本發(fā)明涉及分子生物學和生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種文蛤酚氧化酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

酚氧化酶是一種含銅氧化酶，在有氧條件下，能把酚類氧化為醌類。酚氧化酶具有廣泛的功能，在自然界中參與黑色素生成、表皮硬化、傷口愈合以及免疫防御等生理功能。酚氧化酶被認為是無脊椎動物免疫防御系統(tǒng)中最重要的免疫因子之一，能通過黑化作用參與病原的體內(nèi)清除。其在貝類中的免疫重要性已被廣泛報道，研究證實酚氧化酶參與鮑魚、扇貝、牡蠣、蛤等多種貝類的免疫應(yīng)答。另外，由于酚氧化酶的氧化產(chǎn)物為水，不產(chǎn)生過氧離子，被認為是一種綠色環(huán)保的氧化酶，已被應(yīng)用在食品、工業(yè)、包裝指示劑、污水處理等眾多領(lǐng)域。

酚氧化酶的重要作用使其具有廣泛的應(yīng)用價值。文蛤是一種在沿海和灘涂地區(qū)廣泛分布的雙殼貝類，在我國沿海，文蛤作為一種重要的經(jīng)濟貝類而被廣泛養(yǎng)殖。目前，還沒有從文蛤中獲得酚氧化酶基因的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是一種文蛤酚氧化酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術(shù)方案為：

一種文蛤酚氧化酶基因，文蛤酚氧化酶基因具有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。其是通過cDNA文庫結(jié)合RACE技術(shù)從文蛤中克隆得到的酚氧化酶的cDNA序列，該序列全長2238bp，其中編碼框2019bp，具體為SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列。

一種文蛤酚氧化酶基因的編碼蛋白，所述文蛤酚氧化酶基因的編碼蛋白為具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列，文蛤酚氧化酶基因所編碼的蛋白共包含672個氨基酸

一種文蛤酚氧化酶基因構(gòu)建方法，通過PCR擴增文蛤酚氧化酶基因，而后通過酶切位點連接到表達載體上，在IPTG誘導條件下，于宿主菌株中體外重組表達該蛋白，重組產(chǎn)物經(jīng)純化，即體外重組表達獲得含有SEQ ID NO.1中所示的核苷酸序列的文蛤酚氧化酶重組蛋白。

所述表達載體為pGEX-4T-1；宿主菌株為大腸桿菌BL21；純化采用純化柱GSTrap FF。

一種文蛤酚氧化酶基因的應(yīng)用，經(jīng)銅離子處理后所述含有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列的文蛤酚氧化酶重組蛋白在制備貝類的免疫增強劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：

本發(fā)明從文蛤中克隆酚氧化酶cDNA全長序列并原核重組表達該蛋白，重組蛋白具有酚氧化酶活性，能夠抑制文蛤治病副溶血弧菌的生長繁殖，可以作為備選的貝類免疫增強劑，同時也具有在工業(yè)、食品等其他相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用前景。本發(fā)明重組蛋白具有大規(guī)模生產(chǎn)的可能，可以彌補天然蛋白量低以致難以滿足需要的局限。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例2提到的純化的文蛤酚氧化酶重組蛋白；其中，M：蛋白marker；1：IPTG誘導前總蛋白；2：IPTG誘導后總蛋白；3：親和柱純化后的文蛤酚氧化酶-GST重組融合蛋白。

具體實施方式

下面的實施例中將本發(fā)明作進一步闡述，但本發(fā)明不限于此。

本發(fā)明利用cDNA文庫和RACE技術(shù)從文蛤中擴增到文蛤酚氧化酶的cDNA全長序列2238bp，其中編碼框2019bp，編碼蛋白含有672個氨基酸。根據(jù)所得序列設(shè)計表達引物，擴增全長后經(jīng)酶切連接到表達載體pGEX-4T-1中，之后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，經(jīng)過IPTG誘導，然后經(jīng)過GSTrap FF親和柱純化后得到重組酚氧化酶。經(jīng)檢測所重組的蛋白經(jīng)過銅離子處理后具有酚氧化酶活性，同時重組蛋白能夠?qū)ξ母蛑虏「比苎【幸种谱饔茫梢宰鳛閭溥x的貝類免疫增強劑。

實施例1

文蛤酚氧化酶基因，具有序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

SEQ ID NO.1(加粗部分為編碼框序列，能夠編碼蛋白)

(a)序列特征：

●長度：141-2160bp

●類型：核苷酸序列

●鏈型：單鏈

●拓撲結(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：cDNA

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：文蛤

本發(fā)明中的文蛤酚氧化酶的cDNA序列克隆包括下列步驟：

1)文蛤總RNA的提取及mRNA的純化；

2)文蛤cDNA文庫構(gòu)建；

3)文蛤cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定；

4)文蛤EST序列的同源性分析及酚氧化酶基因片段的篩選；

5)RACE擴增獲得文蛤酚氧化酶的全序列以及全序列的驗證。

具體操作如下：

1.文蛤總RNA的提取及mRNA的純化：利用Invitrogen公司的Trizol試劑從文蛤幼蟲中提取總RNA，利用QIAGENE公司的Oligotex mRNA純化試劑盒純化mRNA。

2.文蛤cDNA文庫構(gòu)建：利用Stratagene公司cDNA Synthesis Kit和Synthesis Kit(Stratagene)進行cDNA的合成，雙鏈cDNA經(jīng)末端補平、EcoR I接頭連接、EcoR I末端磷酸化、Xho I內(nèi)切酶酶切后利用QIAGEN公司QIAEX II Agarose Gel Extraction Kit對大于100bp的酶切片段進行回收，與Invitrogen公司Uni-ZAP XR vector載體連接，利用Stratagene公司的III Gold Cloning Kit試劑盒進行文庫包裝，利用Exassist Helper Phage和SOLR菌株從XR Vector上體外切割pBluescript成為質(zhì)粒文庫。

3.文蛤cDNA文庫EST序列的大規(guī)模測定：文庫中篩選陽性克隆，使用載體通用引物T3在MegaBACE1000測序儀上進行序列測定，將得到的原始峰圖文件(*.abi，*.abd文件)數(shù)據(jù)經(jīng)Phred程序處理轉(zhuǎn)化為序列文件(*.seq)和質(zhì)量文件(*.seq.qual)，依據(jù)質(zhì)量文件提供的數(shù)值確定獲得序列的誤差概率，去除低質(zhì)量的堿基，用cross-mach程序屏蔽數(shù)據(jù)中的載體序列，從得到的數(shù)據(jù)中選取連續(xù)堿基質(zhì)量大于Q13(準確率大于95％)且長度大于100bp的序列作為EST數(shù)據(jù)，具體《基因表達序列標簽(EST)數(shù)據(jù)分析手冊》(胡松年著，浙江大學出版社，2005年)。

4.文蛤EST序列的同源性分析及酚氧化酶基因片段的篩選：將獲得的全部有效的EST數(shù)據(jù)進行聚類拼接，生成Contigs和Singletons，分別將所獲的Contigs與Singletons在數(shù)據(jù)庫中進行BLASTn和BLASTx分析，結(jié)果顯示在EST序列中發(fā)現(xiàn)了與菲律賓蛤仔(Venerupis philippinarum)，紫貽貝(Mytilus galloprovincialis)和長牡蠣(Crassostrea gigas)酚氧化酶相似性較高的序列，根據(jù)相似性分析結(jié)果確定了文蛤酚氧化酶基因的EST序列。

5.文蛤酚氧化酶基因cDNA全長序列的克?。焊鶕?jù)與酚氧化酶基因同源的EST序列設(shè)計特異性引物F1和R1，分別利用載體通用引物T3和T7進行3’和5’末端的RACE擴增。PCR產(chǎn)物用1.5％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，用膠回收試劑盒(Promega,USA)進行PCR產(chǎn)物的回收和純化，再與pMD-18T載體(大連寶生物工程有限公司)連接，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞Top10，挑選陽性克隆用載體引物M13-47和M13-48進行測序，所得結(jié)果經(jīng)BioEdit軟件拼接，得到文蛤酚氧化酶全長序列見SEQ ID NO.1。

所使用的引物序列如下：

F1：5’ATC CAA CTA CCG ACT TCC CAC 3’

R1：5’TGC GTT TTC CAT CAC TAC AAG G 3’

T3：5’ATT AAC CCT CAC TAA AGG GA 3’

T7：5’TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3’

6.文蛤酚氧化酶基因cDNA全長的驗證：在測序拼接的酚氧化酶全長序列上設(shè)計一對引物F2和R2以cDNA為模板進行全長的驗證。測序以及分析同步驟5.。

所使用的引物序列如下：

F2：5’AGG CGG AGT TAA TTC GTG CTA 3’

R2：5’TGT GTG TTA GGA AAT AAG CGG C 3’

所述步驟5.中3’RACE擴增所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：

25μl反應(yīng)體系，包含：

擴增所用PCR反應(yīng)程序：94℃變性4min，1個循環(huán)；94℃變性50s，56℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)；4℃保溫。

所述步驟5.中5’RACE擴增所用反應(yīng)體系及反應(yīng)條件：

25μl反應(yīng)體系，包含：

擴增所用PCR反應(yīng)程序：94℃變性4min，1個循環(huán)；94℃變性50s，55℃退火1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)；4℃保溫。

所述步驟6.中全長驗證的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件為：

25μl反應(yīng)體系，包含：

擴增所用PCR反應(yīng)程序：94℃變性4min，1個循環(huán)；94℃變性50s，57℃退火50s，72℃延伸1min，35個循環(huán)；72℃延伸10min，1個循環(huán)；4℃保溫。

實施例2.文蛤酚氧化酶重組蛋白的獲得

根據(jù)SEQ ID NO.1對應(yīng)的編碼框的cDNA序列，設(shè)計含有限制性內(nèi)切酶BamH I和Sal I酶切位點的特異性引物BamH I-F和Sal I-R，通過PCR技術(shù)擴增編碼酚氧化酶的基因片段，然后通過酶切將其克隆到pGEX-4T-1表達載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，測序確認表達框正確后，接種陽性克隆到含有氨芐青霉素(100mg/ml)的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至O.D.₆₀₀＝0.4-0.6，加入IPTG至終濃度為1mM誘導4小時后離心收集菌體。菌體在冰浴條件下用超聲波200W處理30－60分鐘(每次1秒，間隔1秒)。離心去掉上清，沉淀(含有重組蛋白包涵體)用Buffer A洗3次，Buffer B洗3次，然后加入10－20ml Buffer C在37℃搖床中震蕩20－30min，溶解沉淀，將其轉(zhuǎn)移到透析袋中，4℃條件下，在梯度尿素透析液(透析液中分別含4M，2M，0M尿素)中透析，使重組蛋白復性。利用GE公司的GSTrap FF親和柱純化重組產(chǎn)物，得到文蛤酚氧化酶的GST重組蛋白，分子量約為103.2kDa如附圖1顯示。

所使用的引物序列：

BamH I-F：5’CGC GGA TCC ATG AAA ATC CTC GTG GCT GC 3’

Sal I-R：5’ACG CGT CGA CCT ACC ACG GCC AAA ACG ACT 3’

所用的溶液的組成：

Buffer A：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，0.1％TritonX-100

Buffer B：50mM Tris-HCl，5mM EDTA，2M尿素

Buffer C：100mM Tris-HCl，10mM DTT，8M尿素

透析液：100mM Tris-HCl，5mM EDTA，5mM半胱氨酸

獲得的文蛤酚氧化酶重組蛋白是酚氧化酶與GST的融合表達蛋白，其中酚氧化酶具有SEQ ID NO.2中所示的序列。

SEQ ID NO.2

MKILVAAIFCLSSAFAKITEIALPRDVYTCFERELERSNVTNSIGEVIFSRCVHKVLWAKQTPKLTEQPLGTDAMKWISGLVDMSHILDFQTGSTDQDVRPRPRRQAFRNQSERVQGQMQLGPGQTGRRRQTLRRQPRVRKEYRMLTDRERFMFHRALNMLKADTSVSPNKFDALGRLHFMSVGRAHFGPNFLPWHRLFLVVMENALREKIPSVTIPYWDSTLDDPLLDPRSSILWTPDFLGQANGYVIDGPFANWDTPTGRLVRYSGTGGTMMNWTYIYNVFRQNHLEEITDPYAKPDNNLEDHHNQLHTWVGGHMAPPALAAFDPVFYMLHSYIDLLWEIFRGLQKRRGIDPTTDFPRNITEIPDGQRYEDPSGFGNLLNRHGLSNVFTDNIYKYERPPTCTVQNPNCGTENLRCDTSGTRPKCVSASIFDIRTLLLPSGLPMEGGSGIRELRSPTSRERRKHAKIFEMIQQVSNVQCQPSNVNEKYINNFDIDGVIDEKNWAYIPVQVIYKNQKLNRQGQNLNTIYDICKRNTSSELPSRIFVESNGLNYNGMYKDIAHFKNDLLTSSSLAYVGVKKPTTEAHSDVLVSGYDECGRICQPFCLDGTYTRNRKCHGAIRITNSVPLMHGNDVKSAVKMIWQEDRYGLPYIVENEIFITLLCETSQSFWPW-

(a)序列特征：

●長度：672

●類型：氨基酸序列

●鏈型：單鏈

●拓撲結(jié)構(gòu)：線性

(b)分子類型：蛋白質(zhì)

(c)假設(shè)：否

(d)反義：否

(e)最初來源：文蛤

結(jié)構(gòu)特點：屬于酪氨酸酶超家族，具有銅離子結(jié)合中心

實施例3.文蛤酚氧化酶重組蛋白的活性檢測

利用蛋白濃度測定試劑盒2-D Quant Kit(GE Healthcare,UK)對重組的酚氧化酶-GST融合蛋白進行濃度測定。

文蛤酚氧化酶重組蛋白的活性測定以L-DOPA(sigma)為特異性底物，采用改進的Ashida等的方法在酶標板中進行。具體為：將50μl收集到的上述實施例獲得重組蛋白溶液加入酶標板中，然后加入100μl的0.1M(pH 6.0)的磷酸鉀緩沖液和20μl的L-DOPA水溶液(0.01M)，振蕩20秒混勻后，使用TECAN M1000Pro酶標儀檢測在490nm下的吸光值OD₄₉₀，40分鐘內(nèi)每隔4分鐘測定一次。每分鐘增加0.001為1個酶活力單位，結(jié)合蛋白濃度測定結(jié)果，重組蛋白的酶活性以U mg^-1protein表示。結(jié)果顯示，獲得的文蛤酚氧化酶重組蛋白的酶活性約為0.1U mg^-1protein，活性較低。為了獲得活性較高的重組蛋白，對上述實施例純化后的重組蛋白進行活性激活處理，即將上述實施例純化后重組蛋白加入終濃度50μM的CuCl₂，室溫孵育15min后，重新按上述方法進行酶活測定，結(jié)果顯示，處理后的重組蛋白的酶活性提高到12U mg^-1protein，而單獨用50μM的CuCl₂進行檢測沒有顯示酶活性。

實施例4.文蛤酚氧化酶重組蛋白對文蛤致病菌的抑菌活性

酚氧化酶參與黑化作用，能夠參與免疫應(yīng)答，清除體內(nèi)病原菌。本實施例中，選取之前分離鑒定的文蛤強致病菌副溶血弧菌，將其在海水培養(yǎng)基中25℃擴大活化培養(yǎng)20小時(h)，檢測620nm下的吸光值OD₆₂₀，將細菌培養(yǎng)液離心去上清，用滅菌的PBS緩沖液重懸至OD₆₂₀為1，即菌濃度約為5×10⁸CFU/ml，取此菌重懸液10μl分別與100μl經(jīng)過CuCl₂處理的上述實施例獲得重組酚氧化酶溶液(CuCl₂處理方式按照實施例3中的記載進行)和100μl對照溶液(不含重組酚氧化酶)混勻，25℃孵育1h，加入2ml海水培養(yǎng)基后繼續(xù)25℃搖床孵育，5h內(nèi)每隔1h測定620nm下的吸光值OD₆₂₀。結(jié)果如下表所示，經(jīng)過酚氧化酶重組蛋白處理能有效抑制文蛤致病副溶血弧菌的生長，因此所制備的文蛤酚氧化酶重組蛋白具有文蛤等貝類免疫增強劑的應(yīng)用前景。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學院海洋研究所

<120> 文蛤酚氧化酶基因及其編碼蛋白和應(yīng)用

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 2238

<212> DNA

<213> 文蛤

<220>

<221> cDNA

<222> (141)..(2160)

<223>

<400> 1

aaataagaca cgtttgaagg cggagttaat tcgtgctaat ttgaacatat tttcattgtt 60

tcaaacgggg aatgaaaatg gagtgacaaa ctggataaaa tgtttccgta gtaactttaa 120

actgcagtta caaaagaaag atgaaaatcc tcgtggctgc cattttctgc ttgtcgtctg 180

catttgcaaa aattacagaa attgctctac cgcgagatgt ttacacgtgc ttcgaacgtg 240

agctcgaacg atctaacgtc acaaactcta ttggtgaagt gatattttcg agatgcgtcc 300

ataaagtttt atgggccaaa caaacaccaa agttgacgga acagcctctt ggaaccgacg 360

caatgaagtg gatatccgga cttgttgata tgagtcatat actggatttc caaaccggaa 420

gtacagacca agacgttaga ccccgtccaa gacgacaggc ttttagaaac cagtctgaac 480

gagtacaagg ccaaatgcag ttgggcccag gccagactgg aagacgacga cagacgttga 540

ggcgtcaacc gagagtgaga aaagagtacc ggatgcttac agacagagaa aggtttatgt 600

ttcacagagc actaaatatg ctgaaagcag acacgtcagt gtcaccaaac aagttcgacg 660

ctcttggtcg ccttcatttt atgtcagtcg gtcgggctca ctttggacca aatttcctac 720

catggcacag actcttcctt gtagtgatgg aaaacgcatt aagggaaaaa attccatcgg 780

tcactatacc atactgggac tctaccctag atgaccctct gcttgacccc agatcatcca 840

ttctctggac acctgacttc cttggacagg caaatggata tgtcatcgac ggtccttttg 900

ctaactggga cactccgacc ggacggctgg ttcgatattc tggtacaggt ggcacgatga 960

tgaactggac gtacatctac aatgtgttca gacaaaatca tttggaggag ataacggacc 1020

cttatgccaa gcccgataac aatctggaag accaccataa tcagttgcat acttgggtgg 1080

gtggccacat ggctccaccg gctcttgcag catttgatcc ggtgttctat atgttacatt 1140

cttacataga cttactttgg gaaatattca ggggtctaca gaaacgtcga ggaattgatc 1200

caactaccga cttcccacgg aatatcacgg agattcccga tggtcaaaga tacgaagatc 1260

cctcaggttt cggaaatctt ttaaatagac atggactaag taatgtgttt acagataaca 1320

tatacaagta cgaacgcccg cccacgtgta cagttcaaaa tcctaattgt ggaacggaaa 1380

acttacgatg tgacacttcc ggtacgcgcc caaaatgtgt ttctgcttcg atcttcgata 1440

tcaggacatt gctgttaccc agtgggttac ctatggaagg agggtctggg attcgggagt 1500

taaggagtcc tacttcccga gagagaagaa aacatgcaaa aatatttgaa atgatacagc 1560

aggtatccaa tgttcaatgt caaccaagca acgtcaatga aaaatacatc aataactttg 1620

acatagatgg tgttatagat gaaaagaatt gggcttatat accggtgcaa gtaatttata 1680

agaaccaaaa acttaacaga caagggcaaa atttaaatac gatttatgac atttgtaaac 1740

ggaataccag ttcagagtta ccttcgagga tatttgtcga gtcaaacggc ttaaactata 1800

acggtatgta taaagatatt gcgcatttca aaaatgactt gcttacttcg tcgtcattag 1860

cctacgttgg tgttaaaaag ccaacgacgg aggcgcacag tgacgtgttg gtgagtggtt 1920

acgacgaatg cggtcgcata tgtcagccat tttgtttgga cggcacatat accagaaacc 1980

ggaaatgtca cggcgctatc cgtataacga atagtgtgcc actgatgcac ggaaatgacg 2040

tcaaatctgc tgtaaaaatg atctggcaag aagacagata cggccttcca tatattgttg 2100

aaaatgaaat atttatcact cttttgtgcg aaacgtccca gtcgttttgg ccgtggtagg 2160

ccgcttattt cctaacacac agaatattta tacaatacat gtacgttcga gacgacactg 2220

taaaaaaaaa aaaaaaaa 2238