本發(fā)明涉及動物病原分子診斷
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒及其用途。
背景技術(shù)：
：豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)可以引起豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)，又稱“藍(lán)耳病”。該病是一種高度接觸性傳染病，在世界各國引發(fā)了空前的“流產(chǎn)風(fēng)暴”，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)已成為規(guī)?；i場繁殖障礙和呼吸道疾病的主要疫病之一。PRRSV主要導(dǎo)致生產(chǎn)母豬出現(xiàn)繁殖障礙、仔豬出現(xiàn)呼吸系統(tǒng)疾病、公豬精液品質(zhì)下降，其中感染仔豬會導(dǎo)致極大的病死率，感染育肥豬后會導(dǎo)致長期持續(xù)感染帶毒，引起豬群周期性反復(fù)暴發(fā)PRRS，很難徹底凈化。同時PRRSV造成豬群的免疫抑制，引起免疫失敗和繼發(fā)感染，臨床癥狀變得復(fù)雜難辨。PRRSV屬于套式病毒目動脈炎病毒科動脈炎病毒屬，為單股正鏈呈卵圓形或球形的RNA病毒。2006年夏季以來，我國安徽等省暴發(fā)以豬體溫升高、皮膚發(fā)紅和呼吸急促等為主要臨床癥狀的豬傳染病，經(jīng)多個實(shí)驗室研究表明，引起本病的最主要病原為變異的PRRSV(高致病性PRRSV變異株)。經(jīng)過對分離的PRRSV株全序列測序表明：病原的基因序列變化主要是在NsP2基因上非連續(xù)缺失了約30個氨基酸殘基(90個堿基)。當(dāng)前實(shí)驗室常用的診斷豬繁殖與呼吸綜合征的方法包括免疫學(xué)診斷方法和病原檢測方法。免疫學(xué)診斷方法可用于抗體檢測與病原的間接檢測，主要包括以下方法：(1)血凝試驗(HA)和血凝抑制試驗(HI)。由于PRRSV具有凝集血細(xì)胞的特性，因此可用HA-HI試驗來檢測其血凝效價和抗體水平。雖然該方法可進(jìn)行批量的快速檢測，但其敏感性低且特異強(qiáng)不強(qiáng)，只能進(jìn)行種輔助診斷。(2)血清中和試驗(HI)?？捎糜谪i感染PRRSV后的抗體檢測，但由于其操作較為復(fù)雜，因此限制了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用。(3)乳膠凝集試驗(LAT)。較之HA、HI，LAT更經(jīng)濟(jì)、快捷，具有良好的應(yīng)用前景。該方法的不足之處在于只能用于疾病的定性診斷，不能對血清中的抗體滴度或病原含量作出定量評估。(4)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。ELISA方法常用于檢測PRRSV血清抗體，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，因而廣泛用于豬場的常規(guī)檢測。(5)膠體金標(biāo)記技術(shù)(SECGA)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是三大免疫標(biāo)記(熒光素、放射性同位素和酶)的又一大補(bǔ)充。該方法具有敏感性高和特異性強(qiáng)、且使用方便、便于基層使用等優(yōu)點(diǎn)，而缺點(diǎn)在于診斷結(jié)果受主觀因素的影響比較嚴(yán)重，一般用于初期篩查。(6)免疫熒光技術(shù)(IFA)。免疫熒光技術(shù)主要分為直接免疫熒光技術(shù)和間接免疫熒光技術(shù)，而針對PRRSV的檢測多選用后者。免疫熒光技術(shù)具有快速、特異、敏感等優(yōu)點(diǎn)，但在臨床應(yīng)用過程中常受到試驗條件的限制。(7)免疫組織化學(xué)法(immunohistoehemistry，IHC)?？梢栽谑炃衅⒈鶅鼋M織和細(xì)胞制品上檢測病原，亦可用于對動物體內(nèi)病原的動態(tài)分布、半定量等的研究。病原檢測方法主要包括以下方法：(1)病毒分離鑒定。PRRSV分離的首選材料是豬脾臟、淋巴結(jié)、扁桃體和豬肺泡巨噬細(xì)胞。PRRSV分離培養(yǎng)需選用豬肺泡巨噬細(xì)胞(PAM)，PAM來自6-8周齡的豬，這種原代細(xì)胞不是所有實(shí)驗室都易獲取。Marc-145傳代細(xì)胞系可替代PAM，但不支持所有分離株的生長。PRRSV分離最大的缺點(diǎn)是耗時長，需要7-14天才能完成。(2)核酸探針技術(shù)。核酸探針技術(shù)是一種分子水平的檢測技術(shù)，特別適用于疾病的早期診斷，應(yīng)用最廣泛的核酸探針技術(shù)是基因芯片，通過核酸探針與模板進(jìn)行雜交，在有限的載體上可對高通量的樣本或目的基因進(jìn)行檢測。目前來說，該技術(shù)需要大型檢測儀器支持，因此僅適合在實(shí)驗室或大型檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)用。(3)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測技術(shù)(PCR)。20世紀(jì)生物學(xué)領(lǐng)域最偉大的發(fā)明，整個分子生物學(xué)發(fā)展的基礎(chǔ)之一，應(yīng)用領(lǐng)域最為廣泛，技術(shù)最為成熟。趙志權(quán)等參照GeneBank已發(fā)表的PRRSV的Nsp2基因，設(shè)計了1對引物，建立了一種RT-PCR檢測方法。該方法可以區(qū)分高致病性PRRSV毒株與經(jīng)典PRRSV弱毒疫苗株。劉忠華等根據(jù)高致病性PRRSVNsp2基因的缺失信息，設(shè)計了3條特異性引物，以含高致病性PRRSV的Nsp2基因的質(zhì)粒及普通PRRSVVR2332株RNA為模板，建立了快速診斷高致病性PRRSV的RT-PCR方法。郝曉芳等在高致病性PRRSVNsp2基因缺失區(qū)兩端的保守區(qū)設(shè)計并合成了一對引物，建立了一種PRRSV的RT-PCR檢測方法。該方法擴(kuò)增高致病性PRRSV基因組時可獲得230bp的片段，擴(kuò)增經(jīng)典型PRRSV時則獲得320bp的片段，根據(jù)RT-PCR產(chǎn)物大小可將二者區(qū)分開來。但是現(xiàn)有的檢測方法存在以下不足：①檢測時間較長。基于病毒粒子的檢測方法，如病毒分離培養(yǎng)、電鏡觀察等技術(shù)需要進(jìn)行前期準(zhǔn)備、細(xì)胞培養(yǎng)、病毒分離純化、制樣等，需要長時間乃至數(shù)月之久才能獲得最終結(jié)果，難于做到快速診斷；基于普通PCR的檢測方法，需要提取核酸、PCR試劑配置、PCR反應(yīng)、電泳、凝集成像、分析結(jié)果等，做一次病原檢測需要近一天時間。②操作復(fù)雜，技術(shù)要求高。操作過程相對繁瑣，且對操作人員技能要求較高，一般需要專業(yè)專職人員負(fù)責(zé)。③結(jié)果相對不可靠。免疫熒光與ELISA技術(shù)依賴抗體抗原反應(yīng)，可能出現(xiàn)不可避免的交叉反應(yīng)。在檢測方法中檢測步驟越多，過程越繁瑣，出現(xiàn)差錯的幾率增加，且環(huán)境中存在的交叉污染造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。同時很多技術(shù)主要針對實(shí)驗室檢測，臨床應(yīng)用較少，缺少相應(yīng)的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化。④需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。為保證檢測結(jié)果可被觀察，現(xiàn)有技術(shù)每個步驟均得依賴于儀器設(shè)備，某些儀器設(shè)備如電鏡等，過于龐大和貴重，一般檢測機(jī)構(gòu)難于承受，難于在基層推廣。⑤檢測成本高。繁瑣又長時間的檢測及設(shè)備的維護(hù)，一方面需要投入人力、物力較多，另一方面結(jié)果的不確定亦造成檢測的重復(fù)，成倍的增加成本。目前的檢測多是在規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似PRRS的疫情后，送檢患病豬的病料(包括流產(chǎn)或死產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、腎和母豬胎盤)，利用常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場其他情況給出診斷報告并制定疫病防控計劃。一方面由于這種“事后”檢測導(dǎo)致診斷結(jié)果對豬場疫病防控的指導(dǎo)意義有一定的局限性，無法做到未雨綢繆。另一方面，常規(guī)RT-PCR方法操作時間較長，操作過程中容易發(fā)生污染。實(shí)時熒光定量RT-PCR方法建立在常規(guī)RT-PCR方法之上，是同化學(xué)染料或熒光標(biāo)記核酸探針的有機(jī)結(jié)合，敏感度更高、特異性更強(qiáng)、重復(fù)性更好，并且通過可視化設(shè)備監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)，無需電泳，省時省力、快速準(zhǔn)確。對于初期感染PRRSV且感染豬群體內(nèi)的病毒含量較低時，此種方法能做出準(zhǔn)確判斷，對于防治和治療PRRSV的爆發(fā)可以發(fā)揮重要的作用。豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個體。PRRSV可經(jīng)胎盤使胚胎或胎兒受到侵襲，引起流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化，引起繁殖障礙相關(guān)癥狀，且鑒于豬的多病毒混合感染非常嚴(yán)重，因此采用從仔豬臍帶血中檢測PRRSV來評價及預(yù)警豬藍(lán)耳病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提出一種檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時反映母、仔豬PRRSV帶毒狀況，評估母豬疫苗的免疫效果，有益于對豬群PRRSV感染和免疫情況的早期預(yù)警評判，進(jìn)一步有助于豬場做好該疾病的防控工作。基于上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒，包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f：5’-GTGGGTCGGCYCCARTTC-3’，其為SEQIDNO:1序列，其中R為堿基A或G，Y為堿基T或C；下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r：5’-AAAGCCTCATATTCMGTYTG-3’，其為SEQIDNO:2序列，其中M為堿基A或C，Y為堿基T或C；特異性熒光探針vPRRSV-p：VIC-5’-CTGTRACAACAACGCTGACG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，其中R為堿基A或G，VIC為熒光報告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)。合理的引物和熒光探針設(shè)計是成功應(yīng)用實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測結(jié)果的判定。高致病性PRRSV變異株以基因組非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2編碼區(qū)不連續(xù)30個氨基酸缺失為特征，高致病性PRRSV變異株的非結(jié)構(gòu)蛋白nsp2編碼區(qū)、編碼結(jié)構(gòu)蛋白GP5和GP3的ORF5、ORF3是基因組的易變區(qū)域，特別是nsp2編碼區(qū)、ORF5基因的變異反映出高致病性PRRSV毒株的多樣性。高致病性PRRSV變異株的易變異性、遺傳多樣性和致病性差異給該病的防控增加了難度。廣泛的變異性和毒株的多樣性是高致病性PRRSV變異株顯著的特征之一，成為控制豬繁殖與呼吸綜合征所面臨的難題。本發(fā)明對GenBank中公布的TJ、JXA1、Hun等高致病性PRRSV變異株流行毒株基因序列進(jìn)行對比分析，在高致病性PRRSV變異株基因組高變基因nsp2的非連續(xù)缺失區(qū)前后篩選出一段高度保守的基因片段，該基因片段大小為109bp，作為本發(fā)明設(shè)計引物的靶片段。發(fā)明人針對該保守片段設(shè)計了多對引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。該引物為只針對高致病性PRRSV變異株的通用上下游擴(kuò)增引物，且匹配性和特異性良好。同時在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)109bp片段間設(shè)計了高致病性PRRSV變異株高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與高致病性PRRSV變異株核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增高致病性PRRSV變異株核酸，同PRRSV經(jīng)典株及其它常見感染豬的病毒無交叉。高致病性PRRSV變異株具有易變異性、遺傳多樣性和致病性差異，所以設(shè)計檢測范圍更廣泛、特異性更強(qiáng)的引物和探針難度很大。發(fā)明人考慮到擴(kuò)增的高致病性PRRSV變異株的范圍更寬，設(shè)計兼并堿基，即本發(fā)明的引物和探針含有兼并堿基，因此該引物和探針的廣泛性和特異性強(qiáng)，靈敏性好。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f、所述下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r和所述特異性熒光探針vPRRSV-p的摩爾比為2:2:1。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f、所述下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r和所述特異性熒光探針vPRRSV-p在所述試劑盒中的終濃度均為0.1～0.4μM。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)及說明書。在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光RT-PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)液中還含有dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶和一些增強(qiáng)成分(MgCl2、DMSO或甲酰胺)的混合物，具體的增強(qiáng)成分根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行添加。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH2O，所述陽性對照為含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株nsp2基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2，克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2的終濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株nsp2基因109bp目的片段的核苷酸序列如下所示：GTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTAACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTT，其為SEQIDNO:4序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2采用以下方法制備得到：提取高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株RNA，利用引物vPRRSV-f和vPRRSV-r一步法擴(kuò)增得到高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株nsp2基因序列，通過TA克隆將該高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株nsp2基因序列連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-Vnsp2。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了一種所述的檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：(1)使用所述的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時，反應(yīng)體系以20μL計為：熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：16μL；10μMSEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針vPRRSV-p：0.2～0.4μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL；(2)實(shí)時熒光RT-PCR的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)；(3)結(jié)果分析：質(zhì)量控制：陰性對照VIC通道檢測無Ct值；陽性對照VIC通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；結(jié)果判定：VIC通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株感染陽性；VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株感染陰性。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：(1)取50-200mL豬臍帶血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫201-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP401-2％；(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1mL質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值，對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，尤其是探針的濃度。引物濃度過低會影響擴(kuò)增效率，引物濃度過高會引起錯配和非特異性擴(kuò)增，且增加引物之間形成二聚體的機(jī)會，同樣特異性熒光探針濃度過低會引起特異性的熒光信號變?nèi)酰鴿舛冗^高則會引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號從而干擾特異性熒光信號，待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度會影響PCR擴(kuò)增的效率，應(yīng)根據(jù)目的基因的大小選擇合適的RNA模板濃度。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗，最終確定本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的實(shí)時熒光RT-PCR方法檢測高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的擴(kuò)增效率接近100％，并可獲得最小的Ct值。進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的試劑盒在制備檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株試劑中的用途。本發(fā)明針對高致病性PRRSV變異株nsp2基因設(shè)計通用引物和特異性探針，通過對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度以及特異性探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測仔豬臍帶血中高致病性PRRSV變異株的實(shí)時熒光RT-PCR方法。靈敏度試驗結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μL，可以從高致病性PRRSV變異株感染臍帶血中檢測到最低10copies的病毒含量的樣品，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的300倍。特異性試驗結(jié)果表明，該方法對PCV、PRV、PPV、CSFV、PRRSV經(jīng)典株、PEDV與TGEV的細(xì)胞培養(yǎng)物及正常細(xì)胞均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。準(zhǔn)確性試驗結(jié)果表明，對于陽性對照與陰性對照的檢測，該方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果100％符合；對于臨床樣品的檢測，該方法檢測高致病性PRRSV變異株陽性19/125，常規(guī)RT-PCR方法檢測高致病性PRRSV變異株陽性12/125，且后者檢測的12份樣品使用實(shí)時熒光RT-PCR方法檢測均為陽性，說明該方法不僅準(zhǔn)確性高，而且更敏感。重復(fù)性試驗結(jié)果表明，該方法對107copies/μL、106copies/μL和105copies/μL濃度的陽性對照pEASY-Vnsp2克隆質(zhì)粒檢測變異系數(shù)(CV)均小于3％，具有較好的重復(fù)性。鑒于以上原因，本發(fā)明是利用實(shí)時熒光RT-PCR方法代替常規(guī)RT-PCR方法，并制備成試劑盒，主要通過檢測豬臍帶血中是否含有目前較為流行和危害更嚴(yán)重的高致病性PRRSV變異株核酸，評估及預(yù)警豬群PRRSV變異株的感染狀況，及時制定防控計劃。同時，本發(fā)明的方法亦可用于對發(fā)病豬病料組織的檢測，檢測更準(zhǔn)確、快速。綜上所述，本發(fā)明建立的檢測仔豬臍帶血高致病性PRRSV變異株的實(shí)時熒光RT-PCR方法和基于該方法建立的試劑盒具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)和重復(fù)性優(yōu)的特點(diǎn)，可以用于高致病性PRRSV變異株感染的病原學(xué)研究、早期診斷，對高致病性PRRSV變異株的快速診斷、綜合防控、病原凈化和早期治療具有重要意義。本發(fā)明試劑盒檢測快速、準(zhǔn)確、敏感，更適用于臍帶血中微量的高致病性PRRSV變異株檢測。本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時熒光RT-PCR檢測仔豬臍帶血中高致病性PRRSV變異株的工作原理：豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個體。高致病性PRRSV變異株可經(jīng)胎盤使胚胎或胎兒受到侵襲，引起流產(chǎn)、胚胎死亡、胎兒畸形、胎兒木乃伊化，引起繁殖障礙相關(guān)癥狀，且鑒于豬的多病毒混合感染非常嚴(yán)重，因此采用從仔豬臍帶血中檢測高致病性PRRSV變異株來評價及預(yù)警豬藍(lán)耳病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效?；谀殠а臋z測步驟為：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提?。?4)實(shí)時熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物和探針進(jìn)行；(5)判定結(jié)果。本發(fā)明還提供了一種臍帶血的采集方法，具體步驟如下：(1)取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；(2)當(dāng)仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可；若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊、死胎時，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；(3)臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；(4)將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。本發(fā)明臍帶血的采集方法克服現(xiàn)有常規(guī)采血技術(shù)的耗時長、采血困難、對豬只應(yīng)激大等問題，臍帶血采集簡單、方便、快捷和無應(yīng)激。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術(shù)耗時長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測快速高效，不會造成樣品交叉污染。(2)本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)較大通量樣品的檢測。(3)本發(fā)明的檢測方法不僅適用于檢測臍帶血檢測，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實(shí)驗室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。(4)在日常高致病性PRRSV變異株臍帶血雖然含毒量相對于組織而言要低，在實(shí)際應(yīng)用中也對組織及對應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保本發(fā)明檢測方法的特異性及敏感性。(5)本發(fā)明運(yùn)用一步法實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)，通過一個PCR反應(yīng)，就可以從臍帶血、血液與組織樣品中檢測出是否有高致病性PRRSV變異株存在，操作簡單操作時間短，做一次病原檢測僅需要2-3小時，快捷迅速、節(jié)約成本；而且需要儀器設(shè)備相對簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；結(jié)果相對可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對較少，不易污染；技術(shù)操作要求低，可以在基層大量推廣。附圖說明圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖2為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；圖3為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖。圖4為本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果圖；具體實(shí)施方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。實(shí)施例1檢測仔豬臍帶血高致病性PRRSV變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒的組成(1)熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；(2)上下游引物組vPRRSV-f和vPRRSV-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f：5’-GTGGGTCGGCYCCARTTC-3’，其為SEQIDNO:1序列，R為堿基A或G，Y為堿基T或C；下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r：5’-AAAGCCTCATATTCMGTYTG-3’，其為SEQIDNO:2序列，M為堿基A或C，Y為堿基T或C；(3)特異性熒光探針vPRRSV-p：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。特異性熒光探針vPRRSV-p：VIC-5’-CTGTRACAACAACGCTGACG-3’-BHQ1，其為SEQIDNO:3序列，R為堿基A或G，其中VIC為熒光報告基團(tuán)，BHQ1為非熒光淬滅基團(tuán)；本發(fā)明對GenBank中公布的TJ、JXA1、Hun等PRRSV高致病性變異株流行毒株基因序列進(jìn)行對比分析，在高致病性PRRSV變異株基因組高變基因nsp2的非連續(xù)缺失區(qū)前后設(shè)計了上下游擴(kuò)增引物，且匹配性和特異性良好。同時在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)109bp片段間設(shè)計了高致病性PRRSV變異株高保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與高致病性PRRSV變異株核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增高致病性PRRSV變異株核酸，同PRRSV經(jīng)典株及其它常見感染豬的病毒無交叉。(4)陽性對照為克隆有高致病性PRRSV變異株nsp2基因片段的重組質(zhì)粒pEASY-Vnsp2，由本實(shí)驗室構(gòu)建，質(zhì)粒在紫外分光光度計OD260nm測定質(zhì)量濃度，按公式6.02×1023×(Xng/μL×10-9)/DNAlength×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為1.0×105copies/μL～1.0×107copies/μL；其中，克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2的構(gòu)建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取PRRSV變異株核酸；以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2作為特異性引物一步法擴(kuò)增nsp2基因109bp目的片段，反應(yīng)條件為：42℃逆轉(zhuǎn)錄60min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrepDNAGelExcractionKit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將PRRSV變異株nsp2基因中109bp目的片段克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1PhageResistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的PlasmidMiniKit1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-Vnsp2。在本發(fā)明中，所述高致病性PRRSV變異株nsp2基因109bp目的片段的核苷酸序列如下所示：GTGGGTCGGCACCAGTTCCTGCACCGCGTAGAACTGTAACAACAACGCTGACGCACCAGGATGAGCCTCTGGATTTGTCTGCGTCCTCACAGACGGAATATGAGGCTTT(SEQIDNO:4)。(5)陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH2O；(6)使用說明書。實(shí)施例2檢測仔豬臍帶血高致病性PRRSV變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒的使用方法本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提取；(4)實(shí)時熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測；(5)判定結(jié)果。1.樣品采集(1)臍帶血樣品采集a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；b.當(dāng)仔豬出生時，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；注意事項：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時間、母豬耳號、胎次等信息；d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號、需要檢測項目的清單。(2)病料樣品(扁桃體、腎臟、肺臟和淋巴結(jié)等)A、剖解取內(nèi)臟：將患病豬剖解，取出完整的上述內(nèi)臟，放置在同一個干凈塑料袋內(nèi)。B、記錄：將裝有內(nèi)臟的塑料袋密封，貼標(biāo)簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。C、將采集的病料樣品集中送至實(shí)驗室，并附上所記錄的信息。2.樣品RNA提取(1)取50-200mL豬臍帶血置1.5mLEP管中，加入1ml裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；所述病毒裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(6)加入1mL質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；(7)晾干，加入適量的DEPCH2O溶解，56℃促溶10～15min；(8)快速電泳檢測RNA完整性。為監(jiān)測提取過程中的污染，建議在提取樣本的同時提取一管水作為陰性對照。本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。依據(jù)上述方法提取6份隨機(jī)臍帶血樣品總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，濃度均能達(dá)到0.207μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。表1RNA質(zhì)量檢測結(jié)果樣品編號體積(μl)濃度(μg/μl)總量(μg)A260/A280質(zhì)量評價001300.37011.11.93合格002300.2076.211.91合格003300.2326.961.92合格004300.2517.531.95合格005300.2768.281.99合格006300.2958.851.93合格3.熒光RT-PCR反應(yīng)對實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化原則為：通過優(yōu)化使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值。經(jīng)過優(yōu)化，實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示：(1)實(shí)時熒光RT-PCR反應(yīng)體系以20μL計為：10μMSEQIDNO:1所示的上游擴(kuò)增引物vPRRSV-f：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:2所示的下游擴(kuò)增引物vPRRSV-r：0.4～0.8μL；10μMSEQIDNO:3所示的特異性熒光探針vPRRSV-p：0.2～0.4μL；熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：16μL；RNA模板：2μL；ddH2O：補(bǔ)足至20μL。同時設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2：2μL，其余組分相同；陰性對照無RNA酶與DNA酶的ddH2O：2μL，其余組分相同。(2)熒光RT-PCR反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。(3)結(jié)果分析：質(zhì)量控制：陰性對照VIC通道檢測無Ct值；陽性對照VIC通道檢測Ct值≤30；上述條件同時滿足，檢測結(jié)果有效；結(jié)果判定：VIC通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為高致病性PRRSV變異株感染陽性；VIC通道檢測無Ct值，則判定樣品為高致病性PRRSV變異株感染陰性。實(shí)施例3檢測仔豬臍帶血高致病性PRRSV變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒的驗證1.試劑盒擴(kuò)增效率驗證將陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：108-101copies/μL，每個梯度重復(fù)三次進(jìn)行高致病性PRRSV變異株實(shí)時熒光RT-PCR檢測，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(VIC通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.35，截距：41.06，相關(guān)系數(shù)：1.00，擴(kuò)增效率：0.99。綜上，說明該試劑盒檢測高致病性PRRSV變異株核酸的擴(kuò)增效率均達(dá)到近100％。2.靈敏度試驗以10倍梯度稀釋的陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-Vnsp2作為模板，進(jìn)行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測，檢測范圍為108-101copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為108-101copies/μL，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到最低10個拷貝數(shù)的高致病性PRRSV變異株核酸含量的樣品，檢測結(jié)果見圖2。3.特異性試驗為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測檢測豬圓環(huán)病毒(PCV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、PRRSV經(jīng)典株、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)與豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)的提取核酸。檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對高致病性PRRSV變異株進(jìn)行擴(kuò)增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴(kuò)增高致病性PRRSV變異株，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果見圖3。4.重復(fù)性檢測選用陽性對照pEASY-Vnsp2克隆質(zhì)粒107、106、105copies/μL，對每個濃度的樣本做3個重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測變異系數(shù)(CV)均小于3％，具有較好的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表2和圖4。表1實(shí)時熒光RT-PCR檢測高致病性PRRSV變異株的重復(fù)性試驗5.準(zhǔn)確性臨床驗證使用本發(fā)明的試劑盒同普通RT-PCR方法對累計125份臍帶血樣品以及5份健康的臍帶血樣品進(jìn)行了高致病性PRRSV變異株檢測，結(jié)果表明，對于臨床樣品的檢測，該試劑盒方法檢測高致病性PRRSV變異株19/125，常規(guī)RT-PCR方法檢測高致病性PRRSV變異株陽性12/125，且后者檢測的12份樣品使用該試劑盒方法檢測均為陽性，說明該試劑盒方法更敏感，檢出率及準(zhǔn)確性更高；對于高致病性PRRSV變異株陰性臨床樣品的檢測，該試劑盒方法檢測結(jié)果同常規(guī)RT-PCR方法一致。表3采用本發(fā)明試劑盒以及普通RT-PCR對臨床樣品進(jìn)行檢測結(jié)果的比較綜上可見，本發(fā)明設(shè)計的一對特異性引物和一條特異性熒光探針以及構(gòu)成的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒可以快速檢測仔豬臍帶血中的高致病性PRRSV變異株，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測結(jié)果真實(shí)可靠。所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。序列表<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司<120>一種檢測仔豬臍帶血高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異株的實(shí)時熒光RT-PCR試劑盒及其用途<130>FI160699-ND<160>4<170>PatentInversion3.5<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>1gtgggtcggcyccarttc18<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>2aaagcctcatattcmgtytg20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ctgtracaacaacgctgacg20<210>4<211>109<212>RNA<213>高致病性PRRSV變異株nsp2基因序列<400>4gtgggtcggcaccagttcctgcaccgcgtagaactgtaacaacaacgctgacgcaccagg60atgagcctctggatttgtctgcgtcctcacagacggaatatgaggcttt109當(dāng)前第1頁1 2 3