌體用載體及其制備方法和應(yīng)用進(jìn)行詳細(xì)的說明，但是不能把它們理解為對本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

實(shí)施例1

在無菌條件下，將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為28℃、轉(zhuǎn)速為150rpm的條件下培養(yǎng)14h，得到宿主菌培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培養(yǎng)基為：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉30g/L、余量為水。

將陶瓷類載體浸泡于宿主菌培養(yǎng)液中2h，陶瓷類載體的質(zhì)量與宿主菌培養(yǎng)液的體積比為1g:1ml，浸泡后取出，在通風(fēng)的條件下干燥，使陶瓷類載體的含水率為50％，重復(fù)浸泡和干燥的步驟3次，再用40目紗網(wǎng)緊密包裹，得到分離噬菌體用載體。

將分離噬菌體用載體放入流動(dòng)的海水中4h，放入的深度為50cm，取回后再次放入宿主菌培養(yǎng)液中浸泡8h，浸泡溫度為28℃，得到噬菌體富集液；取200μl宿主菌培養(yǎng)液涂布于NB平板上，靜置15min后，滴3滴噬菌體富集液，在14h出現(xiàn)噬菌斑，噬菌斑的直徑為0.5mm，表明分離到副溶血性弧菌的噬菌體。

實(shí)施例2

在無菌條件下，將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為35℃、轉(zhuǎn)速為200rpm的條件下培養(yǎng)24h，得到宿主菌培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培養(yǎng)基為：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉30g/L、余量為水。

將陶瓷類載體浸泡于宿主菌培養(yǎng)液中1h，陶瓷類載體的質(zhì)量與宿主菌培養(yǎng)液的體積比為0.5g:1.5ml，浸泡后取出，在通風(fēng)的條件下干燥，使陶瓷類載體的含水率為40％，重復(fù)浸泡和干燥的步驟3次，再用54目紗網(wǎng)緊密包裹，得到分離噬菌體用載體。

將分離噬菌體用載體放入流動(dòng)的海水中6h，放入的深度為80cm，取回后再次放入宿主菌培養(yǎng)液中浸泡12h，浸泡溫度為35℃，得到噬菌體富集液；取200μl宿主菌培養(yǎng)液涂布于NB平板上，靜置20min后，滴3滴噬菌體富集液，在24h出現(xiàn)噬菌斑，噬菌斑的直徑為0.5mm，表明分離到副溶血性弧菌的噬菌體。

實(shí)施例3

在無菌條件下，將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為30℃、轉(zhuǎn)速為180rpm的條件下培養(yǎng)16h，得到宿主菌培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培養(yǎng)基為：酵母浸膏5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化鈉30g/L、余量為水。

將陶瓷類載體浸泡于宿主菌培養(yǎng)液中1.5h，陶瓷類載體的質(zhì)量與宿主菌培養(yǎng)液的體積比為1.5g:0.5ml，浸泡后取出，在通風(fēng)的條件下干燥，使陶瓷類載體的含水率為60％，重復(fù)浸泡和干燥的步驟3次，再用60目紗網(wǎng)緊密包裹，得到分離噬菌體用載體。

將分離噬菌體用載體放入流動(dòng)的污水中5h，放入的深度為90cm，取回后再次放入宿主菌培養(yǎng)液中浸泡10h，浸泡溫度為30℃，得到噬菌體富集液；取200μl宿主菌培養(yǎng)液涂布于NB平板上，靜置18min后，滴2滴噬菌體富集液，在16h出現(xiàn)噬菌斑，噬菌斑的直徑為0.5mm，表明分離到副溶血性弧菌的噬菌體。

實(shí)施例4

在無菌條件下，將副溶血性弧菌接種于宿主菌培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，在培養(yǎng)溫度為32℃、轉(zhuǎn)速為190rpm的條件下培養(yǎng)18h，得到宿主菌培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中副溶血性弧菌的含量在10⁸cfu/ml以上；宿主菌培養(yǎng)基為：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉30g/L、余量為水。

將陶瓷類載體浸泡于宿主菌培養(yǎng)液中2h，陶瓷類載體的質(zhì)量與宿主菌培養(yǎng)液的體積比為1g:1ml，浸泡后取出，在通風(fēng)的條件下干燥，使陶瓷類載體的含水率為50％，重復(fù)浸泡和干燥的步驟3次，再用45目紗網(wǎng)緊密包裹，得到分離噬菌體用載體。

將分離噬菌體用載體放入流動(dòng)的淡水中5h，放入的深度為60cm，取回后再次放入宿主菌培養(yǎng)液中浸泡11h，浸泡溫度為32℃，得到噬菌體富集液；取200μl宿主菌培養(yǎng)液涂布于NB平板上，靜置15min后，滴5滴噬菌體富集液，在18h出現(xiàn)噬菌斑，噬菌斑的直徑為0.5mm，表明分離到副溶血性弧菌的噬菌體。

由以上實(shí)施例可知，采用本發(fā)明的分離噬菌體用的載體能夠快速分離海水、淡水和污水中副溶血性弧菌的噬菌體，分離的效率為達(dá)到80％。經(jīng)鑒定分離到的噬菌體為副溶血弧菌噬菌體。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。