1.一種海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測(cè)方法,其特征是:
具體步驟如下:
(1)基因芯片的制作
用于檢測(cè)的兩組探針SM1和SM2,探針序列如下:
SM1(5’-3’):CTTCTCGGATGTCGAGTTCCACTTCGA;
SM2(5’-3’):TCTGAAAAGCTACAGTTAACCATTCGTCGT;
將SM1和SM2在5’端加上15個(gè)T的間隔臂,并在探針5’端進(jìn)行氨基修飾;用雙蒸水將經(jīng)氨基修飾的探針稀釋成100μmol/L的母液,再用點(diǎn)樣緩沖液稀釋至濃度20μmol/L;使用點(diǎn)樣儀在醛基化基片上進(jìn)行非接觸式點(diǎn)樣,然后將點(diǎn)樣后的芯片放到盛有探針固定增效劑的可密閉的敞口容器內(nèi),密閉后靜置于30℃烘箱過夜,得到用于檢測(cè)海參致病菌黃海希瓦氏菌的基因芯片;
(2)待測(cè)樣品DNA提取
將環(huán)境中的水樣、泥樣或生物樣品進(jìn)行取樣,然后提取待測(cè)樣品的DAN,備用;
(3)樣品PCR擴(kuò)增
用于黃海希瓦氏菌(Shewanella marisflavi)引物是:
SM1和SM2探針使用的引物基因序列如下:
上游引物:TGCACGCGGGTGGTAAGT;
下游引物:TGAGGTAATCAACAAAGGCAC;
將步驟(2)提取的樣品的DNA作為擴(kuò)增模板,以探針對(duì)應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;
(4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與芯片雜交
將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熒光標(biāo)記,將基因芯片進(jìn)行預(yù)雜交,然后,將經(jīng)熒光標(biāo)記后的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與經(jīng)預(yù)雜交的基因芯片進(jìn)行雜交,離心干燥后,放于微陣列芯片掃描儀上檢測(cè),收集檢測(cè)結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測(cè)方法,其特征是:步驟(3)進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí),首先在95℃預(yù)變性5min;然后95℃變性30s,61℃退火30s,72℃延伸45s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測(cè)方法,其特征是:預(yù)雜交時(shí),使用鮭精DNA用預(yù)雜交緩沖液稀釋后進(jìn)行預(yù)雜交。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海參致病菌黃海希瓦氏菌的檢測(cè)方法,其特征是:預(yù)雜交緩沖液與鮭精DNA的體積比為10:1。