本發(fā)明涉及熒光PCR檢測試劑盒領(lǐng)域，特別是涉及一種基于熒光PCR法聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒。
背景技術(shù)：
：登革熱病毒是小型黃病毒，屬于黃熱病毒屬，能引起一系列臨床癥狀，包括有生命危險的失血性休克綜合征和較少見的伴有肝衰與腦病的急性肝炎。以埃及伊蚊和白紋伊蚊為傳播媒介，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶的60多個國家和地區(qū)，每年大約超過一億人受到感染，死亡率高達50％，25億以上的人受到威脅，該病毒的傳播已成為熱帶、亞熱帶地區(qū)嚴重的公共衛(wèi)生問題。在大多數(shù)國家登革熱的死亡率大約為5％，大多發(fā)生在兒童和青壯年中?；卓蟻啿《緦儆谂げ《究频募撞《緦伲诩膊×餍械貐^(qū)，這種病毒可存在于綠猴、狒狒、黑猩猩、牛、馬、豬、兔等多種動物體內(nèi)，受感染的動物宿主和病人都是傳染源。該病毒由受感染蚊子叮咬傳播，能引起一種少見的病毒性傳染病——基孔肯亞熱?；卓蟻啛嵋话愠掷m(xù)五到七天，常會引起嚴重的關(guān)節(jié)痛使人失去能力，這種狀況最終可以恢復(fù)，但劇烈疼痛和恢復(fù)緩慢的特點可明顯影響人的正常生活和工作。2006年在印度和南亞的一次流行中，不止125萬人感染基孔肯亞熱病毒。2007年9月，意大利北部通報了由一例輸入病例引起的一次基孔肯亞熱暴發(fā)。基孔肯亞熱近年來急劇復(fù)蘇并擴大了地域范圍，突出表明了我們對昆蟲傳播的新傳染病的脆弱性，并強調(diào)了作為衛(wèi)生安全基本要素的持續(xù)控制規(guī)劃的重要性?；卓蟻啛崤c登革熱的傳播媒介相同，流行區(qū)域基本相同，臨床表現(xiàn)亦類似，與登革熱較難鑒別，兩者鑒別有賴于實驗室特異性檢測。熒光RT-PCR技術(shù)是上世紀九十年代末才發(fā)展起來的新技術(shù)，它具有快速、特異性、靈敏度高、成本相對低等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于臨床檢測的各個方面。目前已開發(fā)出利用熒光定量PCR技術(shù)分別針對上述兩種病毒進行的快速檢測試劑盒，但是由于是單一檢測，兩種病毒檢測下來，既麻煩又浪費成本。因此在熒光RT-PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上，建立單管聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的方法具有非常重要的意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：鑒于以上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熒光PCR法聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒及其制備方法和用途，用于解決現(xiàn)有技術(shù)中的問題。為實現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒，所述試劑盒包括針對登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物以及基孔肯亞病毒探針，所述針對登革熱病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對登革熱病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示，針對登革熱病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.2所示，所述針對基孔肯亞病毒的特異性引物包括正向引物和反向引物，針對基孔肯亞病毒的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示，針對基孔肯亞病毒的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示。優(yōu)選的，所述登革熱病毒探針的探針序列如SEQIDNo.5所示。更優(yōu)選的，所述登革熱病毒探針兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。進一步優(yōu)選的，所述登革熱病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，具體可選用的熒光報告基團包括但不限于FAM、VIC/HEX、RED610、HEX等中的一種或多種的組合。在本發(fā)明一實施例中，所述熒光報告基團為FAM熒光基團，所述熒光淬滅基團為BHQ1。優(yōu)選的，所述基孔肯亞病毒探針的探針序列如SEQIDNo.6所示。更優(yōu)選的，所述基孔肯亞病毒探針兩端標記有熒光報告基團和熒光淬滅基團。進一步優(yōu)選的，所述基孔肯亞病毒探針5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團，具體可選用的熒光報告基團包括但不限于FAM、VIC/HEX，RED610、HEX等中的一種或多種的組合。在本發(fā)明一實施例中，所述熒光報告基團為HEX熒光基團，所述熒光淬滅基團為BHQ1。本發(fā)明所提供的試劑盒中，登革熱病毒探針上標記的熒光報告基團和基孔肯亞病毒探針上標記的熒光報告基團不相同且熒光波長不相同，優(yōu)選情況下，兩種熒光報告基團的熒光波長相差較大、信號強度相近，保證了檢測結(jié)果的準確性，避免了信號之間的相互干擾。優(yōu)選的，所述試劑盒還包括RNA抽提試劑、RT-PCR試劑、內(nèi)部對照體系和陽性對照中的一種或多種的組合。本發(fā)明所提供的試劑盒用于登革熱病毒及基孔肯亞病毒的熒光PCR聯(lián)合檢測，所以試劑盒中還可以包括其他熒光PCR檢測中的相關(guān)試劑，具體包括但不限于：RNA抽提試劑、RT-PCR試劑、內(nèi)部對照體系、陰性對照品和陽性對照品等。所述RNA抽提試劑可使用本領(lǐng)域各種病毒RNA抽提試劑，這些試劑均可通過市售途徑獲得。所述RT-PCR試劑可采用本領(lǐng)域各種RT-PCR試劑，具體可包括RT-PCR預(yù)混液、RT-PCR 酶(包括反轉(zhuǎn)錄酶和Taq酶)、工藝用水等，所述工藝用水包括但不限于ddH2O，這些試劑均可通過市售途徑獲得。所述內(nèi)部對照體系是指包含與登革熱和基孔肯亞無關(guān)序列的質(zhì)粒以及其對應(yīng)的探針的對照體系。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)具體序列設(shè)計和選用合適的內(nèi)部對照體系。在本發(fā)明一實施例中，所述內(nèi)部對照體系由內(nèi)部對照品探針和內(nèi)部對照品組成，所述內(nèi)部對照品為與登革熱和基孔肯亞無關(guān)序列的質(zhì)粒，內(nèi)部對照品探針即為針對該質(zhì)粒其中一段設(shè)計獲得的探針。本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際需要確定陰性對照品和陽性對照品，在本發(fā)明一實施例中，所述陰性對照品為DEPC-H2O，所述陽性對照品為含有登革熱病毒擴增序列和基孔肯亞病毒擴增序列的質(zhì)粒。本發(fā)明所提供的聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒采用Taqman熒光定量PCR原理，分別針對登革熱病毒及基孔肯亞病毒設(shè)計特異性引物，擴增特異性核酸序列，同時分別設(shè)計Taqman探針，并標記不同的熒光報告基團，位于上下游引物之間。探針其5’端標記熒光報告基團，3’端標記非熒光淬滅基團。當探針完整的時候，報告基團所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團吸收，儀器檢測不到信號。隨著PCR的進行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5′→3′外切核酸酶活性就會將探針切斷，報告基團遠離淬滅基團，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號。因此，本發(fā)明采用的熒光定量PCR技術(shù)具有實時檢測、定量和高通量檢測等特點，且操作簡便、靈敏度高、特異性好等優(yōu)點。本發(fā)明第二方面提供一種登革熱病毒和基孔肯亞病毒的聯(lián)合檢測方法，使用所述試劑盒，具體包括如下步驟：1)標本的核酸提取：使用病毒RNA抽提試劑盒提取標本RNA；2)核酸熒光PCR檢測混合液的配制：將針對登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物、基孔肯亞病毒探針、內(nèi)部對照品探針、RT-PCR預(yù)混液、工藝用水組成核酸熒光PCR檢測混合液體系；3)試劑配制：將核酸熒光PCR檢測混合液體系、內(nèi)部對照品、RT-PCR酶振蕩混勻、離心；4)加樣：將步驟3所得混合液置于PCR管中，然后將步驟1所得標本、陽性對照品、DEPC-H2O分別加入PCR管中，離心后立即進行PCR擴增反應(yīng)；5)通過定量熒光PCR儀器對樣品進行PCR反應(yīng)，并通過熒光信號的強度判斷登革熱病毒和基孔肯亞病毒的陽性和陰性。所述步驟2中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際反應(yīng)情況或現(xiàn)有試劑盒的使用說明，確定核 酸熒光PCR檢測混合液體系的配比。所述步驟3中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實際反應(yīng)情況或現(xiàn)有試劑盒的使用說明，確定核酸熒光PCR檢測混合液體系、內(nèi)部對照品、RT-PCR酶的使用比例。所述步驟4中，具體指步驟1所得標本、陽性對照品、DEPC-H2O(陰性對照)的平行實驗，分別將試樣加入到對應(yīng)的PCR管中，離心后進行PCR擴增反應(yīng)。所述步驟3和步驟4中，離心的時間為數(shù)秒，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)實驗需求確定實際所需要的離心時間。本發(fā)明發(fā)明人通過長期研究和大量的篩選實驗，通過特定引物的設(shè)計，從而提供了一種能夠聯(lián)合檢測登革熱病毒及基孔肯亞病毒的試劑盒。所述試劑盒具體涉及兩對特異性PCR引物和探針，分別特異性擴增登革熱病毒和基孔肯亞病毒，兩對特異性PCR引物能在同一PCR反應(yīng)體系中同時進行擴增，實現(xiàn)了多重PCR檢測，不僅操作簡便，還大大縮短了檢測時間。此外，所述兩對特異性引物和探針均具有高度的保守性和特異性，兩對引物和探針之間無互補配對或交叉擴增的情況，且對于兩種病毒的檢測靈敏度均可達到1×103copies/ml以上，保證了檢測結(jié)果靈敏度和準確性的同時，避免了信號之間的相互干擾。附圖說明圖1顯示為本發(fā)明登革熱病毒靈敏度檢測曲線圖示意圖。圖2顯示為本發(fā)明基孔肯亞病毒靈敏度檢測曲線圖示意圖。具體實施方式以下通過特定的具體實例說明本發(fā)明的實施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點與功效。本發(fā)明還可以通過另外不同的具體實施方式加以實施或應(yīng)用，本說明書中的各項細節(jié)也可以基于不同觀點與應(yīng)用，在沒有背離本發(fā)明的精神下進行各種修飾或改變。在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應(yīng)理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應(yīng)當理解，本發(fā)明實施例中使用的術(shù)語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍；在本發(fā)明說明書和權(quán)利要求書中，除非文中另外明確指出，單數(shù)形式“一個”、“一”和“這個”包括復(fù)數(shù)形式。當實施例給出數(shù)值范圍時，應(yīng)理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設(shè)備、材料外， 根據(jù)本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員對現(xiàn)有技術(shù)的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設(shè)備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術(shù)的任何方法、設(shè)備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)的分子生物學(xué)、生物化學(xué)、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和分析、分析化學(xué)、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術(shù)及相關(guān)領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。這些技術(shù)在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULARCLONING：ALABORATORYMANUAL，Secondedition，ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989andThirdedition，2001；Ausubel等，CURRENTPROTOCOLSINMOLECULARBIOLOGY，JohnWiley&Sons，NewYork，1987andperiodicupdates；theseriesMETHODSINENZYMOLOGY，AcademicPress，SanDiego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTUREANDFUNCTION，Thirdedition，AcademicPress，SanDiego，1998；METHODSINENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.WassarmanandA.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，SanDiego，1999；和METHODSINMOLECULARBIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)HumanaPress，Totowa，1999等。實施例1登革熱病毒及基孔肯亞病毒核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測引物探針的設(shè)計和合成：按SEQIDNo.1-6合成登革熱病毒的特異性引物、登革熱病毒探針、針對基孔肯亞病毒的特異性引物以及基孔肯亞病毒探針，并在登革熱病毒探針的5’標記FAM熒光基團，基孔肯亞病毒探針的5’標記HEX熒光基團，兩者的3’端均標記BHQ1，合成登革熱、基孔肯亞的引物探針，引物和探針序列具體如下：登革熱病毒：上游引物：AGGACTAGAGGTTAGWGG(SEQIDNo.1)下游引物：CAGCACCATTCCATTTTC(SEQIDNo.2)探針：5’熒光報告基團-tccCagCgtCaaTatg-BHQ13’(SEQIDNo.5)基孔肯亞病毒：上游引物:ACTCAACCATCCTGGAYA(SEQIDNo.3)下游引物:GAGTCTCTCGGGATCTTC(SEQIDNo.4)探針:5’熒光報告基團-ccgAcaTcaTccTcctt-BHQ13’(SEQIDNo.6)內(nèi)部對照品探針：5’熒光報告基團-cccGacCgaTttCaaca-BHQ13’(SEQIDNo.7)內(nèi)部對照品探針的熒光報告基團為RED610。實施例2登革熱病毒及基孔肯亞病毒核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測混合液的配制：將登革熱病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探針0.1μl/test；基孔肯亞病毒上游引物0.5μl/test；下游引物0.5μl/test；探針0.1μl/test；內(nèi)部對照品探針0.1μl/test；引物濃度均為20μM，探針濃度均為10μM；RT-PCRMIX12.5μl/test(OneStepRT-PCRKit,QIAGEN)；工藝用水(ddH2O)3.2μl/test混勻即為D&C核酸熒光PCR檢測混合液。實施例3登革熱病毒及基孔肯亞病毒核酸聯(lián)合檢測試劑盒(熒光PCR法)的靈敏度分析：3.1樣品的準備：取1×107copies/ml的登革熱病毒質(zhì)粒(DFV-S1)(將目標擴增序列通過TA克隆至pMD8-T載體上，獲得的DFV-S1質(zhì)粒。目標擴增序列：AAACAGCATATTGACGCTGGGAGAGACCAGAGATCCTGCTGTCTCTACAGCATCATTCCAGGCACAGAACGCCA)(SEQIDNo.8)，按1：10、1：100、1：1000、1：10000稀釋，獲得DFV-S2(1×106copies/ml)、DFV-S3(1×105copies/ml)、DFV-S4(1×104copies/ml)、DFV-S5(1×103copies/ml)共5份作為檢測樣品。取1×107copies/ml的基孔肯亞病毒質(zhì)粒(CHIKV-S1)(將目標擴增序列通過TA克隆至pMD8-T載體上，獲得的CHIKV-S1質(zhì)粒。目標擴增序列：GAATGACCATGCTAATGCTAGAGCGTTCTCGCATCTAGCTATAAAACTAATAGAGCAGGAAATTGACCCCGACTCAACCATCCTGGATATCGGCAGTGCGCCAGCAAGGAGGATGATGTCGG)(SEQIDNo.9)，按1：10、1：100、1：1000、1：10000稀釋，獲得CHIKV-S2(1×106copies/ml)、CHIKV-S3(1×105copies/ml)、CHIKV-S4(1×104copies/ml)、CHIKV-S5(1×103copies/ml)共5份作為檢測樣品。3.2試劑配制：每個反應(yīng)管中，加入18μlD&C核酸熒光PCR檢測混合液與1μl內(nèi)部對照品(將目標擴增序列通過TA克隆至pMD8-T載體上，獲得的內(nèi)部對照品質(zhì)粒。目標擴增序列：GAATGACCATGCTAATGCTAGAGCGTTCTCGCATCTAGCTATAAACCCGACCGATTTCAACACCCCGACTCAACCATCCTGGATATCGGCAGTGCGCCAGCAAGGAGGATGATGTCGG) (SEQIDNo.10)，以及1μlRT-PCR酶(OneStepRT-PCRKit,QIAGEN)，振蕩混勻數(shù)秒,3000rpm離心數(shù)秒。3.3加樣：將DFV-S1、DFV-S2、DFV-S3、DFV-S4、DFV-S5、CHIKV-S1、CHIKV-S2、CHIKV-S3、CHIKV-S4、CHIKV-S5、陽性對照品(見3.1)、DEPC-H2O(陰性對照品)各5μl分別加入薄壁PCR反應(yīng)管或PCR反應(yīng)板中，每個反應(yīng)管中含有18μlD&C核酸熒光PCR檢測混合液、1μl內(nèi)部對照品、以及1μlRT-PCR酶，蓋好薄壁PCR反應(yīng)管蓋或PCR反應(yīng)板膜，離心數(shù)秒后立即進行PCR擴增反應(yīng)。3.4PCR擴增：反應(yīng)管置于定量熒光PCR儀上，推薦循環(huán)參數(shù)設(shè)置：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循環(huán)40次；單點熒光檢測在60℃。反應(yīng)體系為25μl。熒光通道檢測選擇：選用FAM、HEX(或VIC/JOE)和CalRed610/ROX/TEXASRED通道?；€和閾值設(shè)定：基線調(diào)整取6-15個循環(huán)的熒光信號，閾值設(shè)定原則以閾值線剛好超過DEPC-H2O檢測熒光曲線的最高點。質(zhì)量控制：試劑盒各對照品須達到以下要求(表1)，否則實驗視為無效。表1檢測結(jié)果判斷標準如表2所示：表23.5各檢測樣品的檢測結(jié)果如圖1、圖2和表3所示：表3DFV-S1DFV-S2DFV-S3DFV-S4DFV-S5+++++CHIKV-S1CHIKV-S2CHIKV-S3CHIKV-S4CHIKV-S5+++++由圖1和表3可知，對于登革熱病毒質(zhì)粒，DFV-S1(1×107copies/ml)——DFV-S5(1×103copies/ml)均檢測為陽性，表明試劑盒檢測登革熱病毒的檢測靈敏度能達到1×103copies/ml。由圖2和表3可知，對于基孔肯亞病毒質(zhì)粒，CHIKV-S1(1×107copies/ml)——CHIKV-S5(1×103copies/ml)均檢測為陽性，表明試劑盒檢測基孔肯亞病毒的檢測靈敏度能達到1×103copies/ml。綜上所述，本發(fā)明有效克服了現(xiàn)有技術(shù)中的種種缺點而具高度產(chǎn)業(yè)利用價值。上述實施例僅例示性說明本發(fā)明的原理及其功效，而非用于限制本發(fā)明。任何熟悉此技術(shù)的人士皆可在不違背本發(fā)明的精神及范疇下，對上述實施例進行修飾或改變。因此，舉凡所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
中具有通常知識者在未脫離本發(fā)明所揭示的精神與技術(shù)思想下所完成的一切等效修飾或改變，仍應(yīng)由本發(fā)明的權(quán)利要求所涵蓋。當前第1頁1 2 3