本發(fā)明涉及農(nóng)作物病毒病害傳播介體的分子檢測技術(shù)，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)是一種禾本科植物根部的專性寄生低等真核生物，自身對植物的生長不會(huì)產(chǎn)生明顯的危害，但是它作為至少11種病毒的傳播介體，傳播的病毒可以在小麥、大麥、水稻等作物上引起多種病毒病害。因其活體寄生特性，不能進(jìn)行室內(nèi)離體培養(yǎng)，休眠孢子壁厚，抗逆性強(qiáng)，能在土壤中存活十多年，導(dǎo)致對禾谷多黏菌的研究十分困難，進(jìn)展緩慢。通過世界范圍內(nèi)的大量采樣和鑒定，明確了禾谷多黏菌傳播的麥類病毒主要隸屬于Bymovirus屬和Furovirus屬。在我國的冬麥區(qū)，禾谷多黏菌主要傳播小麥上的小麥黃花葉病毒(WYMV)和中國小麥花葉病毒(CWMV)，引起小麥植株分蘗減少，矮化發(fā)黃等癥狀，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致減產(chǎn)50-70％，危害巨大。

多黏菌下有兩個(gè)種，禾谷多黏菌和甜菜多黏菌。這兩個(gè)物種最初主要是通過形態(tài)及宿主區(qū)分，禾谷多黏菌主要侵染禾本科作物，而甜菜多黏菌的寄主則是藜科植物。由于禾谷多黏菌基因組信息未知，目前其種下的分類主要依賴于核糖體DNA(rDNA)的ITS1和ITS2區(qū)域序列。1994年Ward等利用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)技術(shù)，首次通過ITS區(qū)分了這兩種多黏菌，同時(shí)通過序列分析發(fā)現(xiàn)禾谷多黏菌存在兩種核糖體分型。隨后，Ward和Adams在印度高粱上發(fā)現(xiàn)了禾谷多黏菌的第三種分型。隨著越來越多的禾谷多黏菌ITS的揭示，Ward等將非洲地區(qū)、亞洲日本地區(qū)樣品和其余地區(qū)已知的禾谷多黏菌ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析后發(fā)現(xiàn)目前共有6種禾谷多黏菌分型(I型–VI型)。2003年Legreve及她同事的研究則表明禾谷多黏菌的分型依據(jù)除了ITS序列外，不同地區(qū)來源的禾谷多黏菌分型對宿主及溫度也有不同要求，在分型中也需予以考慮。來源于印度的禾谷多黏菌在高粱上完成整個(gè)生活史的最佳溫度是27-30℃，23-26℃休眠孢子的萌發(fā)及各個(gè)階段的發(fā)育速度減緩，19-22℃侵染不顯著，19℃以下無侵染。而溫帶地區(qū)來源的禾谷多黏菌在大麥上的最佳溫度是15-18℃，19-22℃侵染率明顯降低，22℃以上侵染不顯著。因此，Legreve根據(jù)其研究結(jié)果對禾谷多黏菌進(jìn)行分型的時(shí)候除考慮ITS序列外，還加入了宿主及溫度因素，將禾谷多黏菌分為了五種類型(f.sp.temperate,f.sp.tepida,f.sp.tropicalis,f.sp.subtropicalis,f.sp.colombiana)。雖然目前這兩個(gè)分類系統(tǒng)未統(tǒng)一，但其對應(yīng)關(guān)系非常明顯。

雖然早在上世紀(jì)80年代已經(jīng)明確我國冬小麥區(qū)的小麥黃花葉病的傳播媒介是土壤中的禾谷多黏菌，但對禾谷多黏菌的研究極少，我國禾谷多黏菌存在哪些分型目前也未知，同時(shí)不清楚其分型與傳播的小麥病毒種類是否有關(guān)。因此，明確我國小麥黃花葉病爆發(fā)區(qū)域禾谷多黏菌的分型有助于為土傳小麥黃花葉病的防控提供依據(jù)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本研究提供了一種中國禾谷多黏菌分型快速鑒定和區(qū)分的方法。根據(jù)禾谷多黏菌核糖體DNA序列，利用已知的禾谷多黏菌引物對我國的冬麥區(qū)小麥根部DNA進(jìn)行擴(kuò)增，篩選適用于我國禾谷多黏菌分型的引物，同時(shí)針對我國特有的禾谷多黏菌分型設(shè)計(jì)特異性的反向引物ITS.CN，并對PCR的反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件作大量優(yōu)化，最終獲得能穩(wěn)定擴(kuò)增和鑒別我國兩種禾谷多黏菌分型的方法。

本發(fā)明的研究人員首先利用歐洲地區(qū)檢測禾谷多黏菌核糖體DNA(rDNA)ITS2區(qū)域的通用引物PSP2(f)和ITS4(r)對源于我國小麥黃花葉病區(qū)的小麥根部基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增(PCR產(chǎn)物約250bp)，擴(kuò)增產(chǎn)物測序并根據(jù)ITS2區(qū)域進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，初步明確我國冬麥區(qū)禾谷多黏菌至少存在兩種分型，一種和已報(bào)道的I型具有一定同源性，為我國特有的分型，命名為I-CN型菌，另一種為II型菌。為進(jìn)一步得到禾谷多黏菌rDNA的完整ITS序列(包括ITS1和ITS2)用于區(qū)分兩種菌型，使用歐洲地區(qū)已報(bào)道的ITS序列的通用正向引物NS5(f)，NS7(f)，PSP1(f)，ITS5(f)和反向引物ITS4(r)組合進(jìn)行擴(kuò)增。但主要擴(kuò)增到小麥的rDNA序列，均未能穩(wěn)定特異地?cái)U(kuò)增到禾谷多黏菌ITS序列。因此，本發(fā)明的研究人員設(shè)計(jì)了大量的引物，最終篩選得到一條反向引物ITS.CN(r)，利用正向引物NS7擴(kuò)增包含ITS1的約800bp序列，可以用于檢測I-CN型菌的特異性引物。另外，利用II型菌引物Pg.F2(f)和Pg.R2(r)擴(kuò)增得到II型菌特異的ITS序列，PCR產(chǎn)物長度為430bp。具體的本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1.樣品的采集

采集田間發(fā)病小麥樣品，通過RT-PCR檢測葉片病毒以及顯微鏡觀察根部禾谷多黏菌的休眠孢子情況，明確樣品根部含有禾谷多黏菌。

2.我國禾谷多黏菌分型的確定

首先利用引物組合PSP2(f)和ITS4(r)擴(kuò)增小麥根部禾谷多黏菌ITS2序列，測序明確具體的擴(kuò)增序列，利用NCBI上已知的禾谷多黏菌分型構(gòu)建進(jìn)化樹，明確我國禾谷多黏菌分型為I-CN型和II型。

3.分型的特異性引物設(shè)計(jì)

根據(jù)我國特有的分型I-CN型的序列特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物ITS.CN(r)，結(jié)合正向引物NS7(f)PCR特異性擴(kuò)增I-CN型。利用Pg.F2(f)和Pg.R2(r)PCR特異性擴(kuò)增II型菌。

4.引物的特異性驗(yàn)證

提取含有不同分型禾谷多黏菌的小麥病根總DNA作為模版PCR擴(kuò)增驗(yàn)證引物特異性，最終明確檢測禾谷多黏菌的特異性引物為PSP2(f)和ITS4(r)，檢測禾谷多黏菌I型菌的特異性引物為Ns7(f)和ITS.CN(r)，檢測禾谷多黏菌II型菌的特異性引物為Pg.F2(f)和Pg.R2(r)。

5.反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件的優(yōu)化

對影響PCR擴(kuò)增的各個(gè)條件：包括退火溫度、引物濃度、HiFi DNA聚合酶濃度、dNTP濃度、延伸時(shí)間及循環(huán)次數(shù)等方面進(jìn)行優(yōu)化，最終確定適合本研究的最佳PCR體系為：10×PCR Buffer 1μL，dNTP 2mM 1μL，上游引物10μM 0.25μL，下游引物10μM 0.25μL，DNA 1.0μL，HiFi DNA polymerase 5U/μL 0.25μL，ddH2O 6.25μL，終體積為10μL；最佳PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火50s，72℃延伸時(shí)間根據(jù)引物不同分別為：PSP2(f)和ITS4(r)延伸20s，Ns7(f)和ITS.CN(r)延伸60s，Pg.F2(f)和Pg.R2(r)延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

5.在研究中的應(yīng)用

應(yīng)用該技術(shù)對我國冬小麥區(qū)的禾谷多黏菌分型情況進(jìn)行了較全面的調(diào)查，樣品來源包括山東、河南、江蘇、安徽和湖北五個(gè)省份土傳小麥黃花葉病病區(qū)的66個(gè)小麥病根樣品，明確了各地樣品帶禾谷多黏菌及其分型的情況。

采用本發(fā)明的技術(shù)方案，可以獲得如下的技術(shù)效果：

1.獲得了鑒定禾谷多黏菌I-CN型和II型的特異性引物；

2.獲得了穩(wěn)定的檢測禾谷多黏菌I-CN型和II型菌的PCR體系。

附圖說明

圖1用于檢測的三對引物在禾谷多黏菌核糖體DNA上的位置示意圖(PSP2和ITS4為禾谷多黏菌特異性引物；NS7和ITS.CN為禾谷多黏菌I-CN型特異性引物；Pg.F2和Pg.R2為禾谷多黏菌II型特異性引物；→表示正向引物；←表示反向引物)

圖2禾谷多黏菌分型特異性引物的樣品檢測效果(M：Marker；a：PSP2/ITS4引物組合特異性擴(kuò)增禾谷多黏菌；NS7/ITS.CN引物組合特異性擴(kuò)增I-CN型禾谷多黏菌；Pg.F2/Pg.R2引物組合特異性擴(kuò)增II型禾谷多黏菌；樣品A：I-CN型禾谷多黏菌侵染的小麥根部；樣品B：I-CN型和II型禾谷多黏菌共同侵染的小麥根部；樣品C：無禾谷多黏菌侵染的小麥根部；樣品D：空白對照(H₂O))

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式的詳細(xì)描述來進(jìn)一步闡明本發(fā)明，但并不是本發(fā)明的限制，僅僅作示例說明。

實(shí)施例1：特異性引物的設(shè)計(jì)、合成及PCR初步檢測

根據(jù)已報(bào)道的禾谷多黏菌通用和分型特異性引物序列設(shè)計(jì)如下正向引物：NS5，NS7，PSP1，ITS5，PSP2，Pg.F2；以及反向引物：ITS4，Pg.R2。初步PCR檢測病區(qū)小麥根部樣品后，將電泳出現(xiàn)條帶的序列進(jìn)行割膠回收并連接T載體測序。引物的配對、序列及初步的PCR結(jié)果如下表1所示：

表1本研究所用引物序列及其PCR結(jié)果

注：引物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

測序結(jié)果表明禾谷多黏菌通用引物PSP2(f)/ITS4(r)能順利擴(kuò)增到禾谷多黏菌rDNA ITS2序列，對我國冬麥區(qū)大量小麥樣品(五省共66份樣品，詳見實(shí)施例3)的ITS2測序結(jié)果分析初步明確我國冬麥區(qū)禾谷多黏菌至少存在兩種分型，一種和已報(bào)道的I型具有一定同源性，為我國特有的分型，命名為I-CN型菌，另一種為II型菌。Pg.F2(f)/Pg.R2(r)同樣能特異性的擴(kuò)增到禾谷多黏菌序列(II型)。

同時(shí)，NS5(f)/ITS4(r)，NS7(f)/ITS4(r)，PSP1(f)/ITS4(r)，ITS5(f)/ITS4(r)，PSP2(f)/ITS4(r)引物組合雖然能順利擴(kuò)增到正確大小條帶，但測序結(jié)果為小麥rDNA，而非禾谷多黏菌rDNA。進(jìn)一步的序列比對結(jié)果表明，反向引物ITS4序列和小麥rDNA上的一段序列完全匹配。因此雖然已報(bào)道的ITS4序列在歐洲能廣泛應(yīng)用于禾谷多黏菌檢測，但在我國小麥上不適用，這可能是因?yàn)槟壳皻W洲用于禾谷多黏菌檢測的作物主要為大麥、黑麥等作物，而非小麥。

基于以上結(jié)果，根據(jù)小麥與禾谷多黏菌I-CN型rDNA序列的同源性，在兩者的差異位置設(shè)計(jì)了一條反向引物ITS.CN，利用正向引物NS7擴(kuò)增包含禾谷多黏菌ITS1的約800bp序列，用于檢測I-CN型菌的特異性引物(見表1)。因此，通過對禾谷多黏菌引物的篩選，獲得了用于我國禾谷多黏菌檢測的通用引物PSP2(f)/ITS4(r)，新發(fā)現(xiàn)的我國I-CN型禾谷多黏菌特異性引物NS7(f)/ITS.CN(r)，以及II型菌的特異性引物Pg.F2(f)/Pg.R2(r)。

實(shí)施例2：建立檢測禾谷多黏菌及其分型的PCR體系與條件

剪取干病根每份30mg，采用TIANGEN公司的DNAsecure Plant Kit試劑盒方法提取小麥病根樣品的總DNA，溶于50μL ddH2O中。

進(jìn)行50μL體系的PCR反應(yīng)，體系為：10×PCR Buffer 5μL，dNTP 2mM 5μL，上游引物10μM 1.25μL，下游引物10μM 1.25μL，DNA5μL，HiFi DNA polymerase 5U/μL 0.5μL，ddH2O 32μL，終體積為50μL；PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火50s，72℃延伸時(shí)間根據(jù)引物不同分別為：PSP2(f)和ITS4(r)延伸20s，Ns7(f)和ITS.CN(r)延伸60s，Pg.F2(f)和Pg.R2(r)延伸30s，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析并在紫外燈下觀察，可以觀察到引物PSP2(f)和ITS4(r)擴(kuò)增出的條帶大小約為250bp，引物Ns7(f)和ITS.CN(r)擴(kuò)增出的條帶大小約為800bp，引物Pg.F2(f)和Pg.R2(r)擴(kuò)增出的條帶大小約為430bp。

分別將特異性片段進(jìn)行凝膠回收，進(jìn)行克隆轉(zhuǎn)化，將獲得的陽性克隆交由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序分析。測序結(jié)果分別為：

引物PSP2(f)和ITS4(r)的擴(kuò)增序列(SEQ ID NO：10)：

TTGCGCTTTCGAGAGCCCTCGGAAGCATGCCTCTCTGAGTATCGGTTTCTATATCTCTCACATACTCACTGGTGGTGTGTGTGGTGGAGAATGGGAGTTGCGCACGTCTCTCTGCATCTCCTGAAGTCAGCGTCGGCCGAAGTCCATCGGGTTCTTGGAACGATAATCCGTCATGGCGCCCAAACCATACACAAAAGATCTCAGATGAGGTAAGACTACCCGCCGAATTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA

引物Ns7(f)和ITS.CN(r)的擴(kuò)增序列(SEQ ID NO：11)：

GAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACAATGCTAGGTTCAACGAGTCGATTTCGTACTTGGCCGAGAGGCCTGGTTAATCTTCTGAAATCCTAGCGTGCTTGGGCTTGCCTCTTGCAACTAGAGGCACCAACGAGGAATTCCTAGTAGACGCAGGTCATCAACCTGCATCGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTTCTACCGATTGGTCGTCCCGGTGAACAATCGGGAGGCCGTGCTCATGGTCAGCAATGGCCGGAGCGCGGTCGAACTTTTGTAAATTTGGACGACTAGAGGAAGAAGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTAGCGTTGATTGGTCTTGGTGCCATGCGAAAAACATGTGGATCGTGGGCTATGTGACCCCTCTGTGGGGGGTATTTTGTCGCGAACTTGGAGATTTGGCTGATGGATATACATGATAGATAAACAAAATACAACTCTTAGCAATGGATATCTTGGTTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTTTCGAGAGCCCTCGGAAGCATGCCTCTCTGAGTATCGGTTTCTATATCTCTCACACACTCACTGGTGGTGTGTGTGGTGGAGAATGGGAGTTGCGCACGTCTCTCTGCATCTCCTGAAGTCAGCGTCGGCCGAAGTCCATCGGGTTCTTGGAACGATAATCCGC

引物Pg.F2(f)和Pg.R2(r)的擴(kuò)增序列(SEQ ID NO：12)：

ATGTGGATCGTCTCTGTTGCTGGATACCGGGATGGAACGCCCTCGTGGTGGTTCTTGTCTTTCACGAATTGGATCAAACGGTGGCTAAAGTCGAATTGGTTTCATAACCTACAAACAATATATACAACTCTTAGCAATGGATATCTTGGTTCCCACAACGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATACGTAATGCGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCAAGTTGCGCTTTCGAGAGCCCTCGGAAGCATGCCTCTCTGAGTATCGGTTTCCCATCTCACACCCGGTGTGGAGAATGAGGGTCGGGCGCCTCGGCGCCGGTCCCTTCAAATCAGGCCGGCCTGGTCAAGTCCATCGGATTGCTGGTACGATAGTCCGTCATGGCGCAAGGAACCACTTGGCAAGATCTCAGATGAGG

實(shí)施例3：

本發(fā)明中的檢測方法在實(shí)際研究中的應(yīng)用

利用該技術(shù)檢測了包括來自山東、河南、江蘇、安徽、湖北五個(gè)省份小麥黃葉病病區(qū)的62個(gè)小麥病根樣品，明確了各地樣品帶禾谷多黏菌及其I型和II型菌的情況。從表中可以看出，在這五個(gè)省份中都分布有I型禾谷多黏菌，少部分地點(diǎn)同時(shí)分布有II型菌，但是并沒有發(fā)現(xiàn)單獨(dú)存在II型菌的情況。

氨基酸序列表

<110> 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院

<120> 一種我國小麥根部禾谷多黏菌分型及其鑒定的方法

<130> NKY001

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NS5(f)

<400> 1

aacttaaagg aattgacgga ag 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ITS4(r)

<400> 2

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> NS7(f)

<400> 3

gaggcaataa caggtctgtg atg 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PSP1(f)

<400> 4

tagacgcagg tcatcaacct 20

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ITS5(f)

<400> 5

ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> PSP2(f)

<400> 6

ttgcgctttc gagagccct 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pg.F2(f)

<400> 7

ttgcgctttc gagagccct 19

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Pg.R2(r)

<400> 8

cctcatctga gatcttgcca agt 23

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> ITS.CN(r)

<400> 9

gcggattatc gttccaagaa 20

<210> 10

<211> 252

<212> DNA

<213> 禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）

<400> 10

ttgcgctttc gagagccctc ggaagcatgc ctctctgagt atcggtttct atatctctca 60

catactcact ggtggtgtgt gtggtggaga atgggagttg cgcacgtctc tctgcatctc 120

ctgaagtcag cgtcggccga agtccatcgg gttcttggaa cgataatccg tcatggcgcc 180

caaaccatac acaaaagatc tcagatgagg taagactacc cgccgaattt aagcatatca 240

ataagcggag ga 252

<210> 11

<211> 798

<212> DNA

<213> 禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）

<400> 11

gaggcaataa caggtctgtg atgcccttag atgttctggg ccgcacgcgc gctacaatgc 60

taggttcaac gagtcgattt cgtacttggc cgagaggcct ggttaatctt ctgaaatcct 120

agcgtgcttg ggcttgcctc ttgcaactag aggcaccaac gaggaattcc tagtagacgc 180

aggtcatcaa cctgcatcga ttacgtccct gccctttgta cacaccgccc gtcgcttcta 240

ccgattggtc gtcccggtga acaatcggga ggccgtgctc atggtcagca atggccggag 300

cgcggtcgaa cttttgtaaa tttggacgac tagaggaaga agaagtcgta acaaggtttc 360

cgtaggtgaa cctgcggaag gatcattagc gttgattggt cttggtgcca tgcgaaaaac 420

atgtggatcg tgggctatgt gacccctctg tggggggtat tttgtcgcga acttggagat 480

ttggctgatg gatatacatg atagataaac aaaatacaac tcttagcaat ggatatcttg 540

gttcccacaa cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgatacgt aatgcgaatt gcagaattca 600

gtgaatcatc gaatctttga acgcaagttg cgctttcgag agccctcgga agcatgcctc 660

tctgagtatc ggtttctata tctctcacac actcactggt ggtgtgtgtg gtggagaatg 720

ggagttgcgc acgtctctct gcatctcctg aagtcagcgt cggccgaagt ccatcgggtt 780

cttggaacga taatccgc 798

<210> 12

<211> 430

<212> DNA

<213> 禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）

<400> 12

atgtggatcg tctctgttgc tggataccgg gatggaacgc cctcgtggtg gttcttgtct 60

ttcacgaatt ggatcaaacg gtggctaaag tcgaattggt ttcataacct acaaacaata 120

tatacaactc ttagcaatgg atatcttggt tcccacaacg atgaagaacg cagcgaaatg 180

cgatacgtaa tgcgaattgc agaattcagt gaatcatcga atctttgaac gcaagttgcg 240

ctttcgagag ccctcggaag catgcctctc tgagtatcgg tttcccatct cacacccggt 300

gtggagaatg agggtcgggc gcctcggcgc cggtcccttc aaatcaggcc ggcctggtca 360

agtccatcgg attgctggta cgatagtccg tcatggcgca aggaaccact tggcaagatc 420

tcagatgagg 430