本發(fā)明屬于植物病原檢測領(lǐng)域，具體涉及一種松材線蟲SSR標(biāo)記引物用于松材線蟲檢測的用途及檢測松材線蟲的PCR檢測方法。

背景技術(shù)：

松材線蟲病是由松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)引起的松樹毀滅性病害^[1]。1934年首次被報(bào)道^[2]，1982年傳入中國^[3]，以其致病能力強(qiáng)、傳播途徑廣、蔓延速度快、防治難度大等特點(diǎn)^[4-6]，給世界林業(yè)帶來巨大損失。由于松材線蟲病在發(fā)病前期不易被發(fā)現(xiàn)和識別，并且傳染性極強(qiáng)，對松樹林區(qū)的破壞十分嚴(yán)重，因此盡管相關(guān)部門投入大量人力物力進(jìn)行治理，然而收效甚微，松材線蟲的危害仍在快速蔓延。2012年在距離黃山景區(qū)不足45公里的地方發(fā)現(xiàn)了疫情，松材線蟲病已嚴(yán)重威脅到黃山景區(qū)內(nèi)松林的生存。同時(shí)，各地病蟲害上報(bào)情況顯示，自松材線蟲病1982年傳入中國后，各大景區(qū)的松樹頻頻陷入危機(jī)。因此，目前迫切需要多途徑、多方式開展松材線蟲的快速檢測研究，以做好預(yù)防和檢疫工作。SSR(Simple Sequence Repeats)標(biāo)記[又名微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)]，是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)^[7]，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好、共顯性高、易檢測、操作簡單、無放射、所用時(shí)間較短、覆蓋面廣等優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面已得到廣泛應(yīng)用^[8](Morgante et al.，1993；Milee et al.，2008；羅冉等，2010)。同時(shí)，SSR標(biāo)記還具有物種?；?，是用于植物病原菌鑒定和檢測的理想標(biāo)記。2009年，Taisei等人^[9]發(fā)表了松材線蟲全基因組序列，更為松材線蟲SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了全新的資源。本發(fā)明通過對徐峻榮等人^[10]公布的可作為gSSR多態(tài)性標(biāo)記的九對引物進(jìn)行篩選，選出可對松材線蟲DNA樣本進(jìn)行標(biāo)記檢測的引物，以開發(fā)更加快速有效的松材線蟲分子檢測技術(shù)與方法。

參考文獻(xiàn)

[1]何龍喜，薛旗，吳小芹.松材線蟲體內(nèi)細(xì)菌對宿主繁殖和致病力的影響[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2016(03)

[2]Steiner G,Buhrer EM.Aphelenchoides xylophilus n.sp.a nematode associated with bluestain and other fungi in timber[J].J Agric Res,1934,48:949-951.

[3]Cheng H,Lin M,Li W,Fang Z.The occurrence of a pine wilting disease caused by a nematode found in Nanjing[J].For Pest and Dis,1983,4:1–5.

[4]Ye W,Giblin-Davis RM.Molecular Characterization and Development of Real-Time PCR Assay for Pine-Wood Nematode Bursaphelenchus xylophilus(Nematoda:Parasitaphelenchidae)[J].PLoS ONE,2011,8(11):e78804.doi:10.1371/journal.pone.0078804

[5]JUNG,J.,HAN,H.,RYU,S.H.&KIM,W.Microsatellite variation in the pinewood nematode,Bursaphelenchus xylophilus(Steiner and Bührer)Nickle in South Korea[J].Genes&Genomics,2010,32,147-154.

[6]Tóth.Chemical Research Center,Hungarian Academy of Sciences,Budapest,Hungary Bursaphelenchus xylophilus,the pinewood nematode:its significance and a historical review[J].Acta Biologica Szegediensis,2011,55(2):213-217

[7]羅冉，吳委林，張旸，等.SSR分子標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010,29(01)：137-143

[8]黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，劉攀峰，等.基于杜仲轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記的開發(fā)[J].林業(yè)科學(xué)，2013，49(5)：176-181

[9]Taisei K，James A C，Jonathan J D，et al.Genomic insights into the origin of parasitism in the emerging plant pathogen Bursaphe-lenchus xylophilus[J].PLo S Pathogens，2011，7(9):1－17.

[10]許峻榮,吳小芹,劉云,等.基于松材線蟲全基因組序列的SSR標(biāo)記開發(fā)[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2014,38(2):36-42

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的包括：

提供一種檢測、鑒定或鑒別松材線蟲的方法；

提供一種松材線蟲SSR標(biāo)記引物用于松材線蟲檢測的用途；

提供一種PCR方法，用于檢測、鑒定或鑒別松材線蟲，等。

具體的，本發(fā)明公開了一種松材線蟲SSR標(biāo)記引物用于松材線蟲檢測的用途，所述SSR標(biāo)記引物為：

上游引物:5’-TTATCGGGCTCAATCTCGG-3’

下游引物:5’-TAGTGACCCGGGGATCTTC-3’。

同時(shí)，本發(fā)明公開了一種檢測松材線蟲的PCR方法，包括以下步驟：

1)提取松材線蟲基因組DNA；

2)使用TaqDNA聚合酶對步驟1)所得DNA進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系組成為：Taq PCR Master Mix 12.5μL，上、下游引物各0.5μL，模板DNA量為50ng，ddH₂O補(bǔ)充至25μL；其中，所述上、下游引物為權(quán)利要求1所述的引物，上、下游引物量均為10μM；

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34個循環(huán)；72℃延伸5min；

3)對步驟2)所得擴(kuò)增產(chǎn)物做電泳檢測，通過電泳結(jié)果是否含有一條314bp的條帶，從而檢測、鑒定或鑒別是否含有松材線蟲。

優(yōu)選的，步驟3)所述電泳檢測為1.2％瓊脂糖凝膠電泳。

進(jìn)一步的，本發(fā)明所述檢測松材線蟲的PCR方法，還包括以下步驟4)：

4)將步驟3)所得314bp條帶回收純化，測序，通過判斷測序結(jié)果是否與序列表SEQ ID NO.1所示的SSR標(biāo)記基因序列相同，進(jìn)一步確認(rèn)松材線蟲的檢測、鑒定或鑒別結(jié)果。

此外，本發(fā)明還公開了一種用于檢測松材線蟲的試劑盒或檢測系統(tǒng)，包括權(quán)利要求1所述的引物；

優(yōu)選的，所述試劑盒或檢測體統(tǒng)還包括PCR擴(kuò)增試劑、電泳試劑和/或序列分析軟件。

所述Taq PCR Master Mix，購自上海萊楓生物技術(shù)有限公司，含0.1U·μL^-1 Taq DNA poly-mersase,0.4nM dNTPs,2×Taq Buffer。

步驟4)所述的條帶回收純化，指經(jīng)小量PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收，例如可采用購自上海萊楓生物技術(shù)有限公司的Sanprep柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒進(jìn)行回收純化，然后送樣外檢測序。

本發(fā)明所述STS標(biāo)記基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明選用不同的引物對來對松材線蟲基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，并通過凝膠電泳及DNA測序系統(tǒng)對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢驗(yàn)及鑒定。結(jié)果顯示，在表1所示的九對引物中，第九對引物顯示出了穩(wěn)定、特異的擴(kuò)增效果，其靈敏度可達(dá)0.3pg/ul。經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，最終確定的PCR檢測體系為：25μL總體積中包含TaqDNA聚合酶12.5μL，上、下游引物各0.5μL，模板DNA 0.5μL，雙蒸水11μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34個循環(huán)；72℃延伸5min。整個分子檢測鑒定過程約耗時(shí)2h，可以實(shí)現(xiàn)松材線蟲的快速檢測的目標(biāo)。

目前國內(nèi)大多數(shù)松材線蟲分子檢測方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且花費(fèi)較高，然而檢測結(jié)果的穩(wěn)定性以及檢測的靈敏度卻不盡如人意。隨著測序技術(shù)的發(fā)展和生物基因組計(jì)劃的實(shí)施，許多物種的全基因組測序工作均已開展，2009年松材線蟲全基因組序列的公開，為松材線蟲SSR標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用提供了全新的發(fā)展機(jī)遇。本研究是基于SSR標(biāo)記，篩選出特異性及靈敏度均較好的引物，建立用此標(biāo)記檢測松樹病株中松材線蟲的PCR方法，旨在為該致病原的檢疫檢驗(yàn)和病害診斷提供更好更穩(wěn)定的檢測手段，有望在一定程度上降低松材線蟲病對我國林業(yè)造成的巨大損失。

有益效果

本發(fā)明基于SSR標(biāo)記，篩選出對松樹病株中松材線蟲特異性及靈敏度均較好的引物，建立了檢測松樹病株中松材線蟲的PCR方法，可為松材線蟲的檢疫檢驗(yàn)和病害診斷提供更好更穩(wěn)定的檢測手段。對降低松材線蟲病對我國林業(yè)造成的巨大損失具有積極作用。

附圖說明

圖1：9對引物與松材線蟲SSR-PCR反應(yīng)結(jié)果

圖2：9號引物與不同地區(qū)松材線蟲SSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3：9號引物分別與松材線蟲①、擬松材線蟲擴(kuò)增結(jié)果

圖4：9號引物與不同濃度松材線蟲SSR-PCR反應(yīng)結(jié)果

具體實(shí)施方式

1材料與方法

1.1材料

供試線蟲a.人工純化培養(yǎng)的松材線蟲(以下用松材線蟲①表示)，b.從江油市、涼山州、漢源市、名山等10個不同地區(qū)枯死松樹體內(nèi)分離的松材線蟲(以下用松材線蟲②表示)，c.純化培養(yǎng)的擬松材線蟲，以上材料均由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院林木病理實(shí)驗(yàn)室提供。

Taq酶Taq酶為具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶，用于PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)，購自成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司。

引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成(見表1)。

表1 PCR引物序列及其擴(kuò)增程序

Table1 Primer sequence and amplification procedure about PCR

1.2松材線蟲的培養(yǎng)和收集

取保存的灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)接種于PDA培養(yǎng)基(1L PDA培養(yǎng)基成分：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂16g)上。25℃培養(yǎng)5d后，將松材線蟲①接種在灰葡萄孢菌上，25℃條件下令其生長繁殖，繼續(xù)培養(yǎng)15d。隨后將培養(yǎng)皿蓋上的線蟲收集至1.5mL離心管內(nèi)，使用滅菌水多次清洗，再將其移至離心管中，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3松材線蟲基因組DNA的提取

采用Biomiga公司(中國)線蟲基因組提取試劑盒提取松材線蟲DNA。具體操作為：取20μL松材線蟲混合液于1.5mL離心管中，加入350μL Buffer MTL和25ul Proteinase K，充分混勻后，50℃溫浴30min，直至樣品完全溶解。再加入350μL氯仿/異戊醇(24:1)渦旋混勻。10000xg離心2min，小心吸取上清液至一新的1.5mL離心管中。加入1倍體積Buffer MBL和5μL RNase A，最大速度渦旋15s以混勻，70℃溫浴10min。再加入1倍體積無水乙醇最大速度渦旋15s以混勻，吸取700μL混合液加入到吸附柱中，10000xg離心1min，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。向吸附柱中加入500μL Buffer KB，10000xg離心1min。棄收集管與廢液，將吸附柱放入一個新的收集管中，加入650μL DNA Wash Buffer，10000xg離心30s，倒掉廢液，將吸附柱重新插入收集管中。13000xg開蓋離心2min，徹底去除殘留乙醇。最后將DNA吸附柱插入1.5mL離心管，向吸附柱中加入75μL Elution Buffer(65℃預(yù)熱)，室溫靜置2min，13000xg離心1min洗脫DNA，-20℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4引物的篩選

利用已知的引物擴(kuò)增供試松材線蟲構(gòu)建基于SSR標(biāo)記的PCR反應(yīng)體系。PCR反應(yīng)體系為：25ul總體積中包含TaqDNA聚合酶12.5μL，上、下游引物各0.5μL，DNA模板0.5μL，雙蒸水11μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共34個循環(huán)；72℃延伸5min。

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物10μL于1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓為5V/cm，電泳時(shí)間為20min。置凝膠于302nm透射紫外燈上觀察。若點(diǎn)樣孔上方有單一擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，則證明該對引物可對松材線蟲進(jìn)行特異性擴(kuò)增；反之，點(diǎn)樣孔上方無擴(kuò)增條帶或多條帶雜亂，則該對引物對松材線蟲的擴(kuò)增不具有特異性。

2結(jié)果與分析

2.1引物特異性篩選結(jié)果

通過以上篩選過程，得到第1、2、3、4、5、6、7、8號引物(表1)擴(kuò)增結(jié)果為雜亂條帶，第9號引物(表1)可擴(kuò)增出特異性條帶(引物序號與泳道號一致)(見圖1)。

2.2引物特異性檢驗(yàn)

選取松材線蟲②進(jìn)行DNA的提取(參見上述步驟1.3)并分別與9號引物構(gòu)建SSR-PCR反應(yīng)體系，結(jié)果顯示9號引物對松材線蟲②的基因組DNA均擴(kuò)增出了一條大小為315bp的特異性條帶，(見圖2)。同時(shí)利用9號引物分別擴(kuò)增松材線蟲①與擬松材線蟲(對照組為松材線蟲①，1—6號泳道均為擬松材線蟲)，結(jié)果見圖3。

2.3引物的靈敏度檢驗(yàn)

將松材線蟲①的基因組DNA從3ng/μL進(jìn)行梯度稀釋得到7個處理，其濃度分別為30、3、3x10^-1、3x10^-2、3x10^-3、3x10^-4、3x10^-5ng/μL(依次對應(yīng)泳道1—7)，采用設(shè)定好的擴(kuò)增體系及程序分別擴(kuò)增和檢驗(yàn)，最終確定其最低檢測閾值約為0.3pg/μL(見圖4)。

序列表

<110> 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 松材線蟲SSR標(biāo)記引物用于松材線蟲檢測的用途及松材線蟲的PCR檢測方法

<130> 2017

<160> 19

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1

<212> DNA

<213> 松材線蟲 （Bursaphelenchus xylophilus）

<400> 1

tgggagactg gccggatcga gccggaaggg ggcgtaagaa tgagaaacaa ggccaataca 60

aacgggctgg gaaacgggca ttcgaggacc ggaccggcgc aaaatccatt ttgtgtcttc 120

cacatgtgtg aaagctactg ctccaagtgc ccacgacgtc gccagccaat ccagccgccc 180

cacaagagag agagagagag agagagagag agggtgagac aaaaagtgtc aatacaggta 240

agtcatttta tataatttca atttgtaagt ctttttgtat aatttctatt tgaagatccc 300

cggggtcaca aaaa 314

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04399 F

<400> 2

cacctgctgt cagtacac 18

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04399 R

<400> 3

cagcgagcga tgacaagtca 20

<210> 4

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04738 F

<400> 4

tacaatgtgc cgcaggatg 19

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04738 R

<400> 5

cgacatctca ccggtcaacg 20

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR07780 F

<400> 6

atgtcggtgt cacggaaac 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR07780 R

<400> 7

ttgtagtccg cgtcggagt 19

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04959 F

<400> 8

tttagcgtag tccccagagg tg 22

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR04959 R

<400> 9

ccgatgttct ttggctgtgc 20

<210> 10

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08060 F

<400> 10

aacaacgccg attggtgt 18

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08060 R

<400> 11

gccattcatt tccagggag 19

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08026 F

<400> 12

agctgagcag tacttggtag g 21

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08026 R

<400> 13

gcagtctggt tgcaaagggt gt 22

<210> 14

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08605 F

<400> 14

ctatcatgcc tagcgtttct attc 24

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08605 R

<400> 15

caccagctcc aaccacaa 18

<210> 16

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR09083 F

<400> 16

ttcccttgtc cgattgaagt ttcc 24

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR09083 R

<400> 17

tgcttgctag ccatgatttt attg 24

<210> 18

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR09215 F

<400> 18

ttatcgggct caatctcgg 19

<210> 19

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> NSSR08605 R

<400> 19

tagtgacccg gggatcttc 19