本發(fā)明涉及一種植物防御素的重組表達(dá)方法，尤其是涉及一種重組博落回防御素功能蛋白，以及利用釀酒酵母表達(dá)重組博落回防御素功能蛋白的制備方法，以及博落回防御素的應(yīng)用研究。

背景技術(shù)：

防御素是一種遍布于動植物中的陽離子抗菌肽，是生物體長期進(jìn)化的自身防御體系的重要組成部分，其大小約為5kDa，含有6個或者8個保守半胱氨酸殘基，能直接作用于病原菌，是生物先天免疫系統(tǒng)中的重要物質(zhì)。根據(jù)分子結(jié)構(gòu)和來源的不同，可分為五類：哺乳動物α-防御素，β-防御素，θ-防御素，昆蟲防御素和植物防御素。

植物防御素是一類陽離子肽，是植物內(nèi)免疫系統(tǒng)的主要成分之一，參與了多種植物生理生化活動。植物防御素含8個保守半胱氨酸，形成4對鏈內(nèi)二硫鍵來穩(wěn)定其3條反向平行的β折疊片和1個α螺旋，構(gòu)成所謂的Csαβ模體結(jié)構(gòu)。植物防御素具有抑制真菌和細(xì)菌生長、抑制酶的活性、抑制癌細(xì)胞增殖和作為離子通道阻斷劑等功能。

博落回屬于罌粟科草本植物，是我國傳統(tǒng)中草藥，具有抑菌殺蟲的功效。由于罌粟科植物大多富含生物堿而備受關(guān)注。目前關(guān)于罌粟科植物的研究也主要集中在其生物堿，博落回的研究亦是如此。

朱鵬程于2013年發(fā)表的“博落回葉片cDNA文庫的構(gòu)建及EST分析” ([D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2013.)，公開了構(gòu)建博落回葉片cDNA文庫的構(gòu)建以及初步的EST分析，但未報道博落回防御素的相關(guān)基因；李賽于2014年發(fā)表的《博落回葉cDNA文庫表達(dá)序列標(biāo)簽分析和防御素重組表達(dá)》（[D]. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2014.），公開了對博落回防御素基因的分析以及對預(yù)測的五種防御素前體中的McDef1和McDef5的基因序列，并采用大腸桿菌原核重組表達(dá)和畢赤酵母真核重組表達(dá)，其中包含的目的蛋白片段是前體蛋白去掉信號肽，包括中間肽和成熟肽；對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，畢赤酵母表達(dá)產(chǎn)物未見相應(yīng)的目的蛋白，僅采用pET32表達(dá)的產(chǎn)物有明顯的含目的基因產(chǎn)物的蛋白，是融合蛋白，還需進(jìn)一步采用蛋白酶酶切才能產(chǎn)生目的蛋白分子；大腸桿菌表達(dá)和畢赤酵母表達(dá)均未表達(dá)得到有活性的重組博落回防御素功能蛋白。以上重組表達(dá)方法中，由于博落回防御素的中間肽和成熟肽之間的剪切位點(diǎn)尚未明確，將兩者一起同時表達(dá)時，中間肽的存在可能對表達(dá)產(chǎn)物的活性產(chǎn)生了負(fù)面影響。

因此，鑒于博落回防御素的優(yōu)良性能和廣泛的應(yīng)用市場，亟需準(zhǔn)確確定中間肽和成熟肽的分割位點(diǎn)，并在此基礎(chǔ)上提供一種高效的博落回防御素功能蛋白的重組表達(dá)方法，并進(jìn)一步對博落回防御素重組菌發(fā)酵工藝的優(yōu)化以及發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種博落回防御素功能蛋白，以及高效表達(dá)博落回防御素功能蛋白、操作簡單、易于產(chǎn)業(yè)化的重組博落回防御素功能蛋白的制備方法；確定采用重組菌大量表達(dá)博落回防御素的發(fā)酵工藝，以及發(fā)酵產(chǎn)物的應(yīng)用。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：

一種重組博落回防御素功能蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1）構(gòu)建含博落回防御素功能蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體；

2）將步驟1）得到重組表達(dá)載體熱擊轉(zhuǎn)化至釀酒酵母S78構(gòu)建重組菌；

3）重組菌在YSD液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，表達(dá)獲得博落回防御素功能蛋白。

進(jìn)一步，所述博落回防御素功能蛋白編碼基因，由核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步，所述博落回防御素功能蛋白，其氨基酸序列分別如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的McDef1和/或McDef2，編碼McDef1、McDef2的核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示。

進(jìn)一步，所述博落回防御素功能蛋白的重組表達(dá)載體為釀酒酵母表達(dá)載體pVT102U/α。

進(jìn)一步，所述博落回防御素功能蛋白的重組菌為釀酒酵母S78。

進(jìn)一步，所述步驟1）中構(gòu)建重組表達(dá)載體的具體操作，包括引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增、獲得目的片段和構(gòu)建重組表達(dá)載體。

進(jìn)一步，所述引物設(shè)計根據(jù)表達(dá)載體pVT102U/α上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計時添加了Xba I 酶切位點(diǎn)，在Xba I 酶切位點(diǎn)前加有保護(hù)性堿基；下游引物設(shè)計在基因末端，并加上Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)，在Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)前加有保護(hù)性堿基，所設(shè)置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分別為：

博落回防御素McDef1基因上游引物：

5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’Xba I 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef1基因下游引物：

5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’ Hind III 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef2基因上游引物：

5’-CCGctcgag aaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’Xba I 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef2基因下游引物：

5’- GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’ Hind III 酶切位點(diǎn)。

進(jìn)一步，所述PCR擴(kuò)增：以cDNA文庫中測序的相應(yīng)單克隆質(zhì)粒為模板，加入Taq DNA 聚合酶、博落回防御素McDef1 上/下游引物、 dNTPs進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，PCR 的反應(yīng)體系為：10×Taq Buffer 2.5μL， 4× dNTPs 2.0μL，濃度均為10pmol/μL 的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板為博落回cDNA1μL，ddH₂O 17μL，濃度為1U的Taq DNA 聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 包含0.5mmol/L MgCl₂、 50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris·HCl、4×dNTPs 包含用量均為2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP，反應(yīng)過程依次為：a、95℃處理1min ；b、依次94℃處理40s、60℃處理30s、72℃處理30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行25 個循環(huán)；c、72℃延伸10min ；即獲得博落回防御素McDef1和McDef2基因編碼的功能蛋白的PCR 產(chǎn)物。

進(jìn)一步，所述重組表達(dá)載體：取合成的McDef1和McDef2，通過Xba I/ Hind III位點(diǎn)克隆到釀酒酵母表達(dá)載體pVT102U/α上,得到重組表達(dá)載體pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。

進(jìn)一步，所述步驟2）中構(gòu)建重組菌的具體操作為：取重組表達(dá)載體pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，熱擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母，采用YSD營養(yǎng)缺陷篩選培養(yǎng)基進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，其操作為：將重組表達(dá)載體質(zhì)粒DNA1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌懸液，20 μL；PEG 溶液（10×TE，1 M LiAC,50% PEG 4000,以1:1:8 的體積比混合)1.5 mL 加入10 mL 無菌管中，混合，30℃，200 rpm，培養(yǎng)30 min；42℃熱擊15 min 后，5000 g，離心5min；棄上清，細(xì)胞沉淀用200 μL 1×TE 洗滌，5000 g，離心5min；棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于200 μL 1×TE 溶液中；細(xì)胞懸浮液涂YSD 板，30℃培養(yǎng)4-6天。

進(jìn)一步，所述YSD營養(yǎng)缺陷篩選培養(yǎng)基，其配方如下： YNB（無氨基酵母氮源） 6.7 g/L，葡萄糖 20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 瓊脂15 g/L。

進(jìn)一步，所述步驟3）中重組菌發(fā)酵培養(yǎng)表達(dá)的具體操作為：挑取2~4個3~5mm的重組菌于3mL YSD液體培養(yǎng)基中， 28~32℃，220~280rpm，培養(yǎng)12~16h；按1:20~50的比例將制備的種子液接種入50mL YSD液體培養(yǎng)基中，28~32℃，220~280rpm，培養(yǎng)12~16h；再按1:20~50的比例將制備的種子液接種入1.0 L YSD液體培養(yǎng)基中，28~32℃，220~280rpm，培養(yǎng)60~72h。

優(yōu)選，挑取2~4個3~5mm的重組菌于3mL YSD液體培養(yǎng)基中， 30℃，250rpm，培養(yǎng)12h；按1:25的比例將制備的種子液接種入50mL YSD液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)12h；再按1:25的比例將制備的種子液接種入1.0 L YSD液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)72h。

進(jìn)一步，一種重組博落回防御素功能蛋白的制備方法，還包括：

4）蛋白純化：收集步驟3）發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵產(chǎn)物的上清，分離純化。

所述蛋白純化的具體操作為：將發(fā)酵產(chǎn)物的上清和預(yù)先用0.05M NH₄AC (pH7.5)平衡過的DEAE 凝膠混合，室溫放置0.5~1 h，然后用抽濾瓶抽濾，所得到的濾液， pH 值調(diào)至4.1~4.3后，直接上預(yù)先用0.1M CH₃COONa （pH4.1~4.3）平衡好的CM-sepharose 陽離子交換柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH₃COONa 洗脫色素，再分別用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH₃COONa 緩沖液進(jìn)行洗脫，收集每個洗脫峰進(jìn)一步脫鹽反相純化，低溫凍干。

優(yōu)選，所述蛋白純化的具體操作為：將發(fā)酵產(chǎn)物的上清和預(yù)先用0.05M NH₄AC (pH7.5)平衡過的DEAE 凝膠混合，室溫放置0.5 h，然后用抽濾瓶抽濾，所得到的濾液， pH 值調(diào)至4.2 后直接上預(yù)先用0.1M CH₃COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose 陽離子交換柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH₃COONa 洗脫色素，再分別用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH₃COONa 緩沖液進(jìn)行洗脫，收集每個洗脫峰進(jìn)一步脫鹽反相純化，低溫凍干。

一種博落回防御素重組菌的發(fā)酵產(chǎn)物，如上述方法制得的發(fā)酵產(chǎn)物。

一種重組博落回防御素功能蛋白的應(yīng)用，上述蛋白或者發(fā)酵產(chǎn)物在抗菌飼料添加劑、果蔬種子的保存或者制備抗菌藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明一種重組博落回防御素功能蛋白的制備方法的有益效果：采用重組菌（含有核苷酸為SEQ ID NO.1和/或SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白編碼基因片段的重組菌）表達(dá)得到的發(fā)酵產(chǎn)物抗菌活性高，將所生產(chǎn)的發(fā)酵液上清，直接用于體外抗菌實驗，具有抗大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的能力，可用于制備抗菌飼料添加劑，工藝步驟簡單，成本低廉，具有良好的工業(yè)應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1—為從cDNA文庫中克隆McDef1、McDef2基因片段的檢測結(jié)果；

泳道M：DNA分子量，泳道1-3：克隆的目的片段McDef1，泳道4~6：克隆的目的片段McDef2。

圖2—為重組陽性轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果；

（A）泳道M：DNA分子量，泳道1：陰性克隆子，泳道2~3：陽性克隆子pVT102U/α-McDef1；

（B）泳道M：DNA分子量，泳道1：陰性克隆子，泳道2~3：陰性克隆子，泳道4~5：陽性克隆子pVT102U/α-McDef2。

圖3—為發(fā)酵產(chǎn)物的上清通過離子交換和反相液相純化后用Tricine-SDS- PAGE檢測結(jié)果；

泳道M：蛋白分子量，泳道1：重組表達(dá)的McDef1，泳道2、3：陰性對照，泳道4：重組表達(dá)的McDef2；

圖4—為發(fā)酵產(chǎn)物上清對大腸桿菌（DH5α）抑菌圈實驗結(jié)果；

1號孔為陰性對照，為含空質(zhì)粒的S78的發(fā)酵未濃縮液；2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液按體積比1：1的混合物對豬沙門氏菌的抑菌效果；各加樣孔的加樣量為10μl；

圖5—為發(fā)酵產(chǎn)物上清對金黃色葡萄球菌抑菌圈實驗結(jié)果；

1號孔為陰性對照，為含空質(zhì)粒的S78的發(fā)酵未濃縮液；2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液按體積比1：1的混合物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果；各加樣孔的加樣量為10μl；

圖6—為發(fā)酵產(chǎn)物上清對豬沙門氏菌抑菌圈實驗結(jié)果；

1號孔為陰性對照，為含空質(zhì)粒的S78的發(fā)酵未濃縮液；2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液按體積比1：1的混合物對豬沙門氏菌的抑菌效果；各加樣孔的加樣量為10μl。

具體實施方式

以下結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1

一種重組博落回防御素功能蛋白的制備方法，包括以下步驟：

1）構(gòu)建含博落回防御素功能蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體：

包括引物設(shè)計、PCR擴(kuò)增、獲得目的片段和構(gòu)建重組表達(dá)載體；

a）博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物設(shè)計: 根據(jù)合成的博落回McDef1和McDef2基因核苷酸序列經(jīng)多重比較后設(shè)計而成，上游引物設(shè)計在該基因起始端，并根據(jù)表達(dá)載體pVT102U/α上的酶切位點(diǎn)，上游引物設(shè)計時添加了Xba I 酶切位點(diǎn)，在Xba I 酶切位點(diǎn)前加有保護(hù)性堿基；下游引物設(shè)計在基因末端，并加上Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)，在Hind Ⅲ酶切位點(diǎn)前加有保護(hù)性堿基，所設(shè)置的博落回McDef1和McDef2基因上游引物、下游引物分別為：

博落回防御素McDef1基因上游引物：

5’-CGTCTAGATAAGAGAGAAGAAATGGGACCTAAAATGGTTG-3’Xba I 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef1基因下游引物：

5’-CCGAAGCTTATTCTCTTCACCTTCTCTACAT-3’ Hind III 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef2基因上游引物：

5’-CCGctcgag aaaagagaggctgaagctttatgtgagaaggctagccag-3’Xba I 酶切位點(diǎn)，

博落回防御素McDef2基因下游引物：

5’- GCTCTAGActaacattgggagaagtagcag-3’ Hind III 酶切位點(diǎn)。

b）PCR擴(kuò)增：以cDNA文庫中測序的相應(yīng)單克隆質(zhì)粒為模板，加入Taq DNA 聚合酶、博落回防御素McDef1和McDef2的上/下游引物、 dNTPs分別進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：10×Taq Buffer 2.5μL， 4× dNTPs 2.0μL，濃度均為10pmol/μL 的防御素McDef1或McDef2上/下游引物各1.0μL，模板為博落回cDNA1μL，ddH₂O 17μL，濃度為1U的Taq DNA 聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer 包含0.5mmol/L MgCl₂、 50mmol/L KCl、 10mmol/L Tris·HCl、4×dNTPs 包含用量均為2.5mmol/L 的dATP、 dTTP、dCTP、 dGTP；其反應(yīng)過程依次為：a、95℃處理1min ；b、依次94℃處理40s、60℃處理30s、72℃處理30s ；反應(yīng)過程進(jìn)行25 個循環(huán)；c、72℃延伸10min ；即獲得博落回防御素McDef1和McDef2基因編碼的功能蛋白的PCR 產(chǎn)物。

PCR擴(kuò)增的結(jié)果如圖1所示，從cDNA文庫中克隆得到的McDef1和McDef2目的基因，大小約為140bp~150bp。

c）獲得目的片段：

如圖2所示的PCR擴(kuò)增結(jié)果，陰性轉(zhuǎn)化子中無目標(biāo)基因片段，陽性轉(zhuǎn)化子中含有目標(biāo)基因片段McDef1和McDef2，說明本發(fā)明得到了含有目標(biāo)片段McDef1和McDef2的陽性轉(zhuǎn)化子。

d）構(gòu)建重組表達(dá)載體：

取合成的McDef1和McDef2，通過Xba I/ Hind III位點(diǎn)克隆到釀酒酵母表達(dá)載體pVT102U/α上,得到重組表達(dá)載體pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2。DNA的重組操作依據(jù)《分子克隆實驗手冊》進(jìn)行。

2）將步驟1）得到重組表達(dá)載體熱擊轉(zhuǎn)化至釀酒酵母S78構(gòu)建重組菌：

取步驟3重組載體pVT102U/α-McDef1和pVT102U/α-McDef2，熱擊轉(zhuǎn)化釀酒酵母，采用YSD營養(yǎng)缺陷篩選培養(yǎng)基進(jìn)行營養(yǎng)缺陷篩選，具體步驟和條件：將表達(dá)載體質(zhì)粒DNA，1.0 μg；carrier DNA，10 μg；上述菌懸液，20 μL；PEG 溶液（10×TE, 1 M LiAC,50% PEG 4000,以1:1:8 的體積比混合)1.5 mL 加入10 mL 無菌管中，混合， 30℃，200 rpm，培養(yǎng)30 min；42℃熱擊15 min 后，5000 g，離心5min；棄上清，細(xì)胞沉淀用200 μL 1×TE 洗滌，5000 g，離心5min；棄上清，細(xì)胞沉淀懸浮于200 μL 1×TE 溶液中；細(xì)胞懸浮液涂YSD 板，30℃培養(yǎng)4-6天。

YSD營養(yǎng)缺陷篩選培養(yǎng)基，其配方如下： YNB（無氨基酵母氮源） 6.7 g/L，葡萄糖 20 g/L，亮氨酸 200 mg/L，腺嘌呤 100 mg/L，肌醇 200 mg/L， 瓊脂15 g/L，其余為水。

）重組菌在YSD液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，表達(dá)獲得博落回防御素功能蛋白：

取步驟2）中得到的工程菌（陽性轉(zhuǎn)化子），挑取2~4個3~5mm的重組菌于3mLYSD液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)12h；按1:25的比例將制備的種子液接種入50mLYSD液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)12h；再按1:25的比例將制備的種子液接種入1.0 L YSD液體培養(yǎng)基中，30℃，250rpm，培養(yǎng)72h。

）蛋白純化：收集步驟3）發(fā)酵培養(yǎng)得到的發(fā)酵產(chǎn)物的上清，分離純化：

收集步驟3）的發(fā)酵菌液，將發(fā)酵產(chǎn)物上清和預(yù)先用0.05M NH₄AC (pH7.5)平衡過的DEAE 凝膠混合，室溫放置0.5 h，然后用抽濾瓶抽濾，所得到的濾液， pH 值調(diào)至4.2 后直接上預(yù)先用0.1M CH₃COONa （pH4.2）平衡好的CM-sepharose 陽離子交換柱（3cm x 30cm），然后用0.1M CH₃COONa 洗脫色素，再分別用含0.1M, 0.3M, 0.5M, 1.0M NaCl 的0.1M CH₃COONa 緩沖液進(jìn)行洗脫，收集每個洗脫峰，0.3M NaCl洗脫時，有大的洗脫峰，進(jìn)一步脫鹽反相純化，低溫凍干。

反相純化后濃縮液用Tricine-SDS- PAGE 電泳圖如圖3所示，分別有一條大小約為5~6 kDa的蛋白條帶，與目的蛋白大小相吻合，表明目的基因已經(jīng)得到表達(dá)，即重組博落回防御素功能蛋白McDef1和McDef2蛋白已經(jīng)生產(chǎn)出來。

實施例2

一種重組博落回防御素功能蛋白的應(yīng)用，包括以下幾方面：

本發(fā)明抑制細(xì)菌活性的測定均采用如下方法：

1 .原理

本法基于待測物質(zhì)的殺菌抑菌能力，利用在特定條件下一定濃度的待測物質(zhì)在含有微生物的培養(yǎng)基內(nèi)擴(kuò)散并形成固定大小的抑菌區(qū)域的原理進(jìn)行測定。

參考文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)

《中華人民共和國獸藥典》2010版——抗生素微生物鑒定法（QB2394-2007食品添加劑乳酸鏈球菌素）

3.試劑

3.1 LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL，瓊脂1 .5g，pH7.0，121℃，滅菌 25 min。

3.2 LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.0g，酵母提取物0 .5g，NaCl 1.0g，加水至100mL， pH7.0，121℃，滅菌 25 min。

3.3指示菌：購買于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，大腸埃希氏菌CICC編號10389，金黃色葡萄球菌，豬沙門氏菌。

分析步驟

4.1指示菌的活化

按照試劑3 .2的配方，配置50mL的培養(yǎng)液，挑取一個指示菌菌落于50mL液體培養(yǎng)基放入搖床，150 rpm，37℃，培養(yǎng)12 h。取出培養(yǎng)好的指示菌菌懸液，600nm下用無菌液體LB培養(yǎng)基調(diào)零，測定其OD值，如果OD值介于1 .5-2 .0，菌懸液的加入量為200微升每10mL LB固體培養(yǎng)基，如果OD值在2 .0-2 .5之間，菌懸液加入量為100微升每10mL固體培養(yǎng)基。

4.2待測物質(zhì)供試品

準(zhǔn)確稱取待測物質(zhì)100 mg，并溶于1.0mL的無菌水中，混勻，2000rpm，離心10min，留上清液作為高劑量濃度，并將其稀釋10倍，使之配成高低劑量兩個濃度梯度溶液。

4.3平板的制備

加熱融化試劑3 .1LB固體培養(yǎng)基，待其冷卻置50℃時（剛好不燙手的溫度），按步驟4 .1指定量加入大腸桿菌懸液和金黃色葡萄球菌懸液，搖勻后置于50℃恒溫水浴鍋中，用無菌10mL移液管每次精確移取10mL試劑3.1已融化的LB固體培養(yǎng)基迅速輕放于水平操作臺上至冷卻，保證瓊脂膠凝后培養(yǎng)基平面的平整度。

4.4上樣

用直尺將平板劃分為均勻的四份，在每個制備好的平板中以等距離打4個孔。分別加入80微升樣品和陽性對照溶液。上樣完成后，放入培養(yǎng)箱，37℃，大腸桿菌和豬沙門氏菌培養(yǎng)8 h，其中金黃色葡萄球菌培養(yǎng)24h；且每個樣做3個平行樣。

4.5檢測結(jié)果與分析

檢測結(jié)果為三個平行樣的平均值。

測試樣品對大腸桿菌的抑菌效果如圖4所示，培養(yǎng)72h的發(fā)酵液，1號孔為陰性對照，2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為2.3±0.1 cm，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為2.6±0.1 cm，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液混合物對大腸桿菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為4.2±0.2 cm。McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對大腸桿菌的抑菌作用稍大于McDef1發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于兩者的單獨(dú)抑菌作用，說明McDef1和McDef2博落回防御素對大腸桿菌的抑菌作用相互之間存在協(xié)同效應(yīng)。

測試樣品對金黃色葡萄球菌的效果如圖5所示，培養(yǎng)72h的發(fā)酵液，1號孔為陰性對照，2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為2.1±0.1cm，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為3.1±0.2 cm，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液混合物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為3.7±0.2 cm。McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用大于McDef1發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用，且McDef1和McDef2混合的發(fā)酵產(chǎn)物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用明顯強(qiáng)于兩者的單獨(dú)抑菌作用，說明McDef1和McDef2博落回防御素對金黃色葡萄球菌的抑菌作用相互之間存在協(xié)同效應(yīng)。

測試樣品對豬沙門氏菌的抑菌效果如圖6所示，培養(yǎng)72h的發(fā)酵液，1號孔為陰性對照，2號孔為McDef1發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為2.4±0.3cm，3號孔為McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液對豬沙門氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為3.1±0.2cm，4號孔為McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物未濃縮發(fā)酵液混合物對豬沙門氏菌的抑菌效果，抑菌圈的直徑為5.8±0.4cm，根據(jù)抑菌圈的直徑可知，McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物對豬沙門氏菌的抑菌作用明顯大于McDef1、McDef2發(fā)酵產(chǎn)物抑菌作用的和，McDef1和McDef2發(fā)酵產(chǎn)物混合后其抑菌作用存在協(xié)同效應(yīng)，相互促進(jìn)。

實驗結(jié)果說明，采用本發(fā)明含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述博落回防御素功能蛋白編碼基因片段的重組菌——釀酒酵母發(fā)酵得到的發(fā)酵產(chǎn)物，其分子量為5~6KD，發(fā)酵產(chǎn)物的氨基酸序列如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示的McDef1、McDef2，其抑菌活性高，尤其將兩種防御素McDef1和McDef2結(jié)合使用，其抑菌效果更佳，安全，營養(yǎng)價值高。

本發(fā)明通過對天然博落回防御素基因的改造，用基因工程的方法重組表達(dá)得到了具有高抑菌活性的博落回防御素功能蛋白，其可以用于制備抗菌藥物；采用本發(fā)明工程菌表達(dá)得到的發(fā)酵產(chǎn)物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有較高的抗菌活性，適用于制備抗菌飼料添加劑，以及果蔬種子的保存或者添加至制備抗菌藥物中，工藝步驟簡單，成本低廉，應(yīng)用前景良好。

以上通過實施例形式的具體實施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以上的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種重組博落回防御素功能蛋白及其制備方法與應(yīng)用

<130> 2017.3.15

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 141

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atttgtgaat ccgcctctca tagatttaag ggtttgtgtg ttagaaagtc caactgtgct 60

gctgtctgcc aaactgaagg atttcctgat ggtaagtgtc aaggtgttag aaggagatgt 120

atgtgtacca gaccatgtta a 141

<210> 2

<211> 153

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttatgtgaga aggctagcca gacttggtcc ggtaattgtg gtaatactca gcactgcgat 60

agacaatgta ttaactggga gaaggctttg catggcgcat gtcacgtcag aggaggtaaa 120

catatgtgct tctgctactt ctcccaatgt tag 153

<210> 3

<211> 46

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Ile Cys Glu Ser Ala Ser His Arg Phe Lys Gly Leu Cys Val Arg Lys

1 5 10 15

Ser Asn Cys Ala Ala Val Cys Gln Thr Glu Gly Phe Pro Asp Gly Lys

20 25 30

Cys Gln Gly Val Arg Arg Arg Cys Met Cys Thr Arg Pro Cys

35 40 45

<210> 4

<211> 50

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Leu Cys Glu Lys Ala Ser Gln Thr Trp Ser Gly Asn Cys Gly Asn Thr

1 5 10 15

Gln His Cys Asp Arg Gln Cys Ile Asn Trp Glu Lys Ala Leu His Gly

20 25 30

Ala Cys His Val Arg Gly Gly Lys His Met Cys Phe Cys Tyr Phe Ser

35 40 45

Gln Cys

50