1.一種犬松弛素原重組蛋白的制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟1、以北京犬前松弛素原基因cDNA的克隆質(zhì)粒pMD19-T-preprorelaxin為材料,提取質(zhì)粒DNA,以P1和P2作為擴(kuò)增用引物,擴(kuò)增出犬松弛素原基因cDNA;
步驟2、構(gòu)建含有步驟1的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆載體pMD19-T-prorelaxin,所述犬松弛素原基因cDNA序列如SEQ ID NO.1所示;
步驟3、將步驟2獲得的克隆載體pMD19-T-prorelaxin加入到冰預(yù)冷的DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中,接種于5ml含濃度為100μg/ml AMP的LB培養(yǎng)基,37℃震蕩培養(yǎng)過夜,同時(shí)培養(yǎng)表達(dá)質(zhì)粒pET28a的菌株,并用BamHI與XhoI雙酶切,進(jìn)行連接與轉(zhuǎn)化,得到pET28a-prorelaxin表達(dá)菌;
步驟4、培養(yǎng)pET28a-prorelaxin表達(dá)菌,使用IPTG誘導(dǎo)pET28a-prorelaxin表達(dá)菌,產(chǎn)生粗重組犬松弛素原蛋白;
步驟5、采用親和層析純化粗重組犬松弛素原蛋白,在200-500 mM咪唑處洗脫獲得高濃度蛋白,所述重組犬松弛素原蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬松弛素原重組蛋白的制備方法,其特征在于,所述步驟1中PCR 擴(kuò)增引物具體為:上游引物P1:5'- GCGGATCCATGACGGATGACAA-3',其堿基序列如SEQ ID NO.3所示;下游引物P2:5'- GCCTCGAGTCAGCATCGGCTAG-3',其堿基序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬松弛素原重組蛋白的制備方法,其特征在于,所述構(gòu)建pMD19-T-prorelaxin克隆載體的連接體系為:膠回收純化產(chǎn)物5.0 μL,載體0.5 μL,溶液I 4.5 μL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬松弛素原重組蛋白的制備方法,其特征在于,所述步驟3中酶切體系為:pMD19-T-prorelaxin或pET28a 20.0μL,BamHI5.0μL,XhoI5.0μL,10×Kbuffer 5.0μL,ddH2O15.0μL,37℃作用4h。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的犬松弛素原重組蛋白的制備方法,其特征在于,所述pET28a-prorelaxin表達(dá)菌的培養(yǎng)具體為:挑取單菌落于10ml LB 培養(yǎng)基中,37℃ 震蕩培養(yǎng)過夜;1%過夜培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接于1000 ml LB培養(yǎng)基, 37℃震蕩培養(yǎng)3小時(shí),然后加入 1 mM IPTG,25℃誘導(dǎo)5小時(shí);離心收集1000ml表達(dá)目標(biāo)蛋白的大腸桿菌培養(yǎng)物,于40ml裂解緩沖液中超聲波裂解細(xì)菌,離心后分別收集沉淀和上清;將沉淀用NTAU溶解,離心后取上清液,上樣于預(yù)先平衡好的NTA純化柱,其中,NTA純化柱為5ml NTA 介質(zhì),10倍柱體積NTAU-0緩沖液平衡;樣品上樣完成后,使用NATU-0緩沖液洗柱8-10個(gè)柱體積;順序使用NATU-X 緩沖液分別洗柱1 個(gè)柱體積,X為不同濃度咪唑;分步收集不同組分并電泳檢測(cè),收集得到重組犬松弛素原蛋白。
6.一種犬松弛素原的多克隆抗體制備方法,其特征在于,包括以下步驟:
步驟1、采用權(quán)利要求1-5中任一權(quán)利要求制備重組犬松弛素原蛋白;
步驟2、以步驟1中的重組犬松弛素原蛋白為抗原,對(duì)新西蘭家兔進(jìn)行免疫處理;
步驟3、對(duì)新西蘭家兔頸動(dòng)脈取血,收集血清,血清經(jīng)Protein A柱純化,得到特異性針對(duì)目標(biāo)蛋白的抗體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的犬松弛素原的多克隆抗體制備方法,其特征在于,所述步驟2中對(duì)新西蘭家兔免疫處理具體為:采用重組犬松弛素原蛋白作為免疫抗原,分裝保存于4℃,第1天,取1ml抗原加入1ml弗氏完全佐劑,乳化,頸背部皮下至少分8點(diǎn)注射,免疫2只新西蘭家兔;第15天,取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐劑,乳化,頸背部皮下至少分8點(diǎn)注射,免疫2只新西蘭家兔;第29天,取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐劑,乳化,頸背部皮下至少分8點(diǎn)注射,免疫2只新西蘭家兔;第43天,取1ml抗原加入1ml弗氏不完全佐劑,乳化,頸背部皮下至少分8點(diǎn)注射,免疫2只新西蘭家兔;第53天,頸動(dòng)脈取血,處死免疫家兔;兔血在4℃靜置過夜,于4℃,10000rpm條件下離心30分鐘,收集上清,即得血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的犬松弛素原的多克隆抗體制備方法,其特征在于,所述步驟3中血清純化具體為:血清經(jīng)0.45um濾膜過濾;取出protein A柱,用10倍柱體積PBS平衡,待PBS流干后,血清上樣過柱,收集流出液;5倍柱體積PBS平衡,流干后,加入5倍柱體積的0.1M的PH2.5甘氨酸溶液,收集洗脫液,每管1ml,預(yù)先加入90ul 1M pH8.8的Tris溶液中和;加入10倍柱體積PBS平衡,流干后加入2倍柱體積的20%乙醇,4℃保存柱子;收集洗脫液,完成純化。