專利名稱：多酚氧化酶模擬酶的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及的是一種多酚氧化酶模擬酶的制備方法,屬于仿生催化技術領域。
背景技術：
多酚氧化酶是一類廣泛分布于植物體中的一種銅結合酶，可催化鄰苯二酚氧化生成鄰 苯二醌。酶催化與普通化學催化劑相比，具有高效性、專一性和反應條件溫和等優(yōu)點， 而天然酶對環(huán)境過于敏感，對操作條件要求苛刻，易失活，價格昂貴的缺點。
多酚氧化酶的化學模擬，是極富挑戰(zhàn)性的課題。設計合成多酚氧化酶模型，要考慮的 因素較多，關鍵在于配體的選擇。過去的研究中，人們用吡啶基等來模擬酶活性中心的咪 唑基，合成了一系列的多酚氧化酶模型物，較好地模擬了多酚氧化酶的性質。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術存在的不足，而提供一種催化活性高，不會失活的環(huán)
糊精多酚氧化擬酶的制備方法，該方法是A)將環(huán)糊精按質量比為1 : 20 30放入去 離子水中溶解；然后按環(huán)糊精與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1 : 0. 5 l加入對甲苯磺酰氯， 在25'C下攪拌反應2 4小時后，按去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1 : 0. 2加 入10%質量百分比濃度的氫氧化鈉水溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌15 30分鐘，過濾除去 不溶物，收集濾液，用氯化銨將濾液的PH值調為8 8. 5;將該溶液在4'C下靜置10 15 小時，過濾，析出白色固體，用去離子水洗滌三次，50 8(TC下用蒸餾水重結晶三次， 得到亮白色片狀晶體；在40 45。C條件下真空干燥，得到6位單取代環(huán)糊精磺酸酯；B) 將6位單取代環(huán)糊精磺酸酯按質量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶 解；然后按6位單取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1 : 8 15加入碘化鈉，在9(TC 下攪拌反應3 5h，在4(TC下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌， 過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中， 加入丙酮得到沉淀，將其在40 45'C條件下真空干燥即得到碘代環(huán)糊精；C)將碘代環(huán)糊 精按質量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按碘代環(huán)糊精與 組氨酸的摩爾比為1 : 8 15加入組氨酸，在60'C、氮氣保護下反應24小時；將反應得 到的懸濁液進行抽濾、收集濾液后，在4(TC減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗滌至洗出丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀后干燥后即得
到環(huán)糊精組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1:1000投入PH值為6 9 的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾比為1 : 2 IO加入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用無水乙醇 洗潘，在20 4(TC條件下干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
本發(fā)明所述的環(huán)糊精為e-環(huán)糊精。
本發(fā)明是以e-環(huán)糊精為模型，在其邊壁上引入具有催化性質的組胺基團，并進一步
與Cu2+絡合得到了具有天然酶活性的模擬酶，可催化鄰苯二酚氧化生成鄰苯二醌；具有催
化活性高，不會失活等特點。
具體實施例方式
下面將結合具體實施例對本發(fā)明作詳細的介紹本發(fā)明所述的多酚氧化模擬酶的制備 方法，該方法是A)將環(huán)糊精按質量比為1:20 30放入去離子水中溶解；然后按環(huán)糊 精與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1 : 0.5 1加入對甲苯磺酰氯，在25'C下攪拌反應2 4 小時后，按去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1 : 0.2加入l(m質量百分比濃度的 氫氧化鈉水溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌15 30分鐘，過濾除去不溶物，收集濾液，用氯 化銨將濾液的PH值調為8 8. 5;將該溶液在4'C下靜置10 15小時，過濾，析出白色 固體，用去離子水洗滌三次，50 8(TC下用蒸餾水重結晶三次，得到亮白色片狀晶體； 在40 45'C條件下真空干燥，得到6位單取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位單取代環(huán)糊精磺 酸酯按質量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位單取代 環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1 : 8 15加入碘化鈉，在9(TC下攪拌反應3 5h,在 40'C下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌，過濾，收集濾餅再加入 丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，將 其在40 45'C條件下真空干燥即得到碘代環(huán)糊精；C)將碘代環(huán)糊精按質量比為1 : 30 50加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按碘代環(huán)糊精與組氨酸的摩爾比為1 :8 15加入組氨酸，在6(TC、氮氣保護下反應24小時；將反應得到的懸濁液進行抽濾、 收集濾液后，在40'C減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗滌至洗出丙酮變無色; 所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀后干燥后即得到環(huán)糊精組氨酸衍生物； D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1:1000投入PH值為6 9的磷酸鹽緩沖液中，待完 全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾比為1 : 2 10加入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用無水乙醇洗滌，在20 40'C條件下 干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
本發(fā)明所述的環(huán)糊精為e-環(huán)糊精。
實施例1，它是a)將環(huán)糊精按質量比為1 : 20放入去離子水中溶解；然后按環(huán)糊精
與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1 : 0.5加入對甲苯磺酰氯，在25'C下攪拌反應2小時后，按 去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1 : 0.2加入10%質量百分比濃度的氫氧化鈉水
溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌i5分鐘，過濾除去不溶物，收集濾液，用氯化銨將濾液的ra
值調為8;將該溶液在4t:下靜置10小時，過濾，析出白色固體，用去離子水洗滌三次， 50'C下用蒸餾水重結晶三次，得到亮白色片狀晶體；在4(TC條件下真空干燥，得到6位 單取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位單取代環(huán)糊精磺酸酯按質量比為1 : 30加入到N， N-二甲 基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位單取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1 : 8加入 碘化鈉，在9(TC下攪拌反應3小時，在40'C下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中 加入丙酮，攪拌，過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所 得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，將其在4(TC條件下真空干燥即得到碘代環(huán)糊精； C)將碘代環(huán)糊精按質量比為1 : 30加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按碘代 環(huán)糊精與組氨酸的摩爾比為1 : 8加入組氨酸，在60'C、氮氣保護下反應24小時；將反 應得到的懸濁液進行抽濾、收集濾液后，在40'C減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用 丙酮洗滌至洗出丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀后干燥后 即得到環(huán)糊精組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1:1000投入PH值為6 的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾比為1 : 2加 入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用無水乙醇洗滌， 在2(TC條件下干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
實施例2，它是a)將e-環(huán)糊精按質量比為i: 3o放入去離子水中溶解；然后按e-
環(huán)糊精與對甲苯磺酰氯的摩爾比為l : 1加入對甲苯磺酰氯，在25'C下攪拌反應4小時后， 按去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1 : 0.2加入10%質量百分比濃度的氫氧化鈉 水溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌30分鐘，過濾除去不溶物，收集濾液，用氯化銨將濾液的 PH值調為8.5;將該溶液在4'C下靜置15小時，過濾，析出白色固體，用去離子水洗滌 三次，8(TC下用蒸餾水重結晶三次，得到亮白色片狀晶體；在45'C條件下真空千燥，得 到6位單取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位單取代環(huán)糊精磺酸酯按質量比為1 : 50加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位單取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1
:15加入碘化鈉，在9(TC下攪拌反應5小時，在4CTC下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺； 在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌，過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化 鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，將其在40 45'C條件下真空干燥即得到 碘代環(huán)糊精；C)將碘代環(huán)糊精按質量比為1 : 50加入到N, N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解； 然后按碘代環(huán)糊精與組氨酸的摩爾比為1 : 15加入組氨酸，在60。C、氮氣保護下反應24 小時；將反應得到的懸濁液進行抽濾、收集濾液后，在4(TC減壓蒸餾去除溶劑，所得黃 色蠟狀物用丙酮洗滌至洗出丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉 淀后干燥后即得到環(huán)糊精組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1:1000投 入ra值為9的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾 比為1 : IO加入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用 無水乙醇洗滌，在4(TC條件下干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
實施例3， A)將e-環(huán)糊精按質量比為1 : 25放入去離子水中溶解；然后按e-環(huán)糊 精與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1 : 0.8加入對甲苯磺酰氯，在25。C下攪拌反應3小時后， 按去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1 : 0.2加入10%質量百分比濃度的氫氧化鈉 水溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌22分鐘，過濾除去不溶物，收集濾液，用氯化銨將濾液的 PH值調為8.2;將該溶液在4i:下靜置12小時，過濾，析出白色固體，用去離子水洗滌 三次，65。C下用蒸餾水重結晶三次，得到亮白色片狀晶體；在42'C條件下真空干燥，得 到6位單取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位單取代環(huán)糊精磺酸酯按質量比為1 : 40加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位單取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1 :10加入碘化鈉，在90"C下攪拌反應4小時，在4(TC下減壓蒸干N， N-二甲基甲酰胺； 在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌，過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化 鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，將其在42'C條件下真空干燥即得到碘代 環(huán)糊精；C)將碘代環(huán)糊精按質量比為1 : 40加入到N， N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然 后按碘代環(huán)糊精與組氨酸的摩爾比為1 : 12加入組氨酸，在60°C、氮氣保護下反應24 小時；將反應得到的懸濁液進行抽濾、收集濾液后，在40'C減壓蒸餾去除溶劑，所得黃 色蠟狀物用丙酮洗滌至洗出丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉 淀后干燥后即得到環(huán)糊精組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1:1000投 入ra值為7.5的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾比為1:6加入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用 無水乙醇洗滌，在3(TC條件下干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
權利要求
1、一種多酚氧化酶模擬酶的制備方法，該方法是A)將環(huán)糊精按質量比為1∶20～30放入去離子水中溶解；然后按環(huán)糊精與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1∶0.5～1加入對甲苯磺酰氯，在25℃下攪拌反應2～4小時后，按去離子水與對氫氧化鈉水溶液的質量比為1∶0.2加入10％(質量百分比濃度)的氫氧化鈉水溶液，所得懸濁液繼續(xù)攪拌15～30分鐘，過濾除去不溶物，收集濾液，用氯化銨將濾液的PH值調為8～8.5；將該溶液在4℃下靜置10～15小時，過濾，析出白色固體，用去離子水洗滌三次，50～80℃下用蒸餾水重結晶三次，得到亮白色片狀晶體；在40～45℃條件下真空干燥，得到6位單取代環(huán)糊精磺酸酯；B)將6位單取代環(huán)糊精磺酸酯按質量比為1∶30～50加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按6位單取代環(huán)糊精磺酸酯與碘化鈉的摩爾比為1∶8～15加入碘化鈉，在90℃下攪拌反應3～5h，在40℃下減壓蒸干N，N-二甲基甲酰胺；在產(chǎn)物中加入丙酮，攪拌，過濾，收集濾餅再加入丙酮，重復三次，除去未反應的碘化鈉；將所得固體溶于水中，加入丙酮得到沉淀，將其在40～45℃條件下真空干燥即得到碘代環(huán)糊精；C)將碘代環(huán)糊精按質量比為1∶30～50加入到N，N-二甲基甲酰胺中，攪拌溶解；然后按碘代環(huán)糊精與組氨酸的摩爾比為1∶8～15加入組氨酸，在60℃、氮氣保護下反應24小時；將反應得到的懸濁液進行抽濾、收集濾液后，在40℃減壓蒸餾去除溶劑，所得黃色蠟狀物用丙酮洗滌至洗出丙酮變無色；所得固體溶于水中并重新用丙酮沉淀，收集沉淀后干燥后即得到環(huán)糊精組氨酸衍生物；D)將環(huán)糊精組氨酸衍生物按質量比為1∶1000投入PH值為6～9的磷酸鹽緩沖液中，待完全溶解后，按環(huán)糊精組氨酸衍生物與氯化銅的摩爾比為1∶2～10加入氯化銅，過濾，除去不溶物，加入適量無水乙醇，靜置，析出晶體，用無水乙醇洗滌，在20～40℃條件下干燥，得到多酚氧化酶模擬酶。
2.根據(jù)權利要求1所述的多酚氧化酶模擬酶的制備方法，其特征在于所述的環(huán)糊精為e-環(huán)糊精。
全文摘要
一種多酚氧化模擬酶的制備方法，該方法是以β-環(huán)糊精為模型，在其邊壁上引入具有催化性質的組胺基團，并進一步與Cu²⁺絡合得到了具有天然酶活性的模擬酶，可催化鄰苯二酚氧化生成鄰苯二醌；具有催化活性高，不會失活等特點。
文檔編號C12N9/02GK101407793SQ200810120480
公開日2009年4月15日 申請日期2008年9月8日 優(yōu)先權日2008年9月8日
發(fā)明者盧曉春, 秉 王, 胡智文 申請人:浙江理工大學