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一種用于多元蛋白復(fù)合物表達(dá)的成套載體及其應(yīng)用的制作方法

文檔序號(hào):12584482閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

技術(shù)特征:

1.一種用于多元蛋白復(fù)合物表達(dá)的成套產(chǎn)品,由m個(gè)核心片段和共表達(dá)載體組成;

所述m為大于等于1的整數(shù);所述m個(gè)核心片段按照阿拉伯?dāng)?shù)字順次命名為核心片段A1、核心片段A2、……和核心片段Am;

所述核心片段A1從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列、單堿基N、粘性末端1x、用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段和粘性末端1y、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列;

所述核心片段A2從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列、單堿基N、粘性末端2x、用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段和粘性末端2y、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列;

依次類推,

所述核心片段Am從5’端起依次包括IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列、單堿基N粘性末端mx、用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段、粘性末端my、單堿基N和所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列;

每個(gè)所述核心片段經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段上游黏性末端和所述用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段下游黏性末端不同且不匹配;

所述共表達(dá)載體由核心片段A和骨架載體組成;

所述共表達(dá)載體的核心片段A從5’端起依次包括粘性末端Ax、單堿基N、所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列、篩選標(biāo)記基因、所述IIs型限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列、單堿基N和粘性末端Ay;

所述共表達(dá)載體經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的骨架載體上游黏性末端和所述骨架載體下游黏性末端不同且不匹配;

所述核心片段A1經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1y和所述核心片段A2經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2x匹配;

所述核心片段A2經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端2y和所述核心片段A3經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端3x匹配;

依次類推;

所述核心片段A m-1經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端(m-1)y和所述核心片段Am經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端mx匹配;

所述共表達(dá)載體經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ax和所述核心片段A1經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端1x匹配;

所述共表達(dá)載體經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端Ay和所述核心片段A m經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶1酶切產(chǎn)生的粘性末端my匹配。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的成套產(chǎn)品,其特征在于:所述用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、篩選標(biāo)記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達(dá)的終止子;

或,所述用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi) 切酶2的識(shí)別序列、篩選標(biāo)記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達(dá)的終止子;

或,所述用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、篩選標(biāo)記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達(dá)的終止子;

或,所述用于構(gòu)建外源基因表達(dá)盒的DNA片段從5’端起依次包括驅(qū)動(dòng)外源基因表達(dá)的啟動(dòng)子、乳糖操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、蛋白純化標(biāo)簽、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、篩選標(biāo)記基因、所述限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列、單堿基N、IIs型限制性內(nèi)切酶2產(chǎn)生的粘性末端和終止所述外源基因表達(dá)的終止子。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的成套產(chǎn)品,其特征在于:

每個(gè)所述核心片段經(jīng)過(guò)所述IIs型限制性內(nèi)切酶2酶切產(chǎn)生的篩選標(biāo)記基因上游黏性末端和所述篩選標(biāo)記基因下游黏性末端不同且不匹配;

每個(gè)所述IIs型限制性內(nèi)切酶酶切產(chǎn)生的粘性末端內(nèi)部均不能形成回文結(jié)構(gòu);

所述單堿基N為A、G、C和T中的任意一種。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的成套產(chǎn)品,其特征在于:

所述IIs型限制性內(nèi)切酶1為BsmBI;

所述IIs型限制性內(nèi)切酶2為BsaI;

所述篩選標(biāo)記基因?yàn)閏cdB基因。

5.根據(jù)權(quán)利要求1‐4中任一所述的成套產(chǎn)品,其特征在于:

所述限制性內(nèi)切酶1的識(shí)別序列如序列表中序列1所示;

所述限制性內(nèi)切酶2的識(shí)別序列如序列表中序列2所示。

6.根據(jù)權(quán)利要求1‐5中任一所述的成套產(chǎn)品,其特征在于:

所述m為1、2、3、4、5或6;

m為1時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A1和所述共表達(dá)載體組成;

m為2時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A3和所述共表達(dá)載體組成;

m為3時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A5和所述共表達(dá)載體組成;

m為4時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A7和所述共表達(dá)載體組成;

m為5時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A9和所述共表達(dá)載體組成;

m為6時(shí),成套產(chǎn)品由核心片段A2、核心片段A4、核心片段A6、核心片段A8、核心片段A10、核心片段A11和所述共表達(dá)載體組成;

所述核心片段A1中的粘性末端1x如序列表中序列3所示;

所述核心片段A1中的粘性末端1y如序列表中序列4所示;

所述核心片段A2中的粘性末端2x如序列表中序列5所示;

所述核心片段A2中的粘性末端2y如序列表中序列6所示;

所述核心片段A3中的粘性末端3x如序列表中序列7所示;

所述核心片段A3中的粘性末端3y如序列表中序列8所示;

所述核心片段A4中的粘性末端4x如序列表中序列9所示;

所述核心片段A4中的粘性末端4y如序列表中序列10所示;

所述核心片段A5中的粘性末端5x如序列表中序列11所示;

所述核心片段A5中的粘性末端5y如序列表中序列12所示;

所述核心片段A6中的粘性末端6x如序列表中序列13所示;

所述核心片段A6中的粘性末端6y如序列表中序列14所示;

所述核心片段A7中的粘性末端7x如序列表中序列15所示;

所述核心片段A7中的粘性末端7y如序列表中序列16所示;

所述核心片段A8中的粘性末端8x如序列表中序列17所示;

所述核心片段A8中的粘性末端8y如序列表中序列18所示;

所述核心片段A9中的粘性末端9x如序列表中序列19所示;

所述核心片段A9中的粘性末端9y如序列表中序列20所示;

所述核心片段A10中的粘性末端10x如序列表中序列21所示;

所述核心片段A10中的粘性末端10y如序列表中序列22所示;

所述核心片段A11中的粘性末端11x如序列表中序列23所示;

所述核心片段A11中的粘性末端11y如序列表中序列24所示;

所述核心片段A中的粘性末端Ax如序列表中序列25所示;

所述核心片段A中的粘性末端Ay如序列表中序列26所示。

7.一種用于多元蛋白復(fù)合物表達(dá)的成套載體,由m個(gè)單基因表達(dá)載體和權(quán)利要求1-6中任一所述的共表達(dá)載體組成;

所述m為大于等于1的整數(shù);所述m個(gè)單基因表達(dá)載體按照阿拉伯?dāng)?shù)字順次命名為1號(hào)單基因表達(dá)載體、2號(hào)單基因表達(dá)載體、……和m號(hào)單基因表達(dá)載體;

所述1號(hào)單基因表達(dá)載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段A1插入骨架載體中得到的載體;

所述2號(hào)單基因表達(dá)載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段A2插入骨架載體中得到的載體;

依次類推;

所述m號(hào)單基因表達(dá)載體為將權(quán)利要求1中的所述核心片段Am插入骨架載體中得到的載體。

8.一種構(gòu)建共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的重組載體的方法,利用權(quán)利要求1‐8任一所述產(chǎn)品進(jìn)行構(gòu)建,為如下(A)或(B):

(A)包括如下步驟:

1)將若干個(gè)外源蛋白的編碼基因分別加載到權(quán)利要求7中的所述單基因表達(dá)載體中,分別得到若干個(gè)表達(dá)外源蛋白的單基因表達(dá)載體;

2)將所述若干個(gè)表達(dá)外源蛋白的單基因表達(dá)載體和權(quán)利要求1-6中任一所述的共表達(dá)載體用IIs型限制性內(nèi)切酶1進(jìn)行酶切和連接,得到連接產(chǎn)物,即為共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的重組載體;

(B)包括如下步驟:

1)將若干個(gè)外源蛋白的編碼基因分別加載到權(quán)利要求1-6任一所述的核心片段中,分別得到若干個(gè)表達(dá)外源蛋白的單基因核心片段;

2)將所述若干個(gè)表達(dá)外源蛋白的單基因核心片段和權(quán)利要求1-6中任一所述的共表達(dá)載體用IIs型限制性內(nèi)切酶1進(jìn)行酶切和連接,得到連接產(chǎn)物,即為共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的重組載體。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于:所述加載的方法為:將所述單基因表達(dá)載體、外源蛋白的編碼基因用IIs型限制性內(nèi)切酶2和連接酶同時(shí)進(jìn)行酶切和連接,使所述外源蛋白的編碼基因替換所述單基因表達(dá)載體中的篩選基因,即實(shí)現(xiàn)加載。

10.一種共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的方法,包括如下步驟:按照權(quán)利要求8所述的方法構(gòu)建得到共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的重組載體;將所述共表達(dá)多元蛋白復(fù)合物的重組載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌菌株中,鑒定正確克隆,提取質(zhì)粒;將所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入表達(dá)系統(tǒng)中,實(shí)現(xiàn)共表達(dá)。

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