本發(fā)明屬于植物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及香石竹斑駁病毒的定量檢測方法。

背景技術(shù)：

香石竹(Dianthus caryophyllus L.)是國內(nèi)栽培面積最大、最為普遍的切花，也是出口創(chuàng)匯最多的一種花卉。但由于受到病毒病的影響，香石竹的產(chǎn)量、質(zhì)量不斷下降，主要表現(xiàn)在植株矮小、畸形、花葉壞死、花朵變小、開裂、花碎色等。并且由于香石竹斑駁病毒可在香石竹中累積，防控非常困難。因此，香石竹斑駁病毒的檢測對于防控香石竹斑駁病毒病顯得十分重要。目前，國內(nèi)外香石竹斑駁病毒的檢測方法多以蛋白為基礎(chǔ)的檢測(或血清學(xué)試驗)方法和以核酸為基礎(chǔ)的分子檢測方法，分子檢測方法較傳統(tǒng)檢測方法更為快速、靈敏和準確。

實時熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一種實時定量檢測特定核酸技術(shù)，與普通PCR相比，具有定量準確、快速、靈敏度高、特異性強等特點，目前該項技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于生命科學(xué)研究的各個領(lǐng)域。從原理上包括兩類熒光模式：一類是熒光雜交探針，如Taqman、分子信號等，基于能量共振轉(zhuǎn)移的原理(FRET)；另一類為DNA結(jié)合染料，主要為SYBRGreen I。第一種方法特異性好，需合成特異引物和Taqman熒光探針。后一種方法只需合成特異性引物，但該方法易受引物二聚體的影響，特異性低于前一種方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種能快速、可靠的檢測出香石竹斑駁病毒，并可對所含病毒進行一步法實時定量熒光PCR檢測香石竹斑駁病毒的方法。

本發(fā)明的的技術(shù)方案如下：

1.一組用于一步法實時定量熒光PCR檢測香石竹斑駁病毒的特異性引物和探針，所述特異性引物為香石竹斑駁病毒特異性引物，所述香石竹斑駁病毒特異性引物由香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物和香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物組成，所述香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，所述探針為香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針，所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的堿基序列如SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的5'端標記有FAM報告熒光集團，3'端標記有BHQ淬滅熒光集團。

2.一步法實時定量熒光PCR檢測香石竹斑駁病毒的方法，包括以下步驟：

(一)標準品的制備及其標準曲線的建立

(1)提取被香石竹斑駁病毒感染的香石竹組培苗總RNA，將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；

(2)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因全長的克隆及測序驗證

以步驟(一)(1)反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系如下：

10×PCR含20mM的Mg²⁺緩沖液5.0μl，5U/μL ExTaq DNA聚合酶0.5μl，2.5μM dNTP 1.0μl，20μM擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物1.5μl，20μM擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物1.5μl；cDNA模板4.0μl，ddH₂O 36.5μl，總體積50.0μl；所述擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物的堿基序列如SEQ ID：1，擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物的堿基序列如SEQ ID：2；

PCR反應(yīng)的條件：94℃預(yù)變性4min后，進行30個循環(huán)擴增，每個循環(huán)為94℃變性1min，56℃復(fù)性1min，72℃延伸1min；30個循環(huán)擴增后72℃滅活反應(yīng)10min；

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物的電泳檢測鑒定后選擇片段大小為1047bp的片段進行切膠回收，回收的片段于4℃過夜連接T-A克隆載體，通過加入氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，對陽性克隆進行測序分析，鑒定出DNA片段正向T-A克隆插入載體的陽性重組質(zhì)粒；將篩選出的陽性重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑取單菌落、使用LB液體培養(yǎng)基進行擴繁，離心收集培養(yǎng)的菌體，對菌體進行質(zhì)粒提取、純化，對純化后的陽性重組質(zhì)粒線性化及脫鹽純化；

純化后的陽性重組質(zhì)粒通過SmaI酶切進行線性化處理，具體線性化處理反應(yīng)步驟如下：

10×buffer 5μL，限制性內(nèi)切酶SmaI 1μL，陽性重組質(zhì)粒DNA 2μg，加水至50μl，25℃酶切16h；取1μL反應(yīng)液電泳，酶切，65℃溫育10min中止反應(yīng)；

將經(jīng)線性化的陽性重組質(zhì)粒DNA，進行脫鹽純化，將脫鹽純化的陽性重組質(zhì)粒DNA用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀測定OD260nm/OD 280nm吸光值，測定得到陽性重組質(zhì)粒DNA濃度；

(3)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄

采用體外轉(zhuǎn)錄方法對陽性重組質(zhì)粒DNA進行體外轉(zhuǎn)錄，一個標準的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為總體積100μl，在室溫下，按如下順序加樣制備下列反應(yīng)體系：

①T7 Transcrition 5×Buffer 20μl；

②25mM ATP，CTP，GTP，UTP各7.5μl；

③線性化的重組質(zhì)粒DNA 5μg；

④T7 Enzyme Mix 10μl；

⑤DEPC水加至100μl混勻后，37℃恒溫反應(yīng)2～4h，得標準品目標基因CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA；

(4)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA濃度測定及標準品的制備

用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀測定標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA濃度，根據(jù)以下公式計算其拷貝數(shù)：

拷貝數(shù)＝標準品RNA質(zhì)量濃度×阿氏常數(shù)/ssRNA分子量，拷貝數(shù)單位是copies/μl，標準品RNA質(zhì)量濃度單位是ng/μl，其中，阿氏常數(shù)為6.02×10²³，ssRNA分子量＝一個堿基對的分子質(zhì)量×片段長度，一個堿基對分子質(zhì)量為345道爾頓/堿基；

(5)標準曲線的制作

用EASY dilution對標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA進行梯度稀釋，配制拷貝數(shù)為2×10²-2×10⁶copies陽性ssRNA制作標準曲線。

標準品的一步法實時定量熒光PCR檢測反應(yīng)體系為20μl：其中2×RT-PCR Buffer III 10μl，5U/μl Ex Taq HS 0.4μl，RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針0.8μl，所得標準品稀釋后的2×10²-2×10⁶copies陽性ssRNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl；

所述香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的堿基序列如SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的5'端標記有FAM報告熒光集團，3'端標記有BHQ淬滅熒光集團；

所述標準品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)程序為：42℃反轉(zhuǎn)錄5min后；40個循環(huán)擴增，每個循環(huán)擴增為95℃變性10s，95℃10s，60℃30s，稀釋濃度均能產(chǎn)生熒光信號，Ct值分別為27.41，24.59，21.22，17.77，14.29；由擴增曲線得到的標準曲線斜率為-3.307，標準曲線Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998；

(二)待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測

(1)待測樣品為香石竹葉片，提取待測樣品總RNA

(2)待測樣品總RNA濃度的測定

利用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀準確測定樣品總RNA濃度；

(3)待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測，

所述待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)體系除將步驟(一)(5)所述標準品的一步法實時熒光PCR檢測PCR反應(yīng)體系中所述的標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA 2μl替換為步驟(二)(2)所得的待測樣品的總RNA 2μl外，其PCR反應(yīng)體系中的其余成分及濃度和用量與步驟(一)(5)所述標準品的一步法實時熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)體系相同；待測樣品的一步法實時定量熒光PCR反應(yīng)程序與步驟(一)(5)所述標準品的一步法實時熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)程序相同，得到待測樣品Ct值，根據(jù)(一)(5)所得標準曲線進行待測樣品拷貝數(shù)計算。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明設(shè)計的香石竹斑駁病毒的實時定量PCR檢測的引物及Taqman熒光探針，克服了現(xiàn)有分子檢測方法操作復(fù)雜或檢測靈敏度不高、或特異性不強、或重復(fù)性不強的缺陷，本發(fā)明的特異性強，對的香石竹斑駁病毒檢測靈敏度為2×10²-2×10⁶copies/μl，建立了標準品擴增曲線及標準曲線后，只需按常規(guī)方法提取待測樣品的總RNA，采用本發(fā)明的特異性引物和探針，采用本發(fā)明的一步法實時定量PCR反應(yīng)，即能準確判斷出待測樣品是否感染了香石竹斑駁病毒，及所感染的香石竹斑駁病毒含量。其檢查方法操作簡便、準確可靠、快速、重復(fù)性好。

2、本發(fā)明建立的一種新的一步法實時定量熒光PCR檢測香石竹斑駁病毒的方法技術(shù)平臺，不僅對香石竹斑駁病毒的新檢測方法的發(fā)展具有重要的理論意義，而且對提升香石竹斑駁病毒病原檢測水平，防止香石竹斑駁病毒危險病原微生物傳入我國具有重要的實踐意義和應(yīng)用前景。

3、本發(fā)明方法適合于口岸檢驗檢疫，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、植物保護、科研單位等部門使用，具有廣泛的應(yīng)用前景和科研價值。

序列表中SEQ ID NO：1所示的是擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：2所示的是擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：3所示的是香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：4所示的是香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物的堿基序列。

序列表中SEQ ID NO：5所示的是香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的堿基序列，在所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的5'端標記有FAM報告熒光集團，3'端標記有BHQ淬滅熒光集團。

附圖說明

圖1是標準品香石竹斑駁病毒CP基因克隆及RNA凝膠電泳圖。圖1中，圖A是標準品香石竹斑駁病毒CP基因質(zhì)粒載體，圖B是標準品香石竹斑駁病毒CP基因質(zhì)粒載體線性酶切凝膠電泳圖，圖C是標準品香石竹斑駁病毒CP基因RNA體外合成凝膠電泳圖，圖D是標準品香石竹斑駁病毒CP基因體外合成RNA純化凝膠電泳圖。

圖2是用本發(fā)明一步法實時定量熒光熒光PCR方法檢測標準品香石竹斑駁病毒CP基因體外轉(zhuǎn)錄RNA的標準曲線擴增圖，圖2中橫坐標是循環(huán)數(shù)，縱坐標是相對熒光強度，曲線從左至右香石竹斑駁病毒CP基因體外轉(zhuǎn)錄RNA拷貝數(shù)依次為：2×10⁶copy/μl，2×10⁵copy/μl，2×10⁴copy/μl，2×10³copy/μl，2×10²copy/μl。

圖3是用本發(fā)明一步法實時定量熒光熒光PCR方法檢測標準品香石竹斑駁病毒CP基因體外轉(zhuǎn)錄RNA的標準曲線。圖3中橫坐標是拷貝數(shù)濃度copy/μl，縱坐標是Ct值，標準曲線斜率為-3.307，標準曲線Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998。

圖4是用本發(fā)明一步法實時定量熒光熒光PCR方法檢測待測樣品的擴增曲線，圖4中橫坐標是循環(huán)數(shù)，縱坐標是相對熒光強度，1和2表示樣品Y-1擴增曲線，3和4表示樣品Y-2擴增曲線。

圖5是用本發(fā)明一步法實時定量熒光熒光PCR方法檢測待測樣品Y-1和Y-2的Ct值所對應(yīng)的濃度。圖5中橫坐標是拷貝數(shù)濃度copy/μl，縱坐標是Ct值。

具體實施方式

以下結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的詳細說明，實施例中無特殊說明的為常規(guī)方法。實施例所用的各試劑及載體均可從商業(yè)渠道購買。

實施例1

(一)標準品的制備及其標準曲線的建立

(1)PCR引物設(shè)計

從NCBI中搜索目前已登錄的香石竹斑駁病毒CP基因的序列，GenBank登錄號為HQ660513，應(yīng)用引物設(shè)計軟件，設(shè)計擴增香石竹斑駁病毒CP基因全長引物，特異性引物和Taqman探針。引物設(shè)計時注意擴增片段長短及引物自身和引物間二聚體的問題。

所設(shè)計的擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

所設(shè)計的擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

所設(shè)計的香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。

所設(shè)計的香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：4所示。

所設(shè)計的香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的堿基序列如序列表中SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的5'端標記有FAM報告熒光集團，3'端標記有BHQ淬滅熒光集團。

以上設(shè)計的擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物、擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物、香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物、香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物和香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針由上海捷瑞生物工程有限公司公司合成。

(2)標準品總RNA提取

所述標準品即香石竹斑駁病毒標準品。

①經(jīng)血清反應(yīng)檢測后確定被感染香石竹斑駁病毒的香石竹葉片樣品提取總RNA，血清檢測方法參照孔寶華等發(fā)表論文：題目香石竹斑駁病毒的鑒定和RT-PCR檢測，植物保護2002(28)5-8。將100mg被感染香石竹斑駁病毒的香石竹葉片在液氮研磨后至于2ml離心管中，隨即加入1ml Trizol，勻漿于冰上放置10min；

②加入200μl氯仿、劇烈震蕩30s，放于冰上15min，4℃，12000r/min，離心10min；

③取上清液至另一2ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕搖勻，放置于-20℃冰箱20min；

④4℃12000r/min離心15min，棄上清，加入75％v/v乙醇洗滌，輕輕混勻；4℃12000/min離心10min，用槍頭吸干乙醇，干燥30min，所得沉淀溶解在25μl DEPC水中即得標準品總RNA。

(3)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

cDNA合成反應(yīng)體系20μl：

取上述步驟(一)(2)所得的標準品總RNA 2.0μg，50μM隨機六聚體引物1μl，5×RT Buffer 4μl，10mM dNTP 1μl，RNase Inhibior 0.5μl，RNase 1μl，DEPC H₂O補至20μl，反應(yīng)條件為42℃水浴1h，獲得cDNA。

(4)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因全長的克隆及測序驗證

以上述實施例1步驟(一)(3)合成的cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增反應(yīng)體系如下：

10×PCR含20mM的Mg²⁺緩沖液5.0μl，5U/μl ExTaq DNA聚合酶0.5μl，2.5μM dNTP 1.0μl；20μM擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物1.5μl，20μM擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物1.5μl，實施例1步驟(一)(3)所得的cDNA模板4.0μl，ddH₂O 36.5μl，總體積50.0μl；所述擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因正向引物的堿基序列如SEQ ID：1所示，擴增香石竹斑駁病毒CP全長基因反向引物的堿基序列如SEQ ID：2所示；PCR反應(yīng)的條件：94℃預(yù)變性4min后，進行30個循環(huán)擴增，每個循環(huán)為94℃變性1min，56℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，30個循環(huán)擴增后72℃滅活反應(yīng)10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR產(chǎn)物的電泳檢測鑒定后選擇片段大小為1047bp的片段進行切膠回收?；厥盏腜CR產(chǎn)物于4℃過夜連接pGEM-T Easy載體，通過加入氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆，對篩選出的陽性克隆進行PCR檢測，并對陽性克隆送上海捷瑞生物工程有限公司進行測序，對測序所得序列經(jīng)Blast比對，鑒定出DNA片段正向插入pGEM-T Easy載體的重組陽性質(zhì)粒。因此，驗證了所設(shè)計引物SEQ：NO.1和SEQ：NO.2可以擴增得到香石竹斑駁病毒CP基因全長基因片段。

(5)陽性重組質(zhì)粒的線性化處理

將最終篩選的陽性重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM110感受態(tài)細胞，挑取單菌落，使用LB液體培養(yǎng)基進行擴繁。離心收集大量培養(yǎng)的菌體，利用質(zhì)粒大量快速提取試劑盒對菌液進行質(zhì)粒抽提重組陽性質(zhì)粒進行線性化處理：

陽性重組質(zhì)粒通過SmaI酶切進行線性化處理，具體方法步驟如下：10×T buffer 5μl，SmaI 1μl，陽性重組質(zhì)粒DNA 2μg，加水至50μl，25℃酶切16h，取1ul反應(yīng)液電泳檢測，65℃溫育10min中止反應(yīng)。

將經(jīng)線性化處理的陽性重組質(zhì)粒DNA用PCR試劑盒提供方法純化。

將純化后的陽性重組質(zhì)粒DNA用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀測定OD260nm/OD 280nm吸光值，測定得到陽性重組質(zhì)粒DNA濃度。

(6)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄

采用Promega公司的RiboMAX Large ScaleRNA Produciton Systems-T7試劑盒進行體外轉(zhuǎn)錄，一個標準的體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為100μl

在室溫下，按如下順序加樣制備下列反應(yīng)體系：

①T7 Transcription 5×Buffer 20μl；

②25mM ATP7.5μl，25mM CTP7.5μl，25mM GTP7.5μl和25mM UTP 7.5μl；

③線性化的重組質(zhì)粒5μg；

④T7 Enzyme Mix 10μl；

⑤DEPC水至100μl混勻后，37℃恒溫反應(yīng)4h，得標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA。

(7)標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA濃度測定及香石竹斑駁病毒標準品溶液配制

用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀準確測定香石竹斑駁病毒標準品目標基因香石竹斑駁病毒CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總RNA濃度，根據(jù)以下公式計算其拷貝數(shù)：拷貝數(shù)＝標準品RNA質(zhì)量濃度×阿氏常數(shù)/ssRNA分子量，拷貝數(shù)單位是copies/μl，標準品RNA質(zhì)量濃度單位是ng/μl其中，阿氏常數(shù)為6.02×10²³，ssRNA分子量＝一個堿基對的分子質(zhì)量×片段長度，一個堿基對的分子質(zhì)量為345道爾頓/堿基。

(8)標準曲線的制作

用EASY dilution進行梯度稀釋，配制拷貝數(shù)為2×10²-2×10⁶copies陽性ssRNA溶液；將稀釋后的ssRNA溶液采用大連寶生物公司一步法實時定量熒光檢測試劑盒進行。PCR反應(yīng)體系為20μl：其中2×One Step RT-PCR Buffer III 10μl，5U/μl TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl，Prime Script RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針0.8μl，步驟(一(7)所得標準品目標基因CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總ssRNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl。

所述香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物的堿基序列如SEQ ID NO：3所示，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物的堿基序列如SEQ ID NO：4所示，所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的堿基序列如SEQ ID NO：5所示，在所述香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針的5'端標記有FAM報告熒光集團，3'端標記有BHQ淬滅熒光集團。

所述標準品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)程序為：42℃反轉(zhuǎn)錄5min；40個循環(huán)擴增，每個循環(huán)擴增為95℃變性10s，95℃10s，60℃30s；結(jié)果表明稀釋濃度均能產(chǎn)生熒光信號Ct值分別為27.41，24.59，21.22，17.77，14.29，由擴增曲線得到的標準曲線斜率為-3.307見擴增曲線圖2，標準曲線Y＝-3.307X+34.285，R²＝0.998，標準曲線見圖3。

(二)待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測

(1)待測樣品為香石竹葉片分別編號為Y-1，Y-2，待測樣品總RNA提取與實施例1步驟(一)(2)相同，每個待測樣品的具體操作如下：

①將100mg待測香石竹葉片液氮研磨后至于2ml離心管中，隨即加入1ml Trizol，勻漿于冰上放置10min；

②加入200μl氯仿。劇烈震蕩30s，放于冰上15min，4℃，12000r/min，離心10min；

③取上清液至另一2ml離心管中，加入等體積的異丙醇，輕輕搖勻，放置于-20℃冰箱2h；

④4℃12000r/min離心15min，棄上清，加入75％v/v乙醇洗滌，輕輕混勻；4℃12000/min離心10min，用槍頭吸干乙醇，干燥30min，所得沉淀溶解在25μl DEPC水中即得待測樣品總RNA。

(2)待測樣品總RNA濃度的測定

利用NanoDrop ND-2000核酸蛋白測定儀準確測定待測樣品總RNA濃度。

(3)待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測

每個待測樣品按如下PCR反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序進行：所述待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)體系除將步驟(一)(8)所述PCR反應(yīng)體系中的步驟(一(7)所得標準品目標基因CP基因的體外轉(zhuǎn)錄總ssRNA 2μl替換為步驟(二)(2)經(jīng)總RNA濃度測定合格的待測樣品的總RNA 2μl外，其PCR反應(yīng)體系中的其余成分及濃度和用量均與步驟(一)(8)所述的PCR反應(yīng)體系相同；其PCR反應(yīng)體系具體如下：

待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)體系具體如下：PCR反應(yīng)體系為20μl：其中2×One Step RT-PCR Buffer III 10μL，5U/μl TaKaRa Ex Taq HS 0.4μl，PrimeScript RT Enzyme Mix II 0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增正向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性擴增反向引物0.4μl，香石竹斑駁病毒特異性檢測Taqman探針0.8μl，步驟(二)(2)經(jīng)總RNA濃度測定合格的待測樣品總RNA 2μl，用RNase Free dd H₂O定容至20μl。

所述待測樣品的一步法實時定量熒光PCR檢測的PCR反應(yīng)程序與步驟(一)(8)所述標準品的一步法實時定量熒光PCR反應(yīng)程序相同，其具體PCR反應(yīng)程序為：42℃反轉(zhuǎn)錄5min后；40個循環(huán)擴增，每個循環(huán)擴增為95℃變性10s，95℃10s，60℃30s，上機得到待測樣品Ct值，2個待測樣品Y-1，Y-2的Ct值是22.80，22.09，其擴增曲線見圖4，其2個待測樣品檢測結(jié)果見標準曲線圖5，根據(jù)標準曲線得到樣品Y-1拷貝數(shù)為2.31×10³copies/μl，樣品Y-2拷貝數(shù)為2.46×10³copies/μl。

SEQUENCE LISTING

<110> 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所

<120> 一步法實時定量熒光PCR檢測香石竹斑駁病毒的方法

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 香石竹（Dianthus caryophyllus L.）

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atggaaaata aaggagaaaa gatc 24

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<213> 香石竹（Dianthus caryophyllus L.）

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<213> 香石竹（Dianthus caryophyllus L.）

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<212> DNA

<213> 香石竹（Dianthus caryophyllus L.）

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<212> DNA

<213> 香石竹（Dianthus caryophyllus L.）

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aaggctgaca ctgtggtggg cga 23