反轉(zhuǎn)錄pcr檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法，反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒包括引物、探針和FRET-PCR標準品，其特征在于：所述引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探針和Cy5探針；所述上游引物具有SEQ ID No.1的核苷酸序列；所述6-FAM探針具有SEQ ID No.2的核苷酸序列；所述Cy5探針具有SEQ ID No.3的核苷酸序列；所述下游引物具有SEQ ID No.4的核苷酸序列。本發(fā)明操作便捷，適合于檢測大量樣本,可以快速,高度靈敏、特異、快速檢測的并分型所有登革病毒的血清型。
【專利說明】反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物科學【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑 盒及其檢測方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 登革熱（Dengue fever, DF)是由登革病毒（Dengue virus, DENV)弓丨起的急性傳 染病，主要通過埃及伊蚊和白紋伊蚊傳播。登革熱作為一種急性傳染病，其在流行地區(qū)的預 防，尤其是爆發(fā)流行地區(qū)的診斷和控制尤其重要。臨床主要表現(xiàn)為高熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié) 痛、皮疹、淋巴結(jié)腫大及白細胞減少等，嚴重者可出現(xiàn)出血或休克，甚至死亡。世界衛(wèi)生組織 把登革熱分為典型登革熱、登革出血熱（Dengue hemorrhagic fever, DHF)和登革休克綜合 征（Dengue shock syndrome, DSS)三型，后兩型病情嚴重，病死率高。該病主要流行于熱帶 和亞熱帶地區(qū)，目前全球已有100多個國家和地區(qū)有此病病例的報道，有約25-30億人處于 登革病毒感染的危險中。在我國，自從1873年首次報道以來每年都有登革熱感染人的病例 報道，該病在我國一直間斷流行，病例分布的范圍也在不斷擴大。
[0003] 登革病毒屬于黃病毒科（Flaviviridae)、黃病毒屬（Flavivirus)病毒，其基因組 為單股正鏈RNA，根據(jù)其表面E抗原的不同可把登革病毒分為4個血清型（DENV1、DENV2、 DENV3和DENV4)，各血清型之間存在一定的交叉反應。登革病毒1-4型在我國出現(xiàn)反復的 交替流行，但以登革病毒1型為主，近年來出現(xiàn)了在某一地區(qū)連續(xù)數(shù)年主要流行一種血清 型別，例如廣東：登革病毒1型的現(xiàn)象。
[0004] 目前，登革病毒的檢測和診斷主要通過病毒分離培養(yǎng)、血清學方法以酶聯(lián)免疫吸 附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)為主及分子生物學方法，以反轉(zhuǎn)錄 PCR為主）。病毒分離培養(yǎng)具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，但同時對培養(yǎng)環(huán)境、人員、培養(yǎng) 條件和儀器設備要求較高；血清學檢測是目前應用最廣泛的方法，但抗體一般會在機體感 染病毒5天后產(chǎn)生以及不同血清型的登革病毒之間的交叉反應，使得本方法對登革熱集中 爆發(fā)時的檢測和確診比較困難；分子生物學檢測，尤其是PCR，反轉(zhuǎn)錄PCR方法的建立和應 用，為登革熱疾病的預防以及爆發(fā)時的確診和診斷提供了準確、可靠的依據(jù)。
[0005] 目前登革病毒感染的檢測方法主要有：（1)病毒分離培養(yǎng)。用于登革病毒分離和 培養(yǎng)的動物模型或細胞系包括乳鼠、蚊子和蚊子細胞系，本方法具有靈敏度高和特異性強 等優(yōu)點，但同時耗時、耗力且對實驗條件和人員要求較高；
[0006] 病毒分離培養(yǎng)。登革病毒是一種蟲媒病毒，在體外培養(yǎng)比較困難，且不同血清型的 登革病毒最適的細胞系或動物是不同的。
[0007] 目前，登革病毒的體外接種培養(yǎng)的細胞或動物主要有：(a)乳鼠 Suckling mice。 登革病毒4個血清型DENV1-4都曾在乳鼠體內(nèi)分離或接種成功。由于乳鼠母源抗體的干 擾，使其對接種病原體表現(xiàn)出較低易感性，而且操作極其繁瑣，所以目前登革病毒的分離和 培養(yǎng)并不推薦此方法。
[0008] (b)蚊子細胞培養(yǎng)Mosquito cell cultures。目前為止，多種品種的蚊子細胞系 被建立。由于蚊子屬于昆蟲，其細胞系培養(yǎng)所需溫度較低，且登革病毒對低溫不敏感，所以 蚊子細胞系更有利于登革病毒的培養(yǎng)，其中C6/36Ae. albopictus細胞系對登革病毒表現(xiàn) 出較高的敏感性，應用較為廣泛。
[0009] (c)蚊子接種Mosquito inoculation。此方法作為一種診斷和病毒擴增的方式， 為登革病毒的分離和培養(yǎng)提供一種較為敏感的方法。雖然細胞系和動物接種培養(yǎng)具有較高 的靈敏度，但由于其耗時、耗力，同時需要較高的實驗條件和儀器設備等，在臨床檢測和診 斷中并不常用。
[0010] (2)血清學檢測。登革病毒包括黃病毒屬Flavivirus的其他病毒首次感染機體 后首先會產(chǎn)生IgM抗體，一段時間后當IgM抗體水平降低后IgG抗體隨之增高；當?shù)歉锊《?[包括黃病毒屬（Flavivirius)的其他病毒]第二次感染機體后，IgG和IgM抗體同時產(chǎn) 生，且IgG抗體占優(yōu)勢。所以，目前有兩種分別針對IgG和IgM的商業(yè)化ELISA試劑盒。
[0011] ELISA 檢測 IgMIgM antibody capture ELISA, MAC-ELISA。MAC-ELISA 方法是目前 在診斷實驗室和商業(yè)化診斷試劑盒中應用最廣泛的方法，可以檢測登革病毒1-4型。但本 方法與黃病毒屬中的其他病毒存在交叉反應，使得檢測結(jié)果的可信度降低，尤其是在登革 病毒和其他黃病毒屬病毒同時流行的地區(qū)。2)ELISA檢測IgG。依據(jù)此原理的ELISA試劑 盒主要用于登革病毒或其他黃病毒屬病毒二次感染的檢測，但由于此檢測方法的種屬特異 性較差，不能區(qū)分感染的病毒種屬，因此實用性不強。值得說明的是，機體內(nèi)的抗體一般需 要在機體感染登革病毒至少5天后才能達到檢測水平，同時ELISA檢測方法在不同血清型 的登革病毒之間存在交叉反應，所以在登革熱流行或爆發(fā)的時期，血清學方法不能及時的 檢出感染病例并確定登革病毒的血清型，這十分不利于登革熱這種急性傳染病的診斷、監(jiān) 測和控制。
[0012] (3)分子生物學方法。近年來，以反轉(zhuǎn)錄PCR，尤其是實時反轉(zhuǎn)錄PCR為主的分子 生物學方法的發(fā)展為登革熱的控制和預防提供了更快速、更可靠的方法學和理論學依據(jù)。 本發(fā)明建立的RT-PCR體系可以檢測到包括血液在內(nèi)的各種樣品中登革病毒的核酸并且確 定感染的登革病毒的血清型，尤其是病毒感染機體后而抗體產(chǎn)生前的5天，這就為登革熱 流行和爆發(fā)時的及時診斷、控制和預防提供了堅實的基礎(chǔ)。
[0013] 目前，缺乏一種高度靈敏、特異、快速檢測的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試 劑盒及其檢測方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0014] 本發(fā)明的目的是提供一種高度靈敏、特異、快速檢測的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登 革病毒的試劑盒及其檢測方法。
[0015] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試 劑盒，包括引物、探針和FRET-PCR標準品，所述引物為上游引物和下游引物；所述探針為 6-FAM探針和Cy5探針；
[0016] 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列；
[0017] 所述6-FAM探針具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列；
[0018] 所述Cy5探針具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列；
[0019] 所述下游引物具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
[0020] 進一步地，所述試劑盒包括：引物、6-FAM探針、Cy5探針、PCR緩沖液、熱啟動Taq 酶、dNTP、FRET-PCR標準品、PCR陰性對照；所述PCR陰性對照為雙蒸水。
[0021] 進一步地，所述FRET-PCR標準品是由所述的FRET-PCR的引物和探針對質(zhì)粒標準 品DNA模板進行擴增獲得的擴增核苷酸片段插入pUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
[0022] 更進一步地，所述質(zhì)粒標準品DNA模板的濃度為IO4/ μ 1。
[0023] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，所述實 時熒光定量FRET-PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、PCR陰性對照；
[0024] 所述實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系包括20 μ 1的擴增體系：10 μ 1的樣品 DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩沖液、1 μ M FRET-上游引物、1 μ M FRET-下游引物、 0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0025] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，所述反 轉(zhuǎn)錄PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、RNA提取的陰性對照和PCR陰性對照；
[0026] 所述反轉(zhuǎn)錄PCR擴增檢測體系包括20μ 1的擴增體系：10μ 1的樣品DNA模板或者 定量標準試劑、IxPCR緩沖液、ΙμΜ FRET-上游引物、ΙμΜ FRET-下游引物、0. 2μΜ的6-FAM 探針、0. 2 μ M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP、0. 14個單位的商業(yè)化反 轉(zhuǎn)錄酶、20個單位的商業(yè)化RNA酶抑制劑。
[0027] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，所述PCR 擴增設置反應條件包括：預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得 循環(huán)、1個持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個降溫循環(huán)；預變性：lx 2min@95°C ;18個溫度 遞減的高嚴謹循環(huán)：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個熔解循環(huán)：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù)收集熒光；降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
[0028] 本發(fā)明的一種所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，所述 PCR擴增設置反應條件包括：反轉(zhuǎn)錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹?shù)?熒光獲得循環(huán)和1個降溫循環(huán)；
[0029] 反轉(zhuǎn)錄：lx 30min@55 °C ;預變性：lx 2min@95 °C ;18個溫度遞減的高 嚴謹循環(huán)：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C ;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C ,and 30sec@72°C ;降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
[0030] 本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法在登革熱 病中的應用。
[0031] 本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法在登革熱 病的應用。
[0032] 有益效果：本發(fā)明操作便捷，適合于檢測大量樣本，可以快速，高度靈敏、特異、 快速檢測的并分型所有登革病毒的血清型。為登革熱爆發(fā)時的快速、準確地診斷大批臨床 樣品，并盡快地控制本病提供了堅實的基礎(chǔ)。本發(fā)明具有如下優(yōu)點：
[0033] (1)本發(fā)明可以特異性地檢測所有登革病毒血清型。登革病毒屬于黃病毒科、黃病 毒屬病毒，其基因組為單股正鏈RNA，全長約llkb，編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白和7種非結(jié)構(gòu)蛋白，結(jié) 構(gòu)蛋白分別為衣殼蛋白C，膜蛋白PrM/M和包膜蛋白E。包膜蛋白E誘導生成血凝抑制抗體、 中和抗體和保護性抗體、根據(jù)E抗原可把登革病毒分為四個血清型（DENV1、DENV2、DENV3和 DENV4)，各血清型之間存在交叉反應。因此，能夠同時檢測到所有登革病毒的血清型很重 要，尤其對于同源性差別較大的血清型；同時，檢測到所有的種或血清型可以更方便的發(fā)現(xiàn) 新的登革病毒血清型，并及時的更新登革病毒的分類，從而更好地認識該病原體。
[0034] (2)本發(fā)明RT-PCR體系具有極高的靈敏度。在病毒感染的早期或恢復期，機體內(nèi) 病毒的含量相對較低，這就需要靈敏度、準確度更高的檢測方法，從而能夠及時、快速地診 斷、監(jiān)測和控制傳染?。ㄓ绕湎竦歉餆徇@種急性傳染?。１景l(fā)明反轉(zhuǎn)錄PCR體系可以檢測 到單拷貝的質(zhì)粒核酸，載有埃博拉病毒5種亞型的DNA核酸，同時可以有效地擴增最低KT 7 禽流感病毒HlNl的RNA核酸，從雞胚尿囊液中制備的RNA核酸標準品。
[0035] (3)本發(fā)明可以對不同血清型的登革病毒進行分型。不同血清型的登革病毒可 以引起不同的疾病和癥狀。世界衛(wèi)生組織把登革熱分為典型登革熱、登革出血熱dengue hemorrhagic fever, DHF 和登革休克綜合征 dengue shock syndrome, DSS 三型，后兩型病 情嚴重，病死率高。典型登革熱起病急，表現(xiàn)為高熱、頭痛、肌肉和關(guān)節(jié)痛、淋巴結(jié)腫大、白細 胞減少等，約一半病例出現(xiàn)皮疹、血小板減少，部分病例出現(xiàn)眼眶后痛、嘔吐、肝功能損傷、 鼻衄及牙齦滲血等。各型登革病毒均可導致DHF和DSS，但初次感染DENV-2和DENV-3, DHF 和DSS的發(fā)生率高于DENV-I和DENV-4。病人第二次感染不同型登革病毒后，可能發(fā)生抗體 依賴感染增強現(xiàn)象antibody-dependent enhancement, ADE而常發(fā)展為嚴重的DHF，危機生 命。DENV-2和DENV-3再次感染導致DHF的可能性是DENV-4的2倍。因此，能夠檢測并確 定感染登革病毒的血清型能夠為更好地治療和控制登革熱提供科學依據(jù)。
[0036] (4)本發(fā)明根據(jù)登革病毒核酸序列保守區(qū)間建立了一種可以對所有登革病毒血清 型進行檢測和分型的反轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)。首先從NCBI上獲得所有登革病毒血清型以及與之 同源性較高的其他相關(guān)病原體的全基因序列，并選擇相對保守的區(qū)間設計引物（上游引物 和下游引物）和探針陽-FAM探針和Cy5探針），然后用該引物和探針對樣品進行實時、定 量、靈敏和快速地檢測。對于含有登革病毒RNA核酸的樣品，在反轉(zhuǎn)錄PCR結(jié)果中其熒光曲 線會在660nm處出現(xiàn)或增強，同時對于不同登革病毒血清型其高分辨率熔解曲線的熔解峰 會出現(xiàn)在不同的溫度處。因此，可以根據(jù)熔解峰溫度（Tm值）區(qū)分不同血清型的登革病毒。 [0037] (5)本發(fā)明的原理和最核心的思路是發(fā)明一種高度靈敏、特異、快速檢測和分型 所有登革病毒血清型DENV1-4的方法體系。同時確保此系統(tǒng)不擴增其它非登革病毒的 微生物，尤其是與其相近的其他病原體，如黃熱病毒Yellow fever virus、乙型腦炎病毒 Japanese encephalitis virus 和西尼羅河熱病毒 West Nile fever virus 等。本發(fā)明選 擇登革病毒保守區(qū)域作為目的片段設計引物和探針。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0038] 圖1為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄PCR的上游引物的示意圖；
[0039] 圖2為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄PCR的6-FAM探針的示意圖；
[0040] 圖3為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄PCR的Cy5探針的示意圖；
[0041] 圖4為本發(fā)明反轉(zhuǎn)錄PCR的下游引物的示意圖；
[0042] 圖5為本發(fā)明登革病毒1型的擴增曲線的示意圖
[0043] 圖6為本發(fā)明登革病毒1型的熔解曲線的示意圖；
[0044] 圖7為本發(fā)明登革病毒2型的擴增曲線的示意圖；
[0045] 圖8為本發(fā)明登革病毒2型的熔解曲線的示意圖；
[0046] 圖9為本發(fā)明3登革病毒3型的擴增曲線的示意圖；
[0047] 圖10為本發(fā)明3登革病毒3型的熔解曲線的示意圖；
[0048] 圖11為本發(fā)明登革病毒4型的擴增曲線的示意圖；
[0049] 圖12為本發(fā)明登革病毒4型的熔解曲線的示意圖；
[0050] 圖13為本發(fā)明登革病毒1，2, 3,4型質(zhì)粒的擴增曲線的示意圖；
[0051] 圖14為本發(fā)明登革病毒1，2, 3,4型質(zhì)粒的熔解曲線的示意圖；
[0052] 圖15為本發(fā)明中反轉(zhuǎn)錄PCR體系的擴增曲線的示意圖；
[0053] 圖16為本發(fā)明中反轉(zhuǎn)錄PCR體系的熔解曲線的示意圖；
[0054] 圖17為本發(fā)明四種登革病毒血清型瓊脂糖凝膠電泳的示意圖。

【具體實施方式】
[0055] 下面將通過附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步的具體描述，但不能理解為是對 本發(fā)明保護范圍的限定。
[0056] 實施例1
[0057] 本發(fā)明提供了一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒，包括引物、探針和 FRET-PCR標準品，所述引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探針和Cy5探針；
[0058] 上游引物：5 ' -GACTAGTGGTTAGAGGAGACCCCTCC-3 ' SEQ ID No. 1，此引物序列與 DENVl型完全吻合，而與DENV2, DENV3和DENV4都有一個相同的錯配堿基；
[0059] 6-FAM 探針：5' -CTGTAGAGACAGCAGGATCTCTGGTC-6-FAM-3' SEQ ID No. 2 ;反轉(zhuǎn)錄 PCR 的 6-FAM 探針序列：5' -CTGTAGAGACAGCAGGATCTCTGGTC-6-FAM-3'（26bp)，此序列為圖 中獲得序列的對稱鏈核苷酸序列。此FAM探針序列與所有登革病毒血清型完全吻合；
[0060] Cy5 探針：5' -Cy5-CTCCCAGCGTCAATATGCTGTTT -磷酸基團-3' SEQ ID No. 3 ;反轉(zhuǎn) 錄 PCR 的 Cy5 探針序列：5' -Cy5-CTCCCAGCGTCAATATGCTGTTT -磷酸基團-3'（23bp)，此序 列為圖中獲得序列的對稱鏈核苷酸序列。此FAM探針序列與DENVl和DENV3完全吻合，而 與DENV2和DENV4在相同位置有1個錯配堿基；
[0061] 下游引物：5' -GGCGYTCTGTGCCTGGAWTGATG-3' SEQ ID No. 4 ;反轉(zhuǎn)錄 PCR 下游引物 序列：5'-GGCGYTCTGTGCCTGGAWTGATG-3'（23bp)，此序列為圖中獲得序列的對稱鏈核苷酸序 列。此下游引物序列中有2個兼并堿基Y和W，其中兼并堿基Y可以同時擴增T和C堿基， 兼并堿基W可以同時擴增A和T堿基。因此，此引物序列和所有登革病毒血清型完全吻合。
[0062] 所述試劑盒包括：引物、6-FAM探針、Cy5探針、PCR緩沖液、熱啟動Taq酶、dNTP、 FRET-PCR標準品、PCR陰性對照；所述PCR陰性對照為雙蒸水。
[0063] 所述FRET-PCR標準品是由所述的FRET-PCR的引物和探針對質(zhì)粒標準品DNA模板 進行擴增獲得的擴增核苷酸片段插入PUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
[0064] 本發(fā)明試劑盒中提供登革病毒4個血清型濃度為104/ μ 1的質(zhì)粒標準品DNA模 板。合成登革病毒4個血清型（DENV1，DENV2，DENV3，DENV4)目的片段的DNA序列。
[0065] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，所述實 時熒光定量FRET-PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、PCR陰性對照；
[0066] 所述實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系包括20 μ 1的擴增體系：10 μ 1的樣品 DNA模板或者定量標準試劑、IxPCR緩沖液、1 μ M FRET-上游引物、1 μ M FRET-下游引物、 0. 2 μ M的6-FAM探針、0. 2 μ M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP。
[0067] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，所述反 轉(zhuǎn)錄PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、RNA提取的陰性對照和PCR陰性對照；
[0068] 所述反轉(zhuǎn)錄PCR擴增檢測體系包括20μ 1的擴增體系：10μ 1的樣品DNA模板或者 定量標準試劑、IxPCR緩沖液、ΙμΜ FRET-上游引物、ΙμΜ FRET-下游引物、0. 2μΜ的6-FAM 探針、0. 2 μ M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 μ M dNTP、0. 14個單位的商業(yè)化反 轉(zhuǎn)錄酶、20個單位的商業(yè)化RNA酶抑制劑。
[0069] 制備PCR用的標準定量試劑。
[0070] (I) FRET-PCR標準品的制備
[0071] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成登革病毒4個血清型（DENV1，DENV2， DENV3, DENV4)目的片段的DNA序列。依據(jù)合成物的分子量和絕對重量，計算合成物所含的 基因拷貝的絕對數(shù)目。隨后，對合成物進行稀釋，制備每10 μ 1合成物的稀釋試劑含10, 〇〇〇 拷貝、1，000拷貝、100拷貝、10拷貝、1拷貝的目的基因作為標準品。本發(fā)明試劑盒中提供 登革病毒4個血清型濃度為104/μ 1的質(zhì)粒標準品。
[0072] (2)反轉(zhuǎn)錄PCR標準品的制備
[0073] 用禽流感病毒（HlNl)感染雞胚后收取其尿囊液，用商業(yè)RNA提取試劑盒（High Pure RNA Isolation Kit，羅氏，德國）進行RNA核酸提取后，用TE緩沖液（PH 8.0)進行 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8梯度稀釋后作為檢測反轉(zhuǎn)錄PCR系統(tǒng)效率的標準品。
[0074] 本發(fā)明的一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，所述PCR 擴增設置反應條件包括：預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得 循環(huán)、1個持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個降溫循環(huán)；預變性：lx 2min@95°C ;18個溫度 遞減的高嚴謹循環(huán)：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個熔解循環(huán)：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù)收集熒光；降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
[0075] 本發(fā)明的一種所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，所述 PCR擴增設置反應條件包括：反轉(zhuǎn)錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹?shù)?熒光獲得循環(huán)和1個降溫循環(huán)；
[0076] 反轉(zhuǎn)錄：lx 30min@55 °C ;預變性：lx 2min@95 °C ;18個溫度遞減的高 嚴謹循環(huán)：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C ,and 30sec@72°C ;降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
[0077] 本發(fā)明所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法在登革熱 病中的應用。
[0078] 瓊脂糖凝膠電泳：
[0079] 圖15為本發(fā)明中反轉(zhuǎn)錄PCR體系的擴增曲線的示意圖；圖16為本發(fā)明中反轉(zhuǎn)錄 PCR體系的熔解曲線的示意圖；
[0080] 如圖17所示，圖17為本發(fā)明四種登革病毒血清型瓊脂糖凝膠電泳。本發(fā)明RT-PCR 體系擴增四種登革病毒血清型（DENV1，DENV2, DENV3和DENV4)DNA的目的核苷酸片段大小 為200個堿基對bp。各泳道依次為：泳道-1 :標準品Ladder，泳道-2 :登革病毒1型DENV1， 泳道-3 :登革病毒2型DENV2,泳道-4 :登革病毒3型DENV3,泳道-5 :登革病毒4型DENV4， 泳道-6:陰性對照。
[0081] 配制3 %瓊脂糖凝膠，取10 μ I PCR擴增產(chǎn)物，并用SYBKx. Safe DNA Gel Stain 染色，在紫外燈下觀察，可以看到200bp處的目的條帶。所使用的標準品為20bp DNA Ladder(Thermo Scientific OjRangeRuler 20bp DNA Ladder, ready-to-use, Fermentas? by Thermo Scientific?,美國）]，且其條帶大小依次為 20bp, 40bp, 60bp, 80bp, IOObp, 120bp，140bp，160bp，180bp，200bp，300bp。對于不同血清型的登革病毒，其熔解峰的溫度， Tm值會有差異。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳中的條帶大小為200bp。
[0082] PCR結(jié)果的判定：
[0083] 圖5為本發(fā)明登革病毒1型的擴增曲線。擴增曲線圖5表明本發(fā)明系統(tǒng)可以檢測 到反應體系中單拷貝的登革病毒1型DNA分子，且具有可重復性；圖6為本發(fā)明登革病毒1 型的熔解曲線，表明本發(fā)明系統(tǒng)對于登革病毒1型具有穩(wěn)定的Tm值；
[0084] 圖7為本發(fā)明登革病毒2型的擴增曲線的示意圖，表明本發(fā)明系統(tǒng)可以檢測到反 應體系中單拷貝的登革病毒2型DNA分子，且具有可重復性；圖8為本發(fā)明登革病毒2型的 熔解曲線的示意圖，表明本發(fā)明系統(tǒng)對于登革病毒2型具有穩(wěn)定的Tm值；
[0085] 圖9為本發(fā)明3登革病毒3型的擴增曲線的示意圖；可以檢測到反應體系中單拷 貝的登革病毒3型DNA分子，且具有可重復性；圖10為本發(fā)明3登革病毒3型的熔解曲線 的示意圖；表明本發(fā)明系統(tǒng)對于登革病毒3型具有穩(wěn)定的Tm值；
[0086] 圖11為本發(fā)明登革病毒4型的擴增曲線的示意圖，表明本發(fā)明系統(tǒng)可以檢測到 反應體系中單拷貝的登革病毒4型DNA分子，且具有可重復性；圖12為本發(fā)明登革病毒4 型的熔解曲線的示意圖，表明本發(fā)明系統(tǒng)對于登革病毒4型具有穩(wěn)定的Tm值；
[0087] 如圖13和圖14所示，本發(fā)明根據(jù)登革病毒核苷酸序列中保守區(qū)間巧妙地設計了 一對引物（上游引物和下游引物）和探針出-FAM探針和Cy5探針）并依此建立可以檢測所 有血清型登革病毒的反轉(zhuǎn)錄PCR體系，同時本發(fā)明體系可以將登革病毒4個血清型（DENV1、 DENV2、DENV3和DENV4)依據(jù)其RT-PCR高分辨率熔解曲線的Tm值的不同分為DENVI、DENV3、 DENV2/DENV4三個組；圖13為本發(fā)明登革病毒1，2,3,4型質(zhì)粒的擴增曲線的示意圖；本發(fā) 明系統(tǒng)可以檢測到反應體系中單拷貝的登革病毒1，2,3,4型DNA分子，且具有可重復性； FRET-PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、PCR陰性對照，所述PCR陰性對照為雙蒸水； 反轉(zhuǎn)錄PCR擴增對象包括標準品RNA模板、RNA提取的陰性對照和PCR陰性對照。圖14為 本發(fā)明登革病毒1，2,3,4型質(zhì)粒的熔解曲線的示意圖。此發(fā)明有著高度的特異性，不僅能 檢測到四種登革病毒血清型的核酸，如圖14所示，為表明本發(fā)明系統(tǒng)對于登革病毒1，2, 3， 4型具有穩(wěn)定的Tm值，同時依據(jù)Tm值的不同可以將登革病毒1，2, 3,4型分為DENVl，DENV2/ DENV4、DENV3三個組；而且能夠根據(jù)PCR熔解曲線將其分為3組：登革病毒1型、登革病毒 3型、登革病毒2型/4型。陽性樣品和陽性對照FRET-PCR的熒光擴增曲線在660nm有熒光 的出現(xiàn)或增強，且熔解曲線中有熔解峰出現(xiàn)。
[0088] 實施例2
[0089] 轉(zhuǎn)錄方法驗證本發(fā)明PCR體系
[0090] 由金斯瑞（金斯瑞生物科技，中國南京）合成含有登革病毒1型目的片段DNA和 17啟動子的質(zhì)粒PUC57,用合適的限制性內(nèi)切酶（Sac I，寶生物，大連）對質(zhì)粒進行酶切； 通過PCR擴增提高目的DNA濃度；用商業(yè)化轉(zhuǎn)錄試劑盒（MEGAscripPKit，amhior# by life technoioges%美國）對PCR擴增產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)錄并獲得RNA產(chǎn)物；轉(zhuǎn)錄完成后，將轉(zhuǎn)錄 產(chǎn)物直接用于反轉(zhuǎn)錄PCR進行擴增。
[0091] (1)質(zhì)粒的稀釋
[0092] 將含有合成質(zhì)粒的微型離心管4000轉(zhuǎn)離心2分鐘，然后加入40 μ 1雙蒸水或TE 緩沖液（PH8. 0)配成質(zhì)粒濃度為IOOng/ μ 1的溶液；
[0093] (2)質(zhì)粒的酶切

【權(quán)利要求】
1. 一種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒，包括引物、探針和FRET-PCR標準品， 其特征在于：所述引物為上游引物和下游引物；所述探針為6-FAM探針和Cy5探針； 所述上游引物具有SEQ ID No. 1的核苷酸序列； 所述6-FAM探針具有SEQ ID No. 2的核苷酸序列； 所述Cy5探針具有SEQ ID No. 3的核苷酸序列； 所述下游引物具有SEQ ID No. 4的核苷酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒，其特征在于：所 述試劑盒包括：引物、6-FAM探針、Cy5探針、PCR緩沖液、熱啟動Taq酶、dNTP、FRET-PCR標 準品、PCR陰性對照；所述PCR陰性對照為雙蒸水。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒，其特征在于：所 述FRET-PCR標準品是由所述的FRET-PCR的引物和探針對質(zhì)粒標準品DNA模板進行擴增獲 得的擴增核苷酸片段插入PUC57載體構(gòu)建而成的重組質(zhì)粒。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒，其特征在于：所 述質(zhì)粒標準品DNA模板的濃度為104/ yl。
5. -種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，其特征在于：所述 實時熒光定量FRET-PCR擴增對象包括質(zhì)粒標準品DNA模板、PCR陰性對照； 所述實時熒光定量FRET-PCR擴增檢測體系包括20 yl的擴增體系：10 yl的樣品DNA 模板或者定量標準試劑、lxPCR緩沖液、1 ii M FRET-上游引物、1 ii M FRET-下游引物、0. 2 ii M 的6-FAM探針、0. 2 ii M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 ii M dNTP。
6. -種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的PCR擴增體系，其特征在于：所述 反轉(zhuǎn)錄PCR擴增對象包括標準品質(zhì)粒標準品DNA模板、RNA提取的陰性對照和PCR陰性對 昭. >、、、? 所述反轉(zhuǎn)錄PCR擴增檢測體系包括20iU的擴增體系：10ia的樣品DNA模板或者定量 標準試劑、lxPCR緩沖液、1 ii M FRET-上游引物、1 ii M FRET-下游引物、0. 2 ii M的6-FAM探 針、0. 2 ii M的Cy5探針、2個單位的商業(yè)化Taq酶、200 ii M dNTP、0. 14個單位的商業(yè)化反轉(zhuǎn) 錄酶、20個單位的商業(yè)化RNA酶抑制劑。
7. -種反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，其特征在于：所述PCR 擴增設置反應條件包括：預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得 循環(huán)、1個持續(xù)熒光獲得的熔解循環(huán)和1個降溫循環(huán)；預變性：lx 2min@95°C ;18個溫度 遞減的高嚴謹循環(huán)：6x lsec@95°C，12sec@7(rC，8sec(g72t： ;9x lsec@95°C，12sec@68t：， 8sec@72°C ;3x lsec@95°C，12sec@66°C，8sec@72°C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;1 個熔解循環(huán)：lx lsec@95°C，10sec@38°C，@85°C持續(xù)收集熒光；降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
8. -種所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒的檢測方法，其特征在于：所 述PCR擴增設置反應條件包括：反轉(zhuǎn)錄、預變性、18個溫度遞減的高嚴謹循環(huán)、40個欠嚴謹 的熒光獲得循環(huán)和1個降溫循環(huán)； 反轉(zhuǎn)錄：lx 30min@55 °C ;預變性：lx 2min@95 °C ;18個溫度遞減的高嚴謹循 環(huán)：6x lsec@95 °C，12sec@70 °C，8sec@72 °C ;9x lsec@95 °C，12sec@68 °C，8sec@72 °C ; 3x lsec@95 °C，12sec@66 °C，8sec@72 °C ;40 個欠嚴謹?shù)臒晒猥@得循環(huán)：40x lsec@95°C，8sec@56°C (在此收集熒光），30sec@67°C，and 30sec@72°C ;降溫循環(huán)：lx lsec@38°C。
9.權(quán)利要求1-4任一項所述的反轉(zhuǎn)錄PCR檢測和分型登革病毒的試劑盒及其檢測方法 在登革熱病中的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK104328222SQ201410655886
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年11月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月17日
【發(fā)明者】王成明, 張繼壘, 陸光武 申請人:揚州大學