一種用于多元蛋白復合物表達的成套載體及其應用的制作方法

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本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種用于多元蛋白復合物表達的成套載體及其應用。

背景技術：

相比于單一的蛋白組分，科學家們將目光逐漸轉(zhuǎn)移到了結(jié)構(gòu)和功能更難研究但也更為重要的多元蛋白復合物上。多元蛋白復合物在許多生物過程中都是重要的調(diào)控元件，除此之外，一些蛋白只有作為復合物的組分時才具有活性。因此，如果能直接研究復合物的結(jié)構(gòu)和功能，那么很多生物學問題就能得到更直觀的解釋。

表達和純化蛋白復合物是結(jié)構(gòu)研究的必要環(huán)節(jié)。大腸桿菌至今依然是最常用的表達重組蛋白的宿主。首先，利用大腸桿菌，可以用很短的時間和很少的成本獲得大量的蛋白；第二，無論是從基因克隆還是蛋白純化方面，大腸桿菌表達體系都已經(jīng)非常成熟，便于進行多種條件的選擇和檢測；第三，作為原核生物，大腸桿菌缺少一些翻譯后修飾，這有時更有利于研究。目前利用大腸桿菌表達體系獲得蛋白復合物有以下幾種途徑：第一，將蛋白復合物各組分單獨純化出來(有些組分的純化可能還涉及變性和復性過程)，在體外重組復合物；第二，在體內(nèi)共表達復合物。在第一種方法中，復合物中某組分在單獨表達的時候可能不可溶，同時體外組裝也可能形成錯誤的復合物。然而，如果將復合物在體內(nèi)實現(xiàn)共表達，可有利于每一蛋白的正確折疊，以及復合物各組分之間正確的互作，更有可能形成可溶的復合物。綜上所述，大腸桿菌體內(nèi)共表達系統(tǒng)在研究蛋白復合物過程中具有巨大的優(yōu)勢。

共表達可以通過單個或多個載體實現(xiàn)。在單基因載體共表達方法中，每個載體攜帶一個基因。在使用多個載體時，每個載體都需要帶有不同的選擇標記、相互兼容的復制子和相似的拷貝數(shù)。然而，大腸桿菌的標記通常為抗生素，在培養(yǎng)時添加多種抗生素會影響細菌的生長速率。而且上述嚴格的要求也為選擇多載體增加了難度。相比于單基因載體，多基因載體可將數(shù)個基因克隆到單個載體上進行共表達。通常情況下，這種載體需要更復雜的多克隆位點，利用不同組限制性內(nèi)切酶實現(xiàn)每一步的克隆。在基因的轉(zhuǎn)錄方面，幾個基因可以位于同一個啟動子下，得到的mRNA是多順反子；如果每個基因都單獨的啟動子控制，那么得到的mRNA是單順反子。一些研究報道，多順反子表達載體會導致不同蛋白表達量不一致，靠近啟動子的蛋白表達量高于下游蛋白，這樣會影響復合物不同組分的得量。

在單順反子表達載體中，每個蛋白都由單獨的啟動子控制，可以掌控表達水平，從而獲得表達量更高的蛋白。這類的載體有：Novagen的pETDuet系列，pET-MCP系列以及pQLink系列等。這些表達載體需要多種限制性內(nèi)切酶位點，為克隆增加了難度。此外，目前這些載體基本上都是以串聯(lián)的方式將各蛋白逐個依次連入，因此隨著復合物中所需組分數(shù)目的增加，共表達載體的構(gòu)建時間需要不斷的延長。所以，構(gòu)建一種可將復合物中各組分進行并聯(lián)拼接的、具有多重轉(zhuǎn)錄單元的共表達載體是當前的迫切需求。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種用于多元蛋白復合物表達的成套產(chǎn)品。

本發(fā)明提供的用于多元蛋白復合物表達的成套產(chǎn)品由m個核心片段和共表達載體組成；

所述m為大于等于1的整數(shù)；所述m個核心片段按照阿拉伯數(shù)字順次命名為核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；

所述核心片段A1從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N、粘性末端1x、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段和粘性末端1y、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列；

所述核心片段A2從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N、粘性末端2x、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段和粘性末端2y、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列；

依次類推，

所述核心片段Am從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N粘性末端mx、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段、粘性末端my、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列；

每個所述核心片段經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；

所述共表達載體由核心片段A和骨架載體組成；

所述共表達載體的核心片段A從5’端起依次包括粘性末端Ax、單堿基N、所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、篩選標記基因、所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N和粘性末端Ay；

所述共表達載體經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的骨架載體上游黏性末端和所述骨架載體下游黏性末端不同且不匹配；

所述核心片段A1經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1y和所述核心片段A2經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2x匹配；

所述核心片段A2經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2y和所述核心片段A3經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端3x匹配；

依次類推；

所述核心片段A m-1經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端(m-1)y和所述核心片段A m經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端mx匹配；

所述共表達載體經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ax和所述核心片段A1經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1x匹配；

所述共表達載體經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ay和所述核心片段A m經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端my匹配。

上述成套產(chǎn)品中，所述用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動外源基因表達的啟動子、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列、篩選標記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達的終止子；

或，所述用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動外源基因表達的啟動子、核糖體結(jié)合位點、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列、篩選標記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達的終止子；

或，所述用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動外源基因表達的啟動子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、 IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列、篩選標記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達的終止子；

或，所述用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動外源基因表達的啟動子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點、蛋白純化標簽、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列、篩選標記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達的終止子。

上述成套產(chǎn)品中，每個所述核心片段經(jīng)過所述IIs型限制性內(nèi)切酶2酶切產(chǎn)生的篩選標記基因上游黏性末端和所述篩選標記基因下游黏性末端不同且不匹配；

每個所述IIs型限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的粘性末端內(nèi)部均不能形成回文結(jié)構(gòu)；

所述核心片段除描述的位置外，其他部分不含所述IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列；

所述共表達載體除描述的位置外，其他部分不含所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列；

所述單堿基N為A、G、C和T中的任意一種。

上述成套產(chǎn)品中，所述IIs型限制性內(nèi)切酶1為BsmBI；

所述IIs型限制性內(nèi)切酶2為BsaI；

所述篩選標記基因為ccdB基因。

上述成套產(chǎn)品中，

所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列如序列表中序列1所示；

所述IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列如序列表中序列2所示。

上述成套產(chǎn)品中，所述m為1、2、3、4、5或6；

m為1時，成套產(chǎn)品由核心片段A1和所述共表達載體組成；

m為2時，成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A3和所述共表達載體組成；

m為3時，成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A5和所述共表達載體組成；

m為4時，成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A7和所述共表達載體組成；

m為5時，成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A9和所述共表達載體組成；

m為6時，成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A10、核心片段A11和所述共表達載體組成；

所述核心片段A1中的粘性末端1x如序列表中序列3所示；

所述核心片段A1中的粘性末端1y如序列表中序列4所示；

所述核心片段A2中的粘性末端2x如序列表中序列5所示；

所述核心片段A2中的粘性末端2y如序列表中序列6所示；

所述核心片段A3中的粘性末端3x如序列表中序列7所示；

所述核心片段A3中的粘性末端3y如序列表中序列8所示；

所述核心片段A4中的粘性末端4x如序列表中序列9所示；

所述核心片段A4中的粘性末端4y如序列表中序列10所示；

所述核心片段A5中的粘性末端5x如序列表中序列11所示；

所述核心片段A5中的粘性末端5y如序列表中序列12所示；

所述核心片段A6中的粘性末端6x如序列表中序列13所示；

所述核心片段A6中的粘性末端6y如序列表中序列14所示；

所述核心片段A7中的粘性末端7x如序列表中序列15所示；

所述核心片段A7中的粘性末端7y如序列表中序列16所示；

所述核心片段A8中的粘性末端8x如序列表中序列17所示；

所述核心片段A8中的粘性末端8y如序列表中序列18所示；

所述核心片段A9中的粘性末端9x如序列表中序列19所示；

所述核心片段A9中的粘性末端9y如序列表中序列20所示；

所述核心片段A10中的粘性末端10x如序列表中序列21所示；

所述核心片段A10中的粘性末端10y如序列表中序列22所示；

所述核心片段A11中的粘性末端11x如序列表中序列23所示；

所述核心片段A11中的粘性末端11y如序列表中序列24所示；

所述核心片段A中的粘性末端Ax如序列表中序列25所示；

所述核心片段A中的粘性末端Ay如序列表中序列26所示。

上述粘性末端序列均指如附圖1所示的核心片段上面那條模板DNA鏈從5’到3’端的序列。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種用于多元蛋白復合物表達的成套載體。

本發(fā)明提供的用于多元蛋白復合物表達的成套載體由m個單基因表達載體和上述共表達載體組成；

所述m為大于等于1的整數(shù)；所述m個單基因表達載體按照阿拉伯數(shù)字順次命名為1號單基因表達載體、2號單基因表達載體、……和m號單基因表達載體；

所述1號單基因表達載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段A1插入骨架載體中得到的載體；

所述2號單基因表達載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段A2插入骨架載體中得到的載體；

依次類推；

所述m號單基因表達載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段Am插入骨架載體中得到的載體。

上述成套載體中，所述單基因表達載體中的骨架載體不含有IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列。

上述成套載體中，所述m為1、2、3、4、5或6；

m為1時，成套載體由1號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

m為2時，成套載體由2號單基因表達載體、3號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

m為3時，成套載體由2號單基因表達載體、4號單基因表達載體、5號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

m為4時，成套載體由2號單基因表達載體、4號單基因表達載體、6號單基因表達載體、7號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

m為5時，成套載體由2號單基因表達載體、4號單基因表達載體、6號單基因表達載體、8號單基因表達載體、9號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

m為6時，成套載體由2號單基因表達載體、4號單基因表達載體、6號單基因表達載體、8號單基因表達載體、10號單基因表達載體、11號單基因表達載體和上述共表達載體組成；

所述1號單基因表達載體為將序列27插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述2號單基因表達載體為將序列28插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述3號單基因表達載體為將序列29插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述4號單基因表達載體為將序列30插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述5號單基因表達載體為將序列31插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述6號單基因表達載體為將序列32插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述7號單基因表達載體為將序列33插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述8號單基因表達載體為將序列34插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述9號單基因表達載體為將序列35插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述10號單基因表達載體為將序列36插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述11號單基因表達載體為將序列37插入到表達載體A的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

所述共表達載體為將序列38插入到表達載體B的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體B的其他序列不變，得到的載體；

所述表達載體A為pET-28b；所述表達載體B為BsmBI和BsaI識別序列均被突變掉的pET-15b載體。

本發(fā)明還有一個目的是提供一種構(gòu)建共表達多元蛋白復合物的重組載體的方法。

本發(fā)明提供的構(gòu)建共表達多元蛋白復合物的重組載體的方法是利用上述產(chǎn)品進行構(gòu)建的，為如下(A)或(B)：

(A)包括如下步驟：

1)將若干個外源蛋白的編碼基因分別加載到上述單基因表達載體中，分別得到若干個表達外源蛋白的單基因表達載體；

2)將所述若干個表達外源蛋白的單基因表達載體和上述共表達載體用IIs型限制性內(nèi)切酶1進行酶切和連接，得到連接產(chǎn)物，即為共表達多元蛋白復合物的重組載體；

(B)包括如下步驟：

1)將若干個外源蛋白的編碼基因分別加載到上述核心片段中，分別得到若干個表達外源蛋白的單基因核心片段；

2)將所述若干個表達外源蛋白的單基因核心片段和上述共表達載體用IIs型限制性內(nèi)切酶1進行酶切和連接，得到連接產(chǎn)物，即為共表達多元蛋白復合物的重組載體。

上述方法中，所述加載的方法為：將所述單基因表達載體、外源蛋白的編碼基因用IIs 型限制性內(nèi)切酶2和連接酶同時進行酶切和連接，使所述外源蛋白的編碼基因替換所述單基因表達載體中的篩選基因，即實現(xiàn)加載。

上述方法中，

所述IIs型限制性內(nèi)切酶1為BsmBI；

所述IIs型限制性內(nèi)切酶2為BsaI。

上述方法中，為操作可行，所述核心片段的上下游兩端還需要添加保護堿基。

上述方法中，所述若干個表達外源蛋白的單基因表達載體由表達外源蛋白1的單基因表達載體、表達外源蛋白2的單基因表達載體、表達外源蛋白3的單基因表達載體、表達外源蛋白4的單基因表達載體和表達外源蛋白5的單基因表達載體組成。

所述表達外源蛋白1的單基因表達載體為將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白的編碼基因的部分片段替換上述2號單基因表達載體中的篩選標記基因；

所述表達外源蛋白2的單基因表達載體為將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps30蛋白的編碼基因替換上述4號單基因表達載體中的篩選標記基因；

所述表達外源蛋白3的單基因表達載體為將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps50蛋白的編碼基因替換上述6號單基因表達載體中的篩選標記基因；

所述表達外源蛋白4的單基因表達載體為將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps60蛋白的編碼基因的部分片段替換上述8號單基因表達載體中的篩選標記基因；

所述表達外源蛋白5的單基因表達載體為將釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Set1蛋白的編碼基因的部分片段替換上述9號單基因表達載體中的篩選標記基因。

上述方法中，

所述釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps25蛋白的編碼基因的部分片段序列為序列39；

所述釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps30蛋白的編碼基因序列為序列41；

所述釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps50蛋白的編碼基因序列為序列43；

所述釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Cps60蛋白的編碼基因的部分片段序列為序列45中第25-1467位；

所述釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Set1蛋白的編碼基因的部分片段序列為序列47中第19-576位。

本發(fā)明的最后一個目的是提供一種共表達多元蛋白復合物的方法。

本發(fā)明提供的共表達多元蛋白復合物的方法包括如下步驟：按照上述方法構(gòu)建得到共表達多元蛋白復合物的重組載體；將所述共表達多元蛋白復合物的重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株中，鑒定正確克隆，提取質(zhì)粒；將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達系統(tǒng)中，實現(xiàn)共表達。

上述方法或者上述成套載體或上述成套產(chǎn)品中，所述匹配為互補配對，即粘性末端(m-1)y與粘性末端mx的互補鏈可以互補配對。

本發(fā)明提供了一種用于多元蛋白復合物表達的成套載體及其應用。該成套載體分為單基因表達載體和共表達接收載體兩部分，單基因克隆載體為卡那霉素抗性，啟動子上游和終止子下游有BsmBI酶切位點，啟動子和終止子間插入ccdB選擇標記基因，ccdB兩側(cè)有BsaI酶切位點；而共表達接收載體為氨芐青霉素抗性，也選擇ccdB作為選擇標記，ccdB兩側(cè)有BsmBI酶切位點。通過試驗證明：蛋白復合物各組分可并行克隆到不同的單基因表達載體中，然后將單基因表達載體和共表達載體在一個管中進行組裝反應，即可得到蛋白復合物共表達載體。本發(fā)明通過IIs型限制性內(nèi)切酶的設計，可使酶切和連接在同一管中進行，中間不需要酶切產(chǎn)物純化等操縱，同時，本發(fā)明的設計可以將多個蛋白的轉(zhuǎn)錄單元一次實驗同時組裝到共表達載體上，因此共表達載體的組裝極大地縮短了克隆時間，而且不同抗性以及ccdB篩選，提高了克隆的效率，另外，共表達載體轉(zhuǎn)錄出單順反子mRNA，可提高蛋白表達量。

附圖說明

圖1為單基因表達載體結(jié)構(gòu)示意圖。其中，BioBrick prefix：生物磚前綴序列；BsmBI:BsmBI識別序列；fx:BsmBI酶切序列；T7 promoter：T7啟動子；lac operator：乳糖操縱基因；RBS:核糖體結(jié)合位點；tag：蛋白純化標簽；BsaI:BsaI識別序列；ccdB:毒素蛋白CcdB基因；T7 terminator:T7終止子；fy:BsmBI酶切序列；BioBrick suffix：生物磚后綴序列。

圖2為蛋白復合物共表達接收載體結(jié)構(gòu)示意圖。其中，BioBrick prefix：生物磚前綴序列；BsmBI:BsmBI識別序列；ccdB:毒素蛋白CcdB基因；BioBrick suffix：生物磚后綴序列。

圖3為單基因表達載體構(gòu)建流程圖。

圖4為復合物共表達接收載體構(gòu)建流程圖。

圖5為將蛋白復合物某組分克隆到單基因表達載體的示意圖。

圖6為蛋白復合物共表達載體的克隆示意圖。

圖7為經(jīng)分子排阻色譜純化后的SDS-PAGE圖像，其中數(shù)字代表收集管編號。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實施例中的用于多元蛋白復合物表達的成套載體的構(gòu)建方法具體包括如下步驟：

1、設計m個核心片段；

m個核心片段按照阿拉伯數(shù)字順次命名為核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am；

核心片段A1從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N、粘性末端1x、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段、粘性末端1y、單堿基N和識別序列；

核心片段A2從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N、粘性末端2x、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段、粘性末端2y、單堿基N和識別序列；

依次類推，

核心片段Am從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N、粘性末端mx、用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段、粘性末端my、單堿基N和識別序列；

每個核心片段經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段上游黏性末端和用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段下游黏性末端不同且不互補；

共表達載體由核心片段A和骨架載體組成；

共表達載體的核心片段從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的粘性末端Ax、單堿基N、識別序列、篩選標記基因、IIs型限制性內(nèi)切酶1的識別序列、單堿基N和粘性末端Ay；

共表達載體經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的骨架載體上游黏性末端和骨架載體下游黏性末端不同且不互補；

核心片段A1經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1y和核心片段A2經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2x匹配；

核心片段A2經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2y和核心片段A3經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端3x匹配；

依次類推；

核心片段A m-1經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端(m-1)y下游黏性末端和核心片段A m經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端mx匹配；

共表達載體經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ax和核心片段A1經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1x匹配；

共表達載體經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ay和核心片段A m經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端my匹配。

用于構(gòu)建外源基因表達盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動外源基因表達的啟動子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識別序列、篩選標記基因、限制性內(nèi)切酶2的識別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止外源基因表達的終止子；

每個核心片段經(jīng)過IIs型限制性內(nèi)切酶2酶切產(chǎn)生的篩選標記基因上游黏性末端和篩選標記基因下游黏性末端不同且不互補；

每個IIs型限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的粘性末端內(nèi)部均不能形成回文結(jié)構(gòu)；

單堿基N為A、G、C和T中的任意一種。

2、單基因表達載體的構(gòu)建

將上述m個核心片段分別插入骨架載體中，分別得到每個單基因表達載體。

實施例1、用于多元蛋白復合物表達的成套載體的構(gòu)建及其應用

一、單基因表達載體的構(gòu)建

本實施例共構(gòu)建了11個單基因表達載體，具體如下：

1號單基因表達載體為將序列27插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

2號單基因表達載體為將序列28插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

3號單基因表達載體為將序列29插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

4號單基因表達載體為將序列30插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

5號單基因表達載體為將序列31插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

6號單基因表達載體為將序列32插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

7號單基因表達載體為將序列33插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

8號單基因表達載體為將序列34插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

9號單基因表達載體為將序列35插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

10號單基因表達載體為將序列36插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

11號單基因表達載體為將序列37插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；

上述各單基因表達載體的構(gòu)建方法如圖3所示，具體步驟如下：

1、1號單基因表達中間載體的構(gòu)建

(1)特征序列的合成

5‘-CAGGAAACAGCTATGACGCATGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGCGTCTCATGGATAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGtAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACGATGCGAGACCATGCGGTCTCCTAGCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTCACTGAGACGTACTAGTAGCGGCCGCTGCAGCTCGAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3’(序列1)；

利用gene design網(wǎng)站(http://54.235.254.95/gd/)的Building Block Design(constant length overlap)的功能，輸入序列3所示的核苷酸分子，得到如下oligos:

5’-CAGGAAACAGCTATGACGCATGCGAATTCGCGGCCGCTTCTAGAGCGTCTC-3’；

5’-GCTCACAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTATCCATGAGACGCTCTAGAAGCGGC-3’；

5’-CTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGTAATAATTTTGTTTAACTTTAAG-3’；

5’-GTCTCGCATCGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAACAAAATTATTACTAGAGGGGAA-3’；

5’-AGAAGGAGATATACGATGCGAGACCATGCGGTCTCCTAGCTAGCATAACCCCT-3’；

5’-CAAAAAACCCCTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGCTAGGAG-3’；

5’-AACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTCACTGAGACGTACTAGTAGCGGCCGCTG-3’；

5’-GTAAAACGACGGCCAGTCTCGAGCTGCAGCGGCCGCTACTAGTAC-3’。

(2)PCR擴增

PCR分兩步進行：

第一步PCR為以上述步驟(1)合成的特征序列為模板進行PCR擴增，得到第一步PCR擴增產(chǎn)物。

第一步PCR反應體系(終濃度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5(High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(終濃度均為30nM)。第一步PCR反應條件如下：98℃,2min，55℃,30s；72℃,20s；1個循環(huán)；98℃,10s,69℃,30s,72℃,20s；5個循環(huán)；98℃,10s,65℃,30s,72℃,20s；5個循環(huán)；98℃,10s,61℃,30s,72℃,20s；20個循環(huán)；72℃2min；10℃保存。

第二步PCR以稀釋5倍的第一步PCR擴增產(chǎn)物為模板，用M13Forward和M13Reverse通用引物擴增進行PCR擴增，得到第二步PCR擴增產(chǎn)物。

第二步PCR反應體系(終濃度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer (NEB B9027S)、Q5(High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(終濃度均為0.5mM)、模板為上述稀釋5倍的基礎上再稀釋10倍。

第二步PCR反應條件如下：98℃2min,55℃30s,72℃,20s；1個循環(huán)；98℃20s；55℃,30s；72℃,20s；25個循環(huán)；72℃3min；10℃保存。

將第二步PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶。

(3)用SphI(SphI-HF NEB R3182L)和XhoI(NEB R0146L)對第二步PCR擴增產(chǎn)物和pET-28b載體(Novagen公司)進行雙酶切，連接，得到重組載體，將其命名為1號單基因表達中間載體，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定后送測序。

測序結(jié)果表明：1號單基因表達中間載體為將pET-28b載體的SphI和XhoI酶切位點間的DNA片段替換為序列49所示的DNA分子且保持pET-28b載體其他序列不變得到的載體。

2、2-11號單基因表達中間載體的構(gòu)建

以1號單基因表達中間載體為模板，分別用表1中2-11號載體對應的引物進行PCR擴增，分別得到PCR擴增產(chǎn)物(粘端方向是按照載體模板鏈5’-3’的方向)。

表1、2-11號單基因表達中間載體的構(gòu)建的引物

PCR反應體系(終濃度)：dNTP(GenStar A114-01)0.2mM、1xQ5reaction buffer(NEB B9027S)、Q5(High-Fidelity DNA Polymerase NEB M0491S)0.02units/μl、引物(終濃度均為0.5mM)、質(zhì)粒模板30ng。PCR反應條件如下：98℃,2min；1個循環(huán)；98℃,30s，54℃,30s，72℃,20s；30個循環(huán)；72℃3min；10℃保存。

分別將PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，回收目的條帶，分別得到PCR回收產(chǎn)物。分別用EcoRI(EcoRI-HF NEB R3101L)和SpeI(SpeI-HF NEB R3133L)雙酶切PCR回收產(chǎn)物和1號單基因表達中間載體，連接，分別得到重組載體，分別將其命名為2-11號單基因表達中間載體，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)酶切鑒定后送測序。

測序結(jié)果表明：2號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI 識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列50所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

3號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列51所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

4號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列52所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

5號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列53所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

6號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列54所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

7號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列55所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

8號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列56所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

9號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列57所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

10號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列58所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體；

11號單基因表達中間載體為將1號單基因表達中間載體的EcoRI和SpeI識別序列間的DNA片段替換為序列表中序列59所示的DNA分子，且保持1號單基因表達中間載體的其他序列不變的載體。

3、1-11號單基因表達載體的構(gòu)建

人工合成序列表中序列60所示的含ccdB基因的序列(內(nèi)部不含BsaI識別序列)，并將其分別插入到1-11號單基因表達中間載體的BsaI(BsaI-HF NEB R3535L)識別序列間，分別得到重組載體，分別將其命名為1-11號單基因表達載體(序列特征見圖1)，并分別將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌OneccdB Survival^TM 2 T1R，經(jīng)酶切鑒定后送測序。

測序驗證表明：1號單基因表達載體為將序列27插入到pET-28b載體的SphI和XhoI識別序列之間，且保持表達載體A的其他序列不變，得到的載體；