一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法。本發(fā)明的檢測(cè)方法整合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR和微陣列這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，把PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應(yīng)室在同一張芯片上；檢測(cè)方法包括：標(biāo)本RNA提取，PCR擴(kuò)增，雜交，清洗，結(jié)果判讀。本發(fā)明能對(duì)登革熱病毒(血清Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)和分型，通過本發(fā)明可大幅度提高進(jìn)出口口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止登革熱疫情的發(fā)生。
【專利說明】一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及體外診斷試劑【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè) 分型方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 登革熱病毒（DV)與黃熱病病毒（YEV)、日本腦炎病毒（JEV)和丙型肝炎病毒 (HCV)同為黃病毒科（Flav iv iridae)的成員，都可引起嚴(yán)重的人類疾病，引發(fā)重大的公 共衛(wèi)生問題。登革熱病毒感染主要發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)，可引起登革熱（DF)、登革出血 熱/登革熱休克綜合癥（DHF/DSS)等癥狀，每年大約有5000萬到1億人受到感染，25000 人死亡。20世紀(jì)80年代以來流行越來越嚴(yán)重，全球有100多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)流行，最嚴(yán)重是在 東南亞及西太平洋地區(qū)，全球每年有百多萬病例，近25億人口受到登革熱的威脅。
[0003] 隨著全球氣候變暖引起的地理分布區(qū)的改變、旅游、城鎮(zhèn)化、交通的加速發(fā)展及病 毒載體蚊蟲的迀移，登革熱病毒將會(huì)波及到更多地區(qū)。
[0004] 尤其是2014年6月份，廣州爆發(fā)的感染登革熱病例的疫情，隨后疫情在各地發(fā)展。 截至2014年10月21日零時(shí)，2014年廣東全省共有20個(gè)地級(jí)市累計(jì)報(bào)告登革熱病例38753 例，其中重癥病例20例，死亡病例6例。登革熱流行不僅造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失和社會(huì)損失， 而且引起不必要的恐慌，嚴(yán)重影響外來投資環(huán)境。
[0005] 由于登革熱病毒的復(fù)制、感染及致病機(jī)理尚未闡明，以及針對(duì)4種血清型的4價(jià) 疫苗開發(fā)的困境，迄今為止還沒有有效的疫苗可用于臨床。對(duì)確定有DHF/DSS癥狀的病 人，及時(shí)有效的醫(yī)療護(hù)理成為減輕癥狀，避免死亡的唯一有效措施。因此，臨床上快速準(zhǔn) 確地診斷登革熱病毒感染至關(guān)重要。
[0006] 到目前為止，登革熱病毒的檢測(cè)最原始、經(jīng)典的方法是特異性病毒分離培養(yǎng)，但由 于操作繁瑣、技術(shù)難度大且耗時(shí)長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件要求高、存在嚴(yán)重的生物安全問題，在實(shí)際工 作中難以推廣應(yīng)用。其實(shí)是通過核酸檢測(cè)和抗體陽性檢測(cè)。核酸檢測(cè)需要兩個(gè)小時(shí)才出結(jié) 果，而抗體陽性檢測(cè)一個(gè)小時(shí)則可以出結(jié)果，但是抗體陽性檢測(cè)發(fā)病后五天內(nèi)的檢出率為 50%，可能會(huì)漏診登革熱病例，也不利于疫情控制。準(zhǔn)確率比較高的檢測(cè)方法是核酸檢測(cè)， 但是常規(guī)的PCR操作復(fù)雜，設(shè)備龐大，技術(shù)難度比較高，不利于口岸現(xiàn)場(chǎng)診斷以及疫區(qū)現(xiàn)場(chǎng) 檢測(cè)。因此迫切需要研發(fā)一種新型的快速、簡(jiǎn)單的核酸檢測(cè)方法。本發(fā)明專利通過研宄一 種基因芯片來檢測(cè)和分型四種血清型的登革熱病毒。
[0007] 基因芯片技術(shù)利用待檢測(cè)樣品的基因組序列設(shè)計(jì)針對(duì)各種微生物的特異探針，將 該探針（寡核苷酸）點(diǎn)樣于芯片表面，同時(shí)在探針兩側(cè)設(shè)計(jì)PCR引物，在引物合成過程中對(duì) 其5'端進(jìn)行熒光標(biāo)記或在PCR過程中加入熒光標(biāo)記的dNTP，這樣利用PCR擴(kuò)增的方法即可 得到標(biāo)記有熒光染料的待檢測(cè)靶標(biāo)，然后用含有待檢測(cè)樣品特異探針的微陣列芯片與標(biāo)記 的靶標(biāo)雜交，熒光標(biāo)記的DNA分子與芯片上相匹配的DNA序列發(fā)生雜交反應(yīng)，使得芯片上的 點(diǎn)呈現(xiàn)出熒光信號(hào)，最后通過掃描儀定量和分析熒光分布模式來確定檢測(cè)樣品是否存在某 些特定登革熱病毒。
[0008] 當(dāng)前用于登革熱病毒檢測(cè)的基因芯片檢測(cè)已經(jīng)有些應(yīng)用于研宄，但是這些基因芯 片的探針點(diǎn)樣多采用手工模式，操作復(fù)雜，并且增加了很多假陽性的機(jī)會(huì)。
[0009] 本發(fā)明整合了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)和微陣列這兩種強(qiáng)大的分子生物學(xué)技術(shù)，把 PCR雜交的探針直接固定在微陣列中的雜交艙中，與PCR反應(yīng)室在同一張芯片上。同時(shí)本 發(fā)明把四種常見血清型的登革熱病毒的檢測(cè)在一張芯片上完成，實(shí)現(xiàn)了登革熱檢測(cè)的高通 量。PCR反應(yīng)結(jié)束后可以直接加入雜交液進(jìn)行雜交，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間。
[0010] 本發(fā)明的檢測(cè)方法可運(yùn)用于登革熱病毒快速靈敏的檢測(cè)，作為抗體試驗(yàn)可靠補(bǔ) 充，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和時(shí)效性，可大大地降低檢測(cè)的周期。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法， 本發(fā)明能對(duì)四種血清型的登革熱病毒基因進(jìn)行快速靈敏的檢測(cè)，通過本發(fā)明可大幅度提高 進(jìn)出口 口岸一線檢驗(yàn)檢疫人員的檢測(cè)效率，既可減少工作量、又可最大限度地解決傳統(tǒng)檢 測(cè)方法可能存在的陽性漏檢問題，從而最大限度地防止疫情的發(fā)生和國(guó)外登革熱病毒的傳 入，同時(shí)可用于醫(yī)療機(jī)構(gòu)的登革熱檢測(cè)，極大程度上減少了登革熱檢測(cè)的復(fù)雜度。
[0012] 本發(fā)明針對(duì)通用基因和四種血清型的登革熱特有基因，設(shè)計(jì)引物，在引物擴(kuò)增區(qū) 內(nèi)設(shè)計(jì)能夠互相區(qū)別其他登革熱及親緣關(guān)系較近的物種的特異性探針，通過探針特異性驗(yàn) 證、方法特異性實(shí)驗(yàn)等證明該方法可以特異檢測(cè)四種血清型登革熱病毒，與常規(guī)PCR方法 比較，檢測(cè)靈敏度明顯高于常規(guī)方法。不僅可以滿足日常疫情安全檢測(cè)的要求，甚至可以滿 足臨床樣品的檢測(cè)要求。
[0013] 本發(fā)明所提供的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，包括如下步驟：
[0014] (1)血液樣本RNA液提??；
[0015] (2) PCR 擴(kuò)增：
[0016] a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：PCR反應(yīng)緩沖液（含PCR酶及逆轉(zhuǎn)錄酶），待測(cè)樣本基因 特異性正、反向引物，PCR Grade H2O, PCR Control, DNA提取液，特異性正、反引物是根據(jù)登 革熱病毒通用基因和四種血清型特有基因設(shè)計(jì)的引物；
[0017] b.將PCR反應(yīng)液加入已含有待測(cè)基因特異性探針的芯片反應(yīng)室內(nèi)內(nèi)，將芯片放入 機(jī)器進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；特異性探針是根據(jù)特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他物種；特 異性探針點(diǎn)入芯片上。
[0018] (3)雜交：PCR擴(kuò)增完后，將雜交反應(yīng)液加入芯片，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜 交艙內(nèi)雜交反應(yīng)；
[0019] (4)清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)；
[0020] (5)結(jié)果判讀。
[0021] 步驟（1)中所述的RNA提取可使用血液樣本基因組RNA提取試劑盒提取RNA，取 IOOuL全血樣本，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
[0022] 步驟0中所述的待測(cè)基因?yàn)榈歉餆岵《咎赜谢?，分別是通用基因 polyprotein gene 登革 I 型 polyprotein gene，登革 II 型 polyprotein gene，登革III 型 envelope glycoprotein gene,登革IV型 polyprotein gene。
[0023] 根據(jù)登革熱病毒通用基因和四種血清型特有基因設(shè)計(jì)的特異性引物和探針均為 兩對(duì)：登革熱通用基因 polyprotein gene :
[0024] Dl-F ：AGAGAGCAGATCTCTGATG (SEQ ID NO I)
[0025] DI-R:GAGAATCTCTTCGCCAA (SEQ ID NO 2)
[0026] Probe:CTTTCAATATGCTGAAACG (SEQ ID NO 3)
[0027] 和
[0028] D2-F ：GCATATTGACGCTGGGAGA (SEQ ID NO 4)
[0029] D2-R:GGCGTTCTGTGCCTGGA (SEQ ID NO 5)
[0030] Probe:AGAGATCCTGCTGTCT (SEQ ID NO 6)
[0031] 登革 I 型 polyprotein gene :
[0032] DII-F:CATTAATAGCTGGAGGCATG (SEQ ID NO 7)
[0033] DII-R:GTGAGGCGCCAGAGTGTT (SEQ ID NO 8)
[0034] Probe:CATATCCGGAAGCTCGGCCG (SEQ ID NO 9)
[0035] 和
[0036] DI2-F:CACACCACACCCTTTGGAC (SEQ ID NO 10)
[0037] DI2-R:CCTGGCTGTCACCTCCAT (SEQ ID NO 11)
[0038] Probe:GAGGGTGTTTAAAGAGAAAGTTGACACGC (SEQ ID NO 12)
[0039] 登革 II 型 polyprotein gene:
[0040] DIII-F:GGCCATAGACCTTGGTGAA (SEQ ID NO 13)
[0041] DIII-R:TACCCATGTGGACGTAGAGT (SEQ ID NO 14)
[0042] Probe:CACGTACAAGTGTCCCCTCCTCAGG (SEQ ID NO 15)
[0043] 和
[0044] DII2-F:CATGGCCCTGGTGGC (SEQ ID NO 16)
[0045] DII2-R:CCCATCTTTTCAGTATCCC (SEQ ID NO 17)
[0046] Probe:TCCTTCGTTTCCTAACAAT (SEQ ID NO 18)
[0047] 登革III型 envelope glycoprotein gene:
[0048] Dili I-F:GCACGGTGGGTGTGTGAC (SEQ ID NO 19)
[0049] Dili I-R:CCTCGGTCTTCTGGAGCTCTAT (SEQ ID NO 20)
[0050] Probe ：TGGCTAAGAACAAGCCCACGC (SEQ ID NO 21)
[0051] 和
[0052] Dili 2-F:GGAAAACCGTCTATCAA (SEQ ID NO 22)
[0053] Dili 2-R:GCCATAACCAATTTCATTG (SEQ ID NO 23)
[0054] Probe ：CAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAGAG (SEQ ID NO 24)
[0055] 登革IV型 polyprotein gene:
[0056] DIV 1-F:CCAGCGAACTGTCTTCTTT (SEQ ID NO 25)
[0057] DIV 1-R:TCCTACGCATCGCATTC (SEQ ID NO 26)
[0058] Probe:AATGATGCTGGTCGCCCCATC (SEQ ID NO 27)
[0059] 和
[0060] D IV 2-F:GAAGAGATTCTCAACCGG (SEQ ID NO 28)
[0061] D IV 2-R:TCCCTGCTGTTGGTGG (SEQ ID NO 29)
[0062] Probe:ATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTC (SEQ ID NO 30)
[0063] 步驟（2)中所述的 PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12. 5ul, MgSO4 14 mM 2. 5ul， PrimerR2. 5ul, Superscript III RT/Platinum Taq Mix I. 0 μ I, Freshly Diluted L RT-PCR Control 2.0 μ I, Sample 5ul〇
[0064] 步驟⑵所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min，95°C預(yù)變性2min ; 95°〇變性158,56°0退火4〇8,72°0延伸5〇8,40個(gè)循環(huán)，72°0延伸11^11。
[0065] 步驟（3)中所述的雜交反應(yīng)條件是：注入的雜交液為14. 5ul，反應(yīng)時(shí)間為30min。
[0066] 步驟（2)所述的PCR擴(kuò)增與步驟（3)所述的雜交在芯片儀上完成。
[0067] 本發(fā)明與現(xiàn)有檢測(cè)方法相比，將DNA雜交檢測(cè)的擴(kuò)增過程和雜交檢測(cè)過程濃縮到 一張芯片上檢測(cè)，大大縮減了檢測(cè)的時(shí)間和復(fù)雜性，檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單易于攜帶，大大提高了當(dāng) 如的檢測(cè)能力。而從樣品米集到檢測(cè)總時(shí)間完全可以在3小時(shí)內(nèi)完成，有益于快速準(zhǔn)確的 檢測(cè)四種血清型的登革熱病毒。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0068] 圖1實(shí)施例1登革熱病毒血清I型陽性結(jié)果；
[0069] 圖2實(shí)施例1登革熱病毒血清II型陽性結(jié)果；
[0070] 圖3實(shí)施例1登革熱病毒血清III型陽性結(jié)果；
[0071] 圖4實(shí)施例1登革熱病毒血清IV型陽性結(jié)果；
[0072] 圖5實(shí)施例1登革熱病毒四種血清型陽性結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0073] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
[0074] 實(shí)施例1登革熱病毒四種血清型的檢測(cè)特異性與靈敏性
[0075] -、實(shí)驗(yàn)步驟
[0076] 1.血液樣本的采集
[0077] 取口岸檢測(cè)病人的全血樣本I. 0ml，離心處理得到血清。
[0078] 2.血液樣本的初步鑒定
[0079] 采用膠體金法初步確定該病人是否感染登革熱。
[0080] 3.基因組RNA的提取
[0081] 使用血液樣本基因組RNA提取試劑盒（離心柱型，Qiagen公司）提取登革熱RNA。 取IOOuL血清樣本，按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
[0082] 4. RNA濃度的測(cè)定
[0083] 使用ABI的實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)儀通過實(shí)時(shí)定量PCR的方法定量RNA濃度。
[0084] 5.靶基因的擴(kuò)增
[0085] 5.1引物和探針的設(shè)計(jì)
[0086] 針對(duì)登革熱通用基因和四種血清型特有基因，設(shè)計(jì)引物，在引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)能 夠區(qū)別其他物種的特異性探針。本實(shí)施例均針對(duì)通用基因和四種血清型登革熱特有基因設(shè) 計(jì)了兩對(duì)引物和探針，分別是登革熱通用基因 polyprotein gene的兩對(duì)正反引物和探針 (SEQ ID N01-6)，登革 I 型 polyprotein gene 的兩對(duì)正反引物和探針（SEQ ID N07-12)，登 革 II 型polyprotein gene polyprotein gene 的兩對(duì)正反引物和探針（SEQ ID N013-18)， 登革III型envelope glycoprotein gene的兩對(duì)正反引物和探針（SEQ ID N019-24),登革 IV型polyprotein gene的兩對(duì)正反引物和探針（SEQ ID N025-30)。特異性探針點(diǎn)入芯片 上。
[0087] 5. 2反應(yīng)平臺(tái)
[0088] 在芯片儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增與雜交反應(yīng)。為防止引物間的互相作用，分兩個(gè)反應(yīng)室 進(jìn)行PCR反應(yīng)，兩個(gè)反應(yīng)室都可以聯(lián)通到雜交室，PCR后的擴(kuò)增液可以通過注射壓力方式使 其流入雜交室進(jìn)行雜交反應(yīng)。
[0089] PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12. 5ul, MgSO4 MmM 2. 5ul, PrimerR 2.5ul,Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1.0 μ I,Freshly Diluted L RT-PCR Contro12. 0 μ I, Sample 5ul〇
[0090] 反應(yīng)條件相同：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min，95°C預(yù)變性2min ;95°C變性15s，56°C退火 40s，72°C延伸 50s，40 個(gè)循環(huán)，72°C延伸 Imin。
[0091] 6.雜交反應(yīng)
[0092] 分別注入PCR反應(yīng)室14. 5ul雜交夜，使雜交夜和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙內(nèi)，反應(yīng) 30min。雜交后的芯片用washing buffer 3000rpm 2min沖洗，直接用焚光掃描儀檢測(cè)。
[0093] 7.檢測(cè)體系特異性
[0094] 將檢測(cè)到四種血清型的登革熱RNA混合，一起加入到芯片上進(jìn)行檢測(cè)。
[0095] 8.現(xiàn)場(chǎng)樣品特異性檢測(cè)
[0096] 在云南瘧疾疫區(qū)，取經(jīng)過PCR確認(rèn)為登革熱I型、II型的樣本各10份，登革熱陰 性樣本10份，提取RNA，進(jìn)行芯片測(cè)定。
[0097] 二、結(jié)果
[0098] 1.芯片的檢測(cè)能力
[0099] 用口岸檢測(cè)到的登革熱病毒陽性樣品進(jìn)行了芯片實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見圖1-4。
[0100] 圖1-4顯示，通過芯片實(shí)驗(yàn)，在芯片的相應(yīng)位置會(huì)出現(xiàn)明顯的陽性信號(hào)。同時(shí)，陽 性對(duì)照位置出現(xiàn)明顯的雜交信號(hào)，陰性對(duì)照處不出現(xiàn)雜交信號(hào)。這表明芯片的檢測(cè)性能良 好。
[0101] 2.樣品特異性試驗(yàn)：
[0102] 對(duì)四種血清型混合后的RNA樣本檢測(cè)，可以同時(shí)檢測(cè)到四種血清型的登革熱病 毒，表明互相之間無交叉影響，結(jié)果見圖5。
[0103] 3,現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)
[0104] 對(duì)云南現(xiàn)場(chǎng)樣品芯片檢測(cè)結(jié)果，顯示30份樣本，10份為登革熱I型，10份為登革 熱II型，10份為陰性，與PCR結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1. 一種快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：包括如下步驟： (1) 全血標(biāo)本進(jìn)行RNA液提??； (2) RT-PCR 擴(kuò)增： a. RT-PCR反應(yīng)體系包括：PCR反應(yīng)緩沖液（含PCR酶及逆轉(zhuǎn)錄酶），待測(cè)樣本基因特異 性正、反向引物，PCR Grade H20，PCR Control, DNA提取液；所述的特異性正、反引物是根據(jù) 登革熱病毒通用基因和四種血清型特有基因設(shè)計(jì)的引物； b. 將PCR反應(yīng)液加入已含有待測(cè)基因特異性探針的芯片反應(yīng)室內(nèi)內(nèi)，將芯片放入機(jī)器 進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)；特異性探針是根據(jù)特異性引物擴(kuò)增區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)，能夠區(qū)別其他物種；特異性 探針點(diǎn)入芯片上； (3) 雜交：PCR擴(kuò)增完后，將雜交反應(yīng)液加入芯片，使雜交液和擴(kuò)增液都進(jìn)入到雜交艙 內(nèi)雜交反應(yīng)； (4) 清洗：雜交后的芯片用洗液沖洗，直接用熒光掃描儀檢測(cè)； (5) 結(jié)果判讀。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：所述 的特有基因分別是登革熱通用基因 polyprotein gene，登革I型polyprotein gene，登革 II 型 polyprotein gene，登革III型 envelope glycoprotein gene,登革IV型 polyprotein gene。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：根據(jù) 登革熱病毒通用基因和四種血清型特有基因設(shè)計(jì)的特異性引物和探針均為兩對(duì)： 登革熱通用基因 polyprotein gene : Dl-F ：AGAGAGCAGATCTCTGATG (SEQ ID NO 1) D1-R:GAGAATCTCTTCGCCAA (SEQ ID NO 2) Probe:CTTTCAATATGCTGAAACG (SEQ ID NO 3) 和 D2-F ：GCATATTGACGCTGGGAGA (SEQ ID NO 4) D2-R:GGCGTTCTGTGCCTGGA (SEQ ID NO 5) Probe:AGAGATCCTGCTGTCT (SEQ ID NO 6) 登革 I 型 polyprotein gene ： DI 1-F:CATTAATAGCTGGAGGCATG (SEQ ID NO 7) DI 1-R:GTGAGGCGCCAGAGTGTT (SEQ ID NO 8) Probe:CATATCCGGAAGCTCGGCCG (SEQ ID NO 9) 和 DI2-F:CACACCACACCCTTTGGAC (SEQ ID NO 10) DI2-R:CCTGGCTGTCACCTCCAT (SEQ ID NO 11) Probe:GAGGGTGTTTAAAGAGAAAGTTGACACGC (SEQ ID NO 12) 登革 II 型 polyprotein gene: DII 1-F:GGCCATAGACCTTGGTGAA (SEQ ID NO 13) DII 1-R:TACCCATGTGGACGTAGAGT (SEQ ID NO 14) Probe:CACGTACAAGTGTCCCCTCCTCAGG (SEQ ID NO 15) 和 DII2-F:CATGGCCCTGGTGGC (SEQ ID NO 16) DII2-R:CCCATCTTTTCAGTATCCC (SEQ ID NO 17) Probe:TCCTTCGTTTCCTAACAAT (SEQ ID NO 18) 登革III型 envelope glycoprotein gene: D III1_F:GCACGGTGGGTGTGTGAC (SEQ ID NO 19) D III 1-R:CCTCGGTCTTCTGGAGCTCTAT (SEQ ID NO 20) Probe ：TGGCTAAGAACAAGCCCACGC (SEQ ID NO 21) 和 D III2-F:GGAAAACCGTCTATCAA (SEQ ID NO 22) D III 2-R:GCCATAACCAATTTCATTG (SEQ ID NO 23) Probe ：CAGTTGGCGAAGAGATTCTCAAGAG (SEQ ID NO 24) 登革IV型 polyprotein gene: D IV 1-F:CCAGCGAACTGTCTTCTTT (SEQ ID NO 25) D IV 1-R:TCCTACGCATCGCATTC (SEQ ID NO 26) Probe:AATGATGCTGGTCGCCCCATC (SEQ ID NO 27) 和 D IV 2-F:GAAGAGATTCTCAACCGG (SEQ ID NO 28) D IV 2-R:TCCCTGCTGTTGGTGG (SEQ ID NO 29) Probe:ATCACGTTTTTGCGAGTCCTTTC (SEQ ID NO 30)〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：步驟 (1) 中所述的RNA提取可使用血液樣本基因組RNA提取試劑盒提取登革熱；取lOOul全血， 按照試劑盒說明書中的提取步驟提取RNA。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于： 步驟⑵中所述的 PCR 反應(yīng)體系為：2X Mater mix 12.5ul，MgS0414mM 2.5ul，PrimerR 2. 5ul,Superscript III RT/Platinum Taq Mix 1. 0y1, Freshly Diluted L RT-PCR Control2. 0 y1, sample 5ul〇
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：步驟 ⑵所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件是：50°C逆轉(zhuǎn)錄20min，95°C預(yù)變性2min ;95°C變性15s， 56°〇退火4〇8,72°0延伸5〇8,40個(gè)循環(huán)，72°0延伸1111111。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：步驟 (3) 中所述的雜交反應(yīng)條件是：注入的雜交液為14. 5ul，反應(yīng)時(shí)間為30min。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：步驟 (2) 所述的PCR擴(kuò)增與步驟（3)所述的雜交在芯片儀上完成。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速高通量的登革熱病毒檢測(cè)分型方法，其特征在于：步驟 (4) 中所述的清洗條件是：3000rpm，2min。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK104480221SQ201410674255
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月21日
【發(fā)明者】田楨干, 張子龍, 李深偉, 王傳現(xiàn), 李平, 王俐, 趙百慧 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)上海出入境檢驗(yàn)檢疫局