本發(fā)明涉及一種海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測方法。

背景技術(shù)：

海參是我國北方沿海地區(qū)海水養(yǎng)殖中產(chǎn)值最大的一個品種。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的迅速擴(kuò)張及生產(chǎn)過程中的不規(guī)范操作，養(yǎng)殖海參疾病發(fā)生嚴(yán)重，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。其中“化皮病”是目前流行最嚴(yán)重的疾病，該病主要由細(xì)菌感染所致，黃海希瓦氏菌是引起北方地區(qū)海參化皮病的重要病原菌。

目前，海洋微生物檢測方法一般為生化檢測法，但該方法存在培養(yǎng)周期長，操作繁瑣，特異性差等缺點(diǎn)。同時(shí)，由于自然環(huán)境中僅有小于1％左右的微生物為可培養(yǎng)，而基因芯片不需要活的細(xì)菌，只需有DNA即可。細(xì)菌檢測基因芯片的涉及多采用細(xì)菌學(xué)上較保守的基因，比如被稱為細(xì)菌進(jìn)化的“活化石”16S rRNA基因，而16S rRNA基因由于信息位點(diǎn)較少，因此構(gòu)建的系統(tǒng)穩(wěn)定性較差，用于鑒定親緣關(guān)系較接近的細(xì)菌，容易產(chǎn)生偏差，引起假陽性，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種可快速、高效、準(zhǔn)確的海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測方法，其具體步驟如下：

(1)基因芯片的制作

用于檢測的兩組探針SM1和SM2，探針序列如下：

SM1(5’-3’)：CTTCTCGGATGTCGAGTTCCACTTCGA；

SM2(5’-3’)：TCTGAAAAGCTACAGTTAACCATTCGTCGT；

將SM1和SM2在5’端加上15個T的間隔臂，并在探針5’端進(jìn)行氨基修飾；用雙蒸水將經(jīng)氨基修飾的探針稀釋成100μmol/L的母液，再用點(diǎn)樣緩沖液稀釋至濃度20μmol/L；使用點(diǎn)樣儀在醛基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣，然后將點(diǎn)樣后的芯片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內(nèi)，密閉后靜置于30℃烘箱過夜，得到用于檢測海參致病菌黃海希瓦氏菌的基因芯片；

(2)待測樣品DNA提取

將環(huán)境中的水樣、泥樣或生物樣品進(jìn)行取樣，然后提取待測樣品的DAN，備用；

(3)樣品PCR擴(kuò)增

用于黃海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)引物是：

SM1和SM2探針使用的引物基因序列如下：

上游引物：TGCACGCGGGTGGTAAGT；

下游引物：TGAGGTAATCAACAAAGGCAC；

將步驟(2)提取的樣品的DNA作為擴(kuò)增模板，以探針對應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；

(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記，將基因芯片進(jìn)行預(yù)雜交，然后，將經(jīng)熒光標(biāo)記后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)預(yù)雜交的基因芯片進(jìn)行雜交，離心干燥后，放于微陣列芯片掃描儀上檢測，收集檢測結(jié)果。

進(jìn)一步的，步驟(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，首先在95℃預(yù)變性5min；然后95℃變性30s，61℃退火30s，72℃延伸45s，共35個循環(huán)；最后72℃延伸10min。

進(jìn)一步的，預(yù)雜交時(shí)，使用鮭精DNA用預(yù)雜交緩沖液稀釋后進(jìn)行預(yù)雜交。

進(jìn)一步的，預(yù)雜交緩沖液與鮭精DNA的體積比為10:1。

本發(fā)明的有益效果：

通過使用DNAgyrase subunit B為靶基因設(shè)計(jì)的檢測黃海希瓦氏菌的特異性探針，能快速高效檢測海參致病菌黃海希瓦氏菌，并且具有更加特異性和敏感性的特點(diǎn)，提高了鑒定海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體致病菌黃海希瓦氏菌的能力，極大地縮短了檢測時(shí)間，有效預(yù)防“化皮病”的發(fā)生和蔓延。

附圖說明

圖1為黃海希瓦氏菌SM1特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖2為黃海希瓦氏菌SM2特異性探針基因芯片驗(yàn)證結(jié)果圖；

圖3為黃海希瓦氏菌SM1和SM2特異性探針基因芯片的檢測結(jié)果；

圖4為副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌用SM1和SM2特異性探針基因芯片的檢測結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1探針的設(shè)計(jì)及合成

1、目標(biāo)檢測菌種及靶基因

本發(fā)明選擇海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病菌黃海希瓦氏菌作為檢測對象，使用DNAgyrase subunit B為靶基因；

2、探針設(shè)計(jì)

本發(fā)明采用18-30bp的寡核苷酸探針。探針參數(shù)基本要求是特異性和高效性的雜交，應(yīng)滿足以下條件：①探針Tm值保持相近，在上下10℃范圍內(nèi)浮動；②形成二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的連續(xù)互補(bǔ)堿基數(shù)少于4個；③探針與非目標(biāo)基因序列的連續(xù)匹配堿基數(shù)少于7個堿基；④探針與目標(biāo)基因的錯配堿基數(shù)少于4個堿基。

本發(fā)明針對海參致病菌黃海希瓦氏菌共設(shè)計(jì)2條探針，如表1所示：

表1探針信息表

3、探針合成

將表1的探針在5’端加上15個T的間隔臂，以減少DNA雜交時(shí)的空間位阻，提高雜交效率。同時(shí)在探針5’端進(jìn)行氨基修飾，以備下一步與玻璃片上的醛基交聯(lián)，將探針固定在玻片上。如表2所示：

表2

實(shí)施例2基因芯片的制作

利用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的探針制備用于海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病菌黃海希瓦氏菌，具體步驟如下：

1、探針母液的配制

用雙蒸水將合成的探針(表2)稀釋成100μmol/L的母液，再用點(diǎn)樣緩沖液稀釋至濃度20μmol/L；

2、點(diǎn)樣前的準(zhǔn)備

取100μL移至96孔板的A1、B1、C1孔，在D1孔加入100μL點(diǎn)樣緩沖液；

3、點(diǎn)樣

用美國Bio-Dot公司的AD1500基因芯片點(diǎn)樣儀按照預(yù)先設(shè)定好的程序在醛基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣；每點(diǎn)點(diǎn)樣量為0.5μL，點(diǎn)直徑為200μm，點(diǎn)心間距為1.5mm，點(diǎn)樣時(shí)環(huán)境相對濕度55-65％，溫度23℃；

4、基因芯片的制備

將表2中經(jīng)合成的檢測探針以點(diǎn)陣形式分布在醛基基片上，每條探針重復(fù)3次；

5、點(diǎn)樣后的處理

將點(diǎn)完樣的芯片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內(nèi)，密閉后靜置于30℃烘箱過夜，得到用于檢測海參致病菌黃海希瓦氏菌的基因芯片。

實(shí)施例3

用于檢測海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病菌黃海希瓦氏菌基因芯片(實(shí)施例2制備的)的使用方法，具體步驟如下：

1、待測樣品采集及處理

將獲得的水樣用8μm無菌濾膜除去雜質(zhì)，之后用0.22μm的濾膜過濾并收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20℃下保存；

泥樣取自養(yǎng)殖環(huán)境底部2-5cm處底泥100g，采集樣品于冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；

動物樣品用無菌剪刀剪取，無菌水沖洗3次，裝入凍存管，放入液氮保存。

2、模板DNA制備

水樣和泥樣DNA分別用OMEGA水樣DNA提取試劑盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，動物樣品致病菌DNA用天根細(xì)菌基因組試劑盒提取。

3、引物和探針的設(shè)計(jì)

從黃海希瓦氏菌相應(yīng)基因序列以及部分相鄰菌種的上述基因的序列，進(jìn)行多基因序列比對，對每種致病菌引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，從而建立了由2條寡核苷酸探針和1對引物組成的檢測海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的常見致病菌黃海希瓦氏菌基因芯片。

表3強(qiáng)壯弧菌的靶基因的擴(kuò)增引物

所述的樣品PCR擴(kuò)增步驟中擴(kuò)增體系為：PCR Mix12.5μL；上游引物(20μmol/L)0.2μL；下游引物(20μmol/L)1μL；模板DNA 1μL；ddH₂O 10.3μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋孩?5℃5min；②95℃30s；③61℃30s；④72℃45s，返回到②35個循環(huán)；⑤72℃10min；⑥4℃保存。

4、PCR擴(kuò)增

(1)PCR反應(yīng)體系

將表4中所示試劑分別加入PCR管中，震蕩混勻，瞬時(shí)離心。

表4 PCR反應(yīng)體系

(2)PCR反應(yīng)條件

將以上提取的DNA作為PCR擴(kuò)增模板，分別以對應(yīng)的引物和PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行反應(yīng)，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測、觀察PCR擴(kuò)增效果。

表5 PCR反應(yīng)條件

5、熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物

(1)取各模板PCR合并后的產(chǎn)物8μL于無菌的0.2mL離心管中，作為模板；

(2)向每個樣品管中加入雜交緩沖液8μL和1μL陽控，震蕩混勻，瞬時(shí)離心；

(3)將離心后的樣品管放入PCR儀，99℃變性3min，立即冰浴3min，瞬時(shí)離心，然后，進(jìn)行下一步芯片雜交。

6、雜交

(1)芯片預(yù)雜交

①將預(yù)雜交緩沖液在50℃預(yù)熱；

②預(yù)雜交緩沖液與鮭精DNA按照體積比10:1的比例混合，置于PCR儀上99℃變性5min，立即冰浴3min，然后用移液器加到芯片的點(diǎn)樣區(qū)，用適當(dāng)大小的原位雜交專用蓋玻片覆蓋點(diǎn)樣區(qū)；

③將芯片放入濕盒，置于水浴鍋，65℃，1h；預(yù)雜交結(jié)束后，用ddH2O沖洗，后離心干燥。

(2)樣品與芯片雜交

①將芯片正面朝上，平放于桌面，將芯片圍欄貼于各點(diǎn)樣區(qū)之間，放上芯片蓋片(有凸臺的一面朝向芯片)，上端先接觸芯片，再緩緩蓋下；

②用移液器通過蓋玻片加樣孔緩慢注入16μL熒光標(biāo)記后的樣品，樣品會憑借液體表面張力在蓋玻片下面的凹臺和芯片表面之間形成一道液膜；(注意：不要震動蓋片或芯片，以免破壞液膜。)

③將芯片放入濕盒，置于水浴鍋，65℃，2h，避光；

④雜交完畢的芯片依次用洗液A(1×SSC，0.2％SDS)、洗液B(0.2×SSC)、洗液C(0.1×SSC)在振蕩培養(yǎng)箱中150r/min各洗15min。

7、掃描芯片

芯片洗滌完畢后，離心干燥，放于微陣列芯片掃描儀上檢測，電腦收集數(shù)據(jù)。

8、結(jié)果判定

一個有效的雜交結(jié)果要符合二點(diǎn)要求：(1)空白點(diǎn)的信號平均值，即背景平均值要小于10；(2)質(zhì)控點(diǎn)信號的平均值要高于背景平均值10倍以上。陽性雜交信號還要符合：(1)陽性點(diǎn)的信號平均值要高于背景平均值10倍以上；(2)陽性點(diǎn)與質(zhì)控點(diǎn)的平均值比值要在0.4以上。非特異性信號的判定標(biāo)準(zhǔn)為：(1)陽性點(diǎn)與質(zhì)控點(diǎn)的平均值比值要小于0.35；(2)非特異性點(diǎn)的信號平均值要小于8倍的背景平均信號值。

實(shí)施例4

將實(shí)施例2制備得到的用于檢測海參致病菌黃海希瓦氏菌的基因芯片的特異性效果驗(yàn)證將SM1、SM2探針以點(diǎn)陣形式分布在醛基基片上，每條探針重復(fù)3次，做成基因芯片。

將海參致病菌黃海希瓦氏菌實(shí)驗(yàn)菌株靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測合格后再進(jìn)行雜交顯色，用于基因芯片特異性驗(yàn)證。驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示。這2條探針都能特異性結(jié)合海參致病菌黃海希瓦氏菌的靶基因，無非特異性雜交信號。因此，所有自主設(shè)計(jì)的探針具有高度的特異性。

實(shí)施例5

將實(shí)施例2制備得到的用于檢測海參養(yǎng)殖區(qū)環(huán)境及生物體中重要的致病菌黃海希瓦氏菌的基因芯片的具體應(yīng)用效果檢測

采用模式菌株：黃海希瓦氏菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌；用SM1、SM2探針制作的基因芯片利用發(fā)明方法進(jìn)行檢測；

其中，黃海希瓦氏菌的檢測結(jié)果如圖3所示，在相應(yīng)SM1、SM2探針的點(diǎn)樣位置，有特異性信號；而以副溶血弧菌、溶藻弧菌、鰻弧菌、哈維氏弧菌、創(chuàng)傷弧菌、燦爛弧菌用本發(fā)明的探針進(jìn)行檢測，均沒有特異性信號，其檢測結(jié)果如圖4所示。

從海參養(yǎng)殖池的隨機(jī)選取海參樣品用無菌剪刀剪取，無菌水沖洗3次，然后用天根細(xì)菌基因組試劑盒提取海參致病菌DNA，用SM1、SM2探針制作的基因芯片利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，在基因芯片的相應(yīng)SM1、SM2探針點(diǎn)樣位置，具有特異性信號(其檢測結(jié)果與圖3相同)，該樣品海參致病菌黃海希瓦氏菌呈陽性。將本發(fā)明的基因芯片對海參致病菌黃海希瓦氏菌進(jìn)行靈敏度評價(jià)，將海參致病菌黃海希瓦氏菌進(jìn)行梯度稀釋，基因芯片檢測下限為650拷貝的基因組DNA，檢測靈敏度和PCR相當(dāng)。

從預(yù)養(yǎng)殖海參的養(yǎng)殖池內(nèi)將獲得的水樣用8μm無菌濾膜除去雜質(zhì)，之后用0.22μm的濾膜過濾并收集濾膜，用無菌鋁箔包裹，-20℃下保存；泥樣取自養(yǎng)殖環(huán)境底部2-5cm處底泥100g，采集樣品于冰盒中運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室；水樣和泥樣DNA分別用OMEGA水樣DNA提取試劑盒(OMEGA Water DNA Kit,D5525)和土壤DNA提取試劑盒(OMEGA Soil DNA Kit,D5625)提取，將水樣和泥樣中提取的DNA用SM1、SM2探針制作的基因芯片利用本發(fā)明方法進(jìn)行檢測，在基因芯片的相應(yīng)SM1、SM2探針點(diǎn)樣位置，具有特異性信號(其檢測結(jié)果與圖3相同)，該樣品養(yǎng)殖區(qū)海參致病菌黃海希瓦氏菌呈陽性。

以上僅為本發(fā)明的具體實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 大連海洋大學(xué)

<120> 一種海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測方法

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 1

cttctcggat gtcgagttcc acttcga 27

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 2

tctgaaaagc tacagttaac cattcgtcgt 30

<210> 3

<211> 18

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 3

tgcacgcggg tggtaagt 18

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<212> 人工序列

<400> 4

tgaggtaatc aacaaaggca c 21