本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點修飾ALS基因獲得抗除草劑水稻的系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是繼ZFNs和TALENs技術(shù)之后出現(xiàn)的基因組定點編輯新技術(shù)。與ZFNs和TALENs不同的是，CRISPR/Cas9系統(tǒng)對靶位點的識別依賴于核酸之間堿基互補配對，可對任何緊隨PAM(NGG)的20bp的靶點序列進行編輯，且其靶點在基因組中的分布頻率很高，因此對于需要定點編輯的靶基因，更容易找到合適的靶位點；另外CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時對同一基因的不同位點或多個基因的位點進行定向編輯，使其運用更加靈活；此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作簡單快捷，每次打靶只需替換原有載體上20-30bp的核苷酸序列，更適宜規(guī)模化，高通量操作。CRISPR/Cas9作為一種新的靶向基因修飾技術(shù)，展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展?jié)摿蛻?yīng)用前景，有望成為未來基因定向編輯的最強有力的工具之一。目前已經(jīng)應(yīng)用于水稻、小麥、擬南芥以及本生煙基因組的定點敲除研究中，但尚未有進行重要農(nóng)作物目標農(nóng)藝性狀通過定點修飾(氨基酸替換或定點整合)進行遺傳改良的研究。

利用CRISRP/Cas9系統(tǒng)在作物中對基因組編輯主要分為三種，基因的定點敲除方法獲得突變體、對靶標基因的定點修飾及外源基因定點整合。因定點敲除操作方便，技術(shù)成熟等特點，在現(xiàn)有報道中最多。Shan等(2013)成功獲得水稻OsBADH2、OsPDS基因突變體，突變概率為7.1％-9.4％。Wang等(2013)利用CRISPR技術(shù)成功定點敲除小麥TaMLO-A1基因。Miao等(2013)對水稻葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角控制基因LAZY進行編輯，結(jié)果表明，有83.3％的T₀代轉(zhuǎn)基因植株中CAO1基因相應(yīng)位點發(fā)生了突變，而有高達91.6％的轉(zhuǎn)基因植株中LAZY基因相應(yīng)位點發(fā)生了突變，其中LAZY基因的突變純合體的比例達到50％，均表現(xiàn)出分蘗夾角變大的表型。Zhang等(2014)對2個水稻亞種(粳稻日本晴和秈稻Kasalath)11個靶基因中CRISPR/Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生突變的效率、特點、遺傳性及特異性等進行分析，T₀代轉(zhuǎn)基因植株突變效率高達66.7％，而且超過一半的靶基因位點在T₀代獲得純合突變體，突變體后代的遺傳傳遞符合經(jīng)典的孟德爾定律。Ma等(2015)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)共編輯水稻中46個靶位點，突變率平均為85.4％，大部分為均一的雙等位突變(54.9％)和純合突變(24.7％)，并可遺傳到后代。以上研究說明，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)可實現(xiàn)對作物特定基因的高效定點突變。

利用CRISRP/Cas9系統(tǒng)對植物進行定點氨基酸替換和外源基因定點整合的研究，目前只有幾例報道。Miao等(2013)通過將GUUS基因與CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時轉(zhuǎn)入到水稻中，可檢測到GUS活性，說明同源重組發(fā)生。Schiml等(2014)將CRISPR/Cas9以及兩端含有與spacer相同序列的模板DNA構(gòu)建到同一個T-DNA中轉(zhuǎn)化擬南芥，通過同源重組DNA修復(fù)途徑，在AtADH1基因的靶標位點精確插入卡那霉素的抗性基因nptII。Li等(2015)將外源片段和CRISPR/Cas9同時導(dǎo)入大豆中，并在愈傷組織中檢測到成功定點修飾的ALS1基因，但尚未獲得植株。但將抗潮霉素基因表達盒與CRISPR/Cas9系統(tǒng)同時導(dǎo)入到大豆中，通過PCR及Southern鑒定確定獲得同源重組株系，整合基因的遺傳符合孟德爾遺傳規(guī)律。Svitashev等(2015)通過同源重組方法將liguleless-1基因定點重組到玉米基因組中。此外，將CRISPR/Cas9系統(tǒng)和外源修飾片段(雙鏈和單鏈DNA)同時通過基因槍或農(nóng)桿菌方法導(dǎo)入玉米中，成功將ALS2的第165位的脯氨酸修飾為絲氨酸(P165S)的植株并獲得磺脲類除草劑抗性。

通過基因組編輯介導(dǎo)的同源重組，定點修飾提高重要農(nóng)作物的除草劑抗性，是目前基因組編輯研究領(lǐng)域的熱點之一。傳統(tǒng)獲得抗除草劑作物方法主要是(1)通過外源基因?qū)?epsps，bar，pmi等)提高農(nóng)作物的除草劑抗性，已經(jīng)有多項報道，但因為是屬于轉(zhuǎn)基因作物，其在重要糧食作物中的推廣應(yīng)用受到限制，目前尚未有抗除草劑的轉(zhuǎn)基因小麥和水稻商業(yè)化生產(chǎn)的報道。此外，抗除草劑基因漂移可能形成超級雜草等轉(zhuǎn)基因生物安全問題而備受關(guān)注。(2)植物氨基酸合成中的關(guān)鍵酶一直是新型除草劑研發(fā)中重要的靶標酶。通過EMS將作物內(nèi)源基因突變，提高重要農(nóng)作物的除草劑抗性，已經(jīng)在小麥、大麥和水稻等有相關(guān)報道。但因EMS突變的隨機性，需要大面積廣泛篩選具有除草劑抗性和其它農(nóng)藝性狀未改變的突變體，因此，此技術(shù)很難得到廣泛應(yīng)用。

靶標乙酰乳酸合成酶(ALS)抑制劑類除草劑雙草醚是目前開發(fā)最活躍的領(lǐng)域之一。乙酰乳酸合成酶(Acetolactate synthase,ALS)存在于植物中，它能催化丙酮酸為乙酰乳酸，具有高度專一性和極高的催化效率，從而合成植物體內(nèi)3種必需的支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸)?；请孱?、咪唑啉酮類、嘧啶羧酸類除草劑可抑制ALS活性，破壞植物體內(nèi)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的合成，從而導(dǎo)致植物死亡。Swanson等(1989)利用小孢子化學(xué)誘變的方法獲得2個抗咪唑啉酮類除草劑的油菜突變體PMl和PM2，PMl和PM2都由ALS基因點突變而成，其中PMl是基因BnALS1的第653位絲氨酸發(fā)生突變，PM2是基因BnALS2的第574位色氨酸發(fā)生突變(以擬南芥的ALS氨基酸位置計算)(Hattori et al.1995)。2014年3月，Cibus Global公司利用單核苷酸基因修復(fù)技術(shù)(Gene Repair OligoNucleotide technology)，成功獲得了ALS基因編輯后抗磺脲類除草劑油菜，目前已經(jīng)在加拿大獲得商業(yè)化生產(chǎn) (http://www.cibus.com/technology.php)。磺脲類、咪唑啉酮類、嘧啶羧酸類除草劑廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)中，具備生物活性高、殺草譜廣的優(yōu)點，并且對人和動物具有安全性(Endo et al.,2007)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何獲得抗除草劑的水稻。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了用于植物基因組定點修飾的系統(tǒng)。

本發(fā)明所提供的用于植物基因組定點修飾的系統(tǒng)，含有用于植物基因組定點修飾的載體和供體DNA；所述用于植物基因組定點修飾的載體含有Cas9蛋白表達盒、gRNA表達盒和供體DNA；所述gRNA表達盒編碼兩種gRNA，所述兩種gRNA分別靶向于目的植物的靶DNA的兩個靶位點；所述靶DNA中待定點修飾片段位于所述兩個靶位點之間；所述兩個靶位點中位于上游的靶位點為上游靶位點，位于下游的靶位點為下游靶位點；

所述供體DNA含有所述上游靶位點、所述下游靶位點和位于所述上游靶位點和所述下游靶位點之間的定點修飾片段；所述定點修飾片段為要替換所述待定點修飾片段的DNA片段。

上述系統(tǒng)中，所述定點修飾可為氨基酸替換，外源基因定點整合或外源片段定點整合。

上述系統(tǒng)中，所述供體DNA還含有用于和所述靶DNA進行同源重組的上游同源臂和下游同源臂，所述上游同源臂位于所述上游靶位點與所述定點修飾片段之間，所述下游同源臂位于所述定點修飾片段與所述下游靶位點之間。

上述系統(tǒng)中，所述植物或所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物可為禾本科植物，進一步的，所述禾本科植物具體可為水稻。

上述系統(tǒng)中，所述靶DNA可為編碼乙酰乳酸合成酶的基因；所述乙酰乳酸合成酶為a1或a2的蛋白質(zhì)：

a1、氨基酸序列是SEQ ID No.2的蛋白質(zhì)；

a2、在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基得到的具有乙酰乳酸合成酶活性的由a1衍生的蛋白質(zhì)。

上述系統(tǒng)中，所述靶DNA的核苷酸序列為SEQ ID No.3所示。

上述系統(tǒng)中，所述上游靶位點序列為SEQ ID No.1的第7590-7609位所示的DNA片段；所述下游靶位點序列為SEQ ID No.1的第8032-8051位所示的DNA片段；所述定點修飾片段為SEQ ID No.1的第7716-7979位所示的DNA片段。

上述系統(tǒng)中，所述gRNA表達盒包括gRNA表達盒1和gRNA表達盒2，所述gRNA表達盒1編碼gRNA1(如gRNAW548L)，所述gRNA表達盒2編碼gRNA2(如gRNAS627I)，所述gRNA1靶向于所述上游靶位點，所述gRNA2靶向于所述下游靶位點。

上述系統(tǒng)中，所述Cas9蛋白表達盒包括啟動Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動子(如Ubiquitin啟動子)、Cas9蛋白基因和終止Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的終止子(如NOS終止子)；所述gRNA表達盒1包括啟動gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子(如水稻U3啟動子)、所述gRNA1編碼基因和終止所述gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的終止子(如Poly-A終止子)；所述gRNA表達盒2包括啟動gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的啟動子(如水稻U3啟動子)、所述gRNA2編碼基因和終止所述gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的終止子(如Poly-T終止子)。

上述系統(tǒng)中，所述gRNA表達盒1(如gRNAW548L表達盒)的序列為SEQ ID No.1的第261-747位所示的DNA片段；所述gRNA表達盒2(如gRNAS627I表達盒)的序列為SEQ ID No.1的第8328-8814位所示的DNA片段。

上述系統(tǒng)中，所述用于植物基因組定點修飾的載體可為重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor，其為SEQ ID No.1所示的載體。SEQ ID No.1的第900-7570位所示的核苷酸序列為所述Cas9蛋白表達盒，SEQ ID No.1的第5580-7570位所示的核苷酸序列為啟動所述Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的Ubiquitin啟動子,SEQ ID No.1的第1446-5576位所示的核苷酸序列為所述Cas9蛋白基因，SEQ ID No.1的第900-1152位所示的核苷酸序列為所述終止Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的NOS終止子；SEQ ID No.1的第261-747位所示的核苷酸序列為所述gRNA表達盒1,SEQ ID No.1的第367-747位所示的核苷酸序列為啟動所述gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的水稻U3啟動子，SEQ ID No.1的第271-366位所示的核苷酸序列為所述gRNA1編碼基因，SEQ ID No.1的第261-270位所示的核苷酸序列為終止所述gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的Poly-A終止子；SEQ ID No.1的第8328-8814位所示的核苷酸序列為所述gRNA表達盒2,SEQ ID No.1的第8328-8708位所示的核苷酸序列為啟動所述gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的水稻U3啟動子，SEQ ID No.1的第8709-8804位所示的核苷酸序列為所述gRNA2編碼基因，SEQ ID No.1的第8805-8814位所示的核苷酸序列為終止所述gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的Poly-T終止子；SEQ ID No.1的第7590-8051位所示的核苷酸序列為所述供體DNA(arm donor)，SEQ ID No.1的第7590-7609位所示的核苷酸序列為所述上游靶位點，SEQ ID No.1的第7616-7715位所示的核苷酸序列為所述上游同源臂，SEQ ID No.1的第7716-7979位所示的核苷酸序列為所述定點修飾片段，SEQ ID No.1的第7980-8025位所示的核苷酸序列為所述下游同源臂，SEQ ID No.1的第8032-8051位所示的核苷酸序列為所述下游靶位點。

上述系統(tǒng)還可包括進行PCR擴增所需的其它試劑、進行凝膠電泳所需的試劑、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)和照相機。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種用于植物基因組定點修飾的方法。

本發(fā)明所提供的一種用于植物基因組定點修飾的方法，包括向目的植物中導(dǎo)入所 述用于植物基因組定點修飾的系統(tǒng)，得到植物基因組被定點修飾的植物。

上述方法中，所述用于植物基因組定點修飾的系統(tǒng)中所述用于植物基因組定點修飾的載體和所述供體DNA的摩爾比可為1：(0-40)，具體可為1:20。

上述方法中，所述定點修飾可為氨基酸替換，外源基因定點整合或外源片段定點整合。

上文中，定點修飾具體可為將乙酰乳酸合成酶(ALS)的第548位色氨酸(W)突變?yōu)榱涟彼?L)和第627位絲氨酸(S)突變?yōu)楫惲涟彼?I)。

本發(fā)明還提供了下述1)-5)中任一種應(yīng)用：

1)上述系統(tǒng)在植物基因組定點修飾中的應(yīng)用；

2)上述系統(tǒng)在培育基因組被定點修飾的植物中的應(yīng)用；

3)上述系統(tǒng)在培育抗除草劑植物中的應(yīng)用；

4)上述系統(tǒng)在植物育種中的應(yīng)用；

5)上述系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因植物研究中，利用定點修飾后的ALS基因作為篩選標記基因的應(yīng)用。

上述應(yīng)用中，所述定點修飾可為氨基酸替換，外源基因定點整合或外源片段定點整合。

上述應(yīng)用中，所述定點修飾后的ALS基因是將SEQ ID No.2所示的乙酰乳酸合成酶中的第548位色氨酸(W)(野生型中該位置的色氨酸的密碼子為TGG)突變?yōu)榱涟彼?L)(該位置亮氨酸的密碼子為TTG)，第627位絲氨酸(S)(野生型中該位置的絲氨酸的密碼子為AGT)突變?yōu)楫惲涟彼?I)(該位置異亮氨酸的密碼子為ATT)，其它氨基酸殘基不變得到的乙酰乳酸合成酶定點修飾蛋白的編碼基因。

上述應(yīng)用中，所述除草劑可為嘧啶羧酸類、磺脲類或咪唑啉酮類除草劑，具體可為嘧啶羧酸類除草劑，進一步的，所述嘧啶羧酸類除草劑具體可為雙草醚(BS)。

上文中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述目的植物可為單子葉植物或雙子葉植物；所述單子葉植物可為禾本科植物，所述禾本科植物具體可為水稻。

實驗證明，采用本發(fā)明的體外構(gòu)建含有Cas9蛋白的表達盒、兩個靶點的gRNA表達盒、及外源片段arm donor(供體DNA)兩端加兩個gRNA可識別的靶點序列的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor與外源片段arm donor通過基因槍方法共轉(zhuǎn)化水稻愈傷組織，能夠成功將乙酰乳酸合成酶(ALS)中的第548位色氨酸(W)突變?yōu)榱涟彼?L)和第627位絲氨酸(S)突變?yōu)楫惲涟彼?I)，實現(xiàn)了水稻ALS基因的定點修飾，獲得了同源重組的純合系植株，無脫靶效應(yīng)，并且同源重組的植株具有抗除草劑雙草醚的特性。因此，本研究建立了一種利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點修飾乙酰乳酸合成酶(ALS)基因獲得抗除草劑水稻的技術(shù)體系，同時為在水稻和其它作 物中利用此CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行基因的定點修飾、替換和外源基因定點整合提供了依據(jù)，為改良其它重要農(nóng)作物的農(nóng)藝性狀提供基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor的框架圖。

圖2為部分T₀代定點修飾水稻的PCR產(chǎn)物酶切鑒定結(jié)果。其中，M為DL2000DNA分子量Marker，WT為野生型水稻組植株的PCR產(chǎn)物酶切鑒定結(jié)果。

圖3為Cas9-arm donor組植株的同源重組類型的測序結(jié)果鑒定。其中，WT ALS為野生型水稻植株的ALS的基因；Donor為供體DNA基因型。

圖4為Cas9-arm donor組植株的ALS的第548位氨基酸位點和第627位氨基酸位點附近的核苷酸序列的同義突變結(jié)果。

圖5為檢測Cas9-arm donor組植株中是否存在重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor上相關(guān)序列的鑒定。其中，A為檢測Cas9-arm donor組植株所用引物位置標示圖；B為PCR檢測Cas9-arm donor組植株中是否含有Cas9蛋白基因的瓊脂糖凝膠電泳圖；C為PCR檢測Cas9-arm donor組植株中是否含有g(shù)RNA表達盒的瓊脂糖凝膠電泳圖；D為PCR檢測Cas9-arm donor組植株中隨機整合的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor中的外源片段arm donor是否完整的瓊脂糖凝膠電泳圖；vector為重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor，WT為野生型組水稻植株的PCR產(chǎn)物酶切鑒定結(jié)果。

圖6為噴灑雙草醚(Bispyribac-sodium)36天后植株的生長情況。其中，1、2和3均為雙位點同源重組成功的植株，4、5和6均為野生型水稻植株。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的日本晴水稻(下文中為野生型水稻)種子為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所國家農(nóng)作物種質(zhì)資源保存中心的產(chǎn)品。

下述實施例中的pCXUN質(zhì)粒(吳照祥.水稻雌配子發(fā)育相關(guān)基因FGA1的克隆與初步功能分析[D].福建農(nóng)林大學(xué),2011.)公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得該生物材料，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。

下述實施例中所用到的引物對序列及其用途如表1所示。

表1、所用引物對的序列及用途

下述實施例以日本晴水稻作為將要進行基因組定點修飾的目的植物，以日本晴水稻的乙酰乳酸合成酶基因作為靶DNA(核苷酸序列為SEQ ID No.3)，構(gòu)建將日本晴水稻的乙酰乳酸合成酶的第548位色氨酸(W)(野生型中該位置的色氨酸的密碼子為TGG)突變?yōu)榱涟彼?L)(該位置亮氨酸的密碼子為TTG)，第627位絲氨酸(S)(野生型中該位置的絲氨酸的密碼子為AGT)突變?yōu)楫惲涟彼?I)(該位置異亮氨酸的密碼子為ATT)的定點修飾水稻。

日本晴水稻中的乙酰乳酸合成酶基因中還含有EcoR V酶切位點，供體DNA(arm donor)該酶切位點在不改變氨基酸的情況下被定點突變掉。

實施例1、用于乙酰乳酸合成酶(ALS)基因定點突變的載體的構(gòu)建

將載體pCXUN的XcmI，KpnI及PmeI識別位點依次插入SEQ ID No.1的第1446-5576位，第19-799位和第8272-9086位所示的DNA序列，保持其它DNA序列不變，得到重組表達載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627。測序結(jié)果表明重組表達載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627中含有SEQ ID No.1的第1446-5576位的核苷酸所示的Cas9蛋白基因，SEQ ID No.1的第261-747位核苷酸所示的gRNA表達盒1(gRNAW548L表達盒，編碼gRNAW548L)和SEQ ID No.1的第8328-8814位核苷酸所示的gRNA表達盒2(gRNAS627I表達盒，編碼gRNAS627I)。

將化學(xué)合成定點修飾的ALS基因片段用1osdonorF/6osdonorR引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物同源重組元件，命名為arm-Donor(供體DNA)。用Hind III限制性內(nèi)切酶酶切重組表達載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627并回收，獲得載體酶切后的線性載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627。將線性載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627與arm-Donor進行連接得到重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor(圖1)。測序結(jié)果表明，重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。其中，SEQ ID No.1的第900-7570位所示的核苷酸序列為Cas9蛋白表達盒，SEQ ID No.1的第5580-7570位所示的核苷酸序列為啟動Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的Ubiquitin啟動子,SEQ ID No.1的第1446-5576位所示的核苷酸序列為Cas9蛋白基因，SEQ ID No.1的第900-1152位所示的核苷酸序列為終止Cas9蛋白基因轉(zhuǎn)錄的NOS終止子；SEQ ID No.1的第261-747位所示的核苷酸序列為gRNA表達盒1,SEQ ID No.1的第367-747位所示的核苷酸序列為啟動gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的水稻U3啟動子，SEQ ID No.1的第271-366位所示的核苷酸序列為gRNA1編碼基因，SEQ ID No.1的第261-270位所示的核苷酸序列為終止gRNA1編碼基因轉(zhuǎn)錄的Poly-A終止子；SEQ ID No.1的第8328-8814位所示的核苷酸序列為gRNA表達盒2,SEQ ID No.1的第8328-8708位所示的核苷酸序列為啟動gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的水稻U3啟動子，SEQ ID No.1的第8709-8804位所示的核苷酸序列為gRNA2編碼基因，SEQ ID No.1的第8805-8814位所示的核苷酸序列為終止gRNA2編碼基因轉(zhuǎn)錄的Poly-T終止子；SEQ ID No.1的第7590-8051位所示的核苷酸序列為arm donor(供體DNA)，SEQ ID No.1的第7590-7609位所示的核苷酸序列為上游靶位點，SEQ ID No.1的第7616-7715位所示的核苷酸序列為上游同源臂，SEQ ID No.1的第7716-7979位所示的核苷酸序列為定點修飾片段，SEQ ID No.1的第7980-8025位所示的核苷酸序列為下游同源臂，SEQ ID No.1的第8032-8051位 所示的核苷酸序列為下游靶位點。

實施例2、ALS的第548位和627位雙位點氨基酸定點修飾水稻的獲得及驗證

一、定點修飾水稻的獲得

選取飽滿的日本晴水稻種子，剝?nèi)シN皮，滅菌洗滌后，均勻的點入R1固體培養(yǎng)基(4.3g/L MS& Vitamins鹽+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+300mg/L酪蛋白氨基酸+2.8g/L L-脯氨酸+2mg/L 2，4-D+4g/L植物凝膠，pH 5.8)中，28℃持續(xù)光照2-3周誘導(dǎo)愈傷組織的形成。將誘導(dǎo)得到的愈傷組織用含有濃度為0.3M甘露醇和濃度為0.3M山梨醇的R1培養(yǎng)基高滲處理4-6h后，得到高滲處理后的愈傷組織。

將實施例1中的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor和arm-donor按摩爾比1：20混合后采用基因槍轟擊上述高滲處理的愈傷組織，采用0.6μm的金粉，轟擊壓力為900psi進行轟擊，得到轉(zhuǎn)化后的愈傷組織；將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織在添加濃度為0.3M甘露醇和濃度為0.3M山梨醇的R1培養(yǎng)基上培養(yǎng)16h后轉(zhuǎn)移至含有濃度為50mg/L潮霉素的R1篩選培養(yǎng)基(4.3g/L MS&Vitamins鹽+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+300mg/L酪蛋白氨基酸+2.8g/L L-脯氨酸+2mg/L 2，4-D+4g/L植物凝膠，pH 5.8)上，在28℃條件下持續(xù)光照2周轉(zhuǎn)移至含有濃度為0.4μM Bispyribac-sodium的R1篩選培養(yǎng)基上，在28℃條件下持續(xù)光照2周。選取生長良好呈嫩黃色的陽性愈傷組織，用無菌鑷子移至含有濃度為0.4μM Bispyribac-sodium的R4分化培養(yǎng)基(4.3g/L MS&Vitamins鹽+30g/L蔗糖+0.5g/L MES+2g/L酪蛋白氨基酸+30g/L山梨醇+2mg/L激動素+1mg/L NAA+4g/L植物凝膠，pH 5.8)中，在28℃條件下持續(xù)光照培養(yǎng)。待分化出來的幼苗長至2至5mm時，將幼苗轉(zhuǎn)入不含激素和抗生素的R5培養(yǎng)基(2.15g/L MS&Vitamins鹽+15g/L蔗糖+0.5g/L MES+2g/L植物凝膠，pH 5.8)中，在28℃條件下持續(xù)光照培養(yǎng)2-3周，之后移入土中置于溫室中生長(培養(yǎng)條件為：溫度28-30℃，光照為16h光照/8h黑暗)，共獲得116株T₀代定點修飾水稻，記為Cas9-arm donor組。

將高滲處理后的愈傷組織按照上述Cas9-arm donor組的愈傷組織培育成水稻植株的方法進行培養(yǎng)，但不添加BS和潮霉素篩選劑,獲得非定點修飾水稻，記為野生型組。

二、同源重組植株的鑒定

1、同源重組植株的PCR酶切鑒定

分別選取52株步驟一獲得的Cas9-arm donor組T₀代定點修飾水稻和10株步驟一獲得的野生型組水稻，使用植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京) 有限公司)提取再生植株的葉片DNA。以提取的再生植株的葉片DNA為模板，根據(jù)乙酰乳酸合成酶(ALS)基因序列設(shè)計引物對753F/R進行PCR反應(yīng)，PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，58℃退火40s，72℃延伸1min，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

由于arm-Donor與植物自身ALS基因具有很高的同源性，為了排除arm-Donor對同源重組植株的鑒定的干擾，將引物對753F/R設(shè)在arm-Donor片段兩端，因水稻自身ALS基因含有限制性內(nèi)切酶EcoR V酶切位點，將arm-Donor片段的該位點在不改變氨基酸前提下定點突變掉，因此PCR擴增產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開的即為重組成功的植株，不能夠被限制性內(nèi)切酶EcoR V進行酶切的PCR擴增產(chǎn)物的片段長度為753bp。將PCR擴增產(chǎn)物利用限制性內(nèi)切酶EcoR V進行酶切檢測。

對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明，Cas9-arm donor組有48株T₀代定點修飾水稻均不能被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開(圖2)，有4株植株能被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開，測序結(jié)果表明4株能被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開的植株為一條鏈在ALS的第548位氨基酸的密碼子處發(fā)生同源重組，在ALS的第627位氨基酸的密碼子處沒有發(fā)生同源重組，另外一條鏈在ALS的第548位氨基酸的密碼子處和第627位氨基酸的密碼子處均發(fā)生非同源重組；野生型組水稻均可以被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開。

隨機抽取52株Cas9-arm donor組T₀代定點修飾水稻，利用引物對753F/R得到的PCR擴增產(chǎn)物進行克隆測序分析。分析結(jié)果表明，Cas9-arm donor組沒有被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開的T₀代定點修飾水稻均為同源重組成功植株，并為純合株系，Cas9-arm donor組重組成功植株的ALS與野生型相比，第548位色氨酸(W)(野生型中該位置的色氨酸的密碼子為TGG)均突變?yōu)榱涟彼?L)(該位置亮氨酸的密碼子為TTG)，第627位絲氨酸(S)(野生型中該位置的絲氨酸的密碼子為AGT) 均突變?yōu)楫惲涟彼?I)(該位置異亮氨酸的密碼子為ATT)，其它氨基酸均沒有變化，但是這兩個位點附近的核苷酸發(fā)生同義突變，第548位氨基酸位點附近的核苷酸序列和第627位氨基酸位點附近的核苷酸序列均如圖4所示。

Cas9-arm donor組中的植株B99-9、B99-10、B99-11和B99-12可以被限制性內(nèi)切酶EcoR V切開的植株為部分重組成功，一條鏈上只有ALS的第548位氨基酸的密碼子處同源重組成功，ALS的第627位氨基酸的密碼子處沒有發(fā)生同源重組，另外一條鏈在ALS的第548位氨基酸的密碼子處和第627位氨基酸的密碼子處均發(fā)生非同源重組(表2，圖2，圖3)。

表2、重組結(jié)果的統(tǒng)計

注：Ho代表純合株系，Com-He代表復(fù)合雜合株系，“+”代表檢測結(jié)果為陽性。

2、同源重組植株是否存在重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor上相關(guān)序列的鑒定

根據(jù)重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor序列，分別設(shè)計檢測Cas9蛋白基因的引物對cas9F/R，檢測gRNA表達盒的引物對U3F/R和檢測植株中隨機整合的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor中的外源片段arm donor是否完整的引物對365F/R。上述三種引物對的PCR反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。檢測Cas9蛋白基因的引物對cas9F/R在含有Cas9蛋白基因的植株中擴增得到的片段長度為738bp；檢測gRNA表達盒的引物對U3F/R在含有g(shù)RNA表達盒的植株中擴增得到的片段長度為614bp；檢測植株中隨機整合的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor中的外源片段arm donor是否完整的引物對365F/R在植株中的arm donor全部被編輯時擴增得到的片段長度均為365bp，在植株中的arm donor未被編輯擴增得到的片段長度為841bp，在植株中的arm donor部分被編輯時擴中同時含有365bp和841bp的擴增片段，分別對PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳。

利用檢測Cas9蛋白基因的引物對cas9F/R對步驟一獲得的Cas9-arm donor組52株T₀代定點修飾水稻進行PCR檢測，結(jié)果表明,除了植株B99-9、B99-10、B99-11和B99-12,其它植株均含有Cas9蛋白基因，PCR擴增產(chǎn)物中含有738bp長度的擴增片段。含有Cas9蛋白基因的植株已經(jīng)全部同源重組成功并且為純合株系，所以gRNA無法識別定點修飾后的ALS基因，不存在嵌合體的情況發(fā)生。植株B99-9、B99-10、B99-11和B99-12等4顆植株雖然仍有ALS的第627位點沒有被編輯，但因沒有Cas9蛋白基因的完整序列在內(nèi)，同樣無法再被重新編輯(圖5中B)。

利用檢測gRNA表達盒的引物對U3F/R對步驟一獲得的Cas9-arm donor組52株T₀代定點修飾水稻進行PCR檢測，檢測結(jié)果表明，所有植株均含有g(shù)RNA表達盒(圖5中C)，PCR擴增產(chǎn)物中均含有614bp長度的擴增片段。

利用檢測植株中隨機整合的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor中的外源片段arm donor是否完整的引物對365F/R對步驟一獲得的Cas9-arm donor組52株T₀代定點修飾水稻進行PCR檢測，檢測結(jié)果表明，52株植株中有51株植株全部為大片段缺失類型，即所有外源片段arm donor均被設(shè)計的組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor編輯，gRNA548和gRNA627的存在將外源 片段arm donor切下并用于定點修飾水稻自身ALS基因，因此為大片段缺失類型。其中,植株B99-9為唯一一株仍然存在841bp長片段PCR擴增產(chǎn)物的植株(圖5中D)，測序結(jié)果表明，該植株在ALS的第548和627位點的氨基酸的密碼子處均發(fā)生了非同源重組。

3、重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor的脫靶分析

根據(jù)網(wǎng)上預(yù)測軟件(http://crispr.dbcls.jp/)，分別對gRNA548和gRNA627可能存在的脫靶位點進行預(yù)測，并根據(jù)可能存在脫靶位點的側(cè)翼序列設(shè)計引物對：針對gRNAW548L表達盒的引物對為OFF1F/R和OFF2F/R，針對gRNAS627I表達盒的引物對為OFF3F/R、OFF4F/R和OFF5F/R，利用上述引物對對所獲得的步驟一獲得的Cas9-arm donor組T₀代定點修飾水稻進行PCR擴增，反應(yīng)條件如下：

反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性40s，55℃退火40s，72℃延伸1min s，共進行35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。引物對OFF1F/R、OFF2F/R、OFF3F/R、OFF4F/R和OFF5F/R對脫靶植株的擴增片段長度分別為492bp、606bp、597bp、388bp和382bp。

利用引物對OFF1F/R、OFF2F/R、OFF3F/R、OFF4F/R和OFF5F/R對30顆植株進行PCR擴增，并將PCR擴增產(chǎn)物克隆并測序。檢測結(jié)果表明，所設(shè)計的重組載體pCXUN-cas9-gRNA548-gRNA627-arm donor中g(shù)RNA表達和表達得到的gRNA并不存在脫靶情況(表3)。

表3、靶點脫靶分析

4、同源重組成功的植株對除草劑雙草醚(BS)的抗性鑒定

對野生型水稻和步驟一獲得的ALS的第548位和627位雙位點氨基酸的密碼子處同源重組成功的Cas9-arm donor組T₀代定點修飾水稻噴灑濃度為100μM的雙草醚(Bispyribac-sodium)30-50天后，觀察植株的生長狀態(tài)。

結(jié)果如圖6所示，噴灑濃度為100μM的雙草醚(Bispyribac-sodium)36天后野生型水稻植株枯萎，Cas9-arm donor組T₀代定點修飾同源重組成功的植株生長正常。