本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR) 是位于人類7號染色體短臂上原癌基因C-erbB-1（HER-1）的表達(dá)產(chǎn)物，是表皮生長因子受體家族（HER）中的4個成員之一，由188307個堿基組成，包括28個外顯子，其酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18-24編碼。EGFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常時會導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生，如結(jié)直腸癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌和非小細(xì)胞肺癌等。

EGFR基因編碼區(qū)的突變主要發(fā)生在外顯子18～21上。已經(jīng)報道的EGFR基因突變類型大約有60種，其中29種突變最為常見，包括19種19（外顯子編號） Del、3種20 Ins及21 L858R、21 L861Q、20 T790M、20 S768I、18 G719A、18 G719S和18 G719C，它們約占EGFR基因突變類型的99%，其中21 L858R和21 L861Q約占40%～60%，19 Del約占45%，18 G719X約占5%， 20 Ins約占1%，耐藥性位點20 T790M約占5%。

對于EGFR基因突變引起的肺癌，目前最常規(guī)的藥物治療是采用酪氨酸激酶抑制劑（TKI），主要代表為吉非替尼（Gefitinib）和厄洛替尼（Erlotinib）兩種藥物，但是EGFR的L858R突變會改變細(xì)胞對TKI制劑的敏感性，也就是含L858R突變的腫瘤細(xì)胞會對TKI制劑產(chǎn)生抗性。為使患者盡可能地從最有效的治療中受益，只要條件許可，所有EGFR基因引起的非小細(xì)胞肺癌患者和含腺癌成分的其他類型肺癌患者都應(yīng)當(dāng)嘗試進(jìn)行L858R突變檢測。

北京協(xié)和醫(yī)院一項研究發(fā)現(xiàn)，在對100個EGFR引起的非小細(xì)胞肺癌樣品的基因檢測中， L858R突變占43.9%。然而在臨床應(yīng)用中，約10%～15%的晚期非小細(xì)胞肺癌患者由于腫瘤組織不足或無法獲取腫瘤組織而未進(jìn)行分子檢測。一些前瞻性研究表明，與腫瘤組織相比，血液循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）中EGFR突變檢測同樣具有較高的特異性，但是敏感度有待提高。基于此，我們開發(fā)了一種新的L858R突變液體活檢試劑盒，檢測下限可以達(dá)到0.4拷貝/μl，該試劑盒可在EGFR-TKIs治療過程中連續(xù)、定量監(jiān)測L858R ctDNA，利于患者盡可能從EGFR-TKI的治療中受益。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的：提供一種EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒，靈敏度極高，對照陽性質(zhì)粒的檢測下限可以達(dá)到0.4拷貝/μl；利用試劑盒的富集擴(kuò)增與定量方法可以估計血液樣本中突變型基因占野生型基因拷貝數(shù)的比值；此外，試劑盒檢測方法只涉及到染料法qPCR，不涉及探針的合成與修飾，檢測費用低，有利于節(jié)省廣大患者的基因檢測費用。

本發(fā)明提供的EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒的引物包括：

包含EGFR基因上游引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示；

EGFR突變型基因下游富集引物（野生型阻滯引物）：核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示；

EGFR野生型基因下游富集引物（突變型阻滯引物）：核苷酸序列如SEQ ID NO.3 所示。

優(yōu)選的技術(shù)方案是：上述EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒的富集引物末端核苷酸經(jīng)過調(diào)整，其中3’端第二位堿基與EGFR序列沒有互補(bǔ)。EGFR基因上游引物和EGFR突變型基因下游富集引物可以特異擴(kuò)增含L858R突變的58 bp的核酸片段，由于下游引物3’端連續(xù)兩個堿基都與野生型模板不匹配，野生型EGFR不能夠產(chǎn)生熒光信號。同樣EGFR基因上游引物和EGFR野生型基因下游富集引物可以特異擴(kuò)增野生型EGFR 58 bp的核酸片段，但是L858R突變型模板不能夠產(chǎn)生熒光信號。

上述試劑盒中還包括EGFR基因L858R突變型和野生型的基因組片段陽性對照質(zhì)粒。

本發(fā)明提供了一種EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒的使用方法，其特征在于，具體步驟包括：

步驟1：針對突變位點設(shè)計合成目的基因上游引物，突變型基因下游富集引物（野生型阻滯引物），野生型基因下游富集引物（突變型阻滯引物）；

步驟2：樣本處理與DNA的提??；

步驟3：qPCR擴(kuò)增方法與定量。

在所述的步驟1中，EGFR的突變點為rs121434568（NCBI SNP數(shù)據(jù)庫），兩側(cè)序列為：CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG，其中野生型為T，突變型為G，突變后氨基酸L [Leu] 轉(zhuǎn)變?yōu)镽 [Arg]，形成錯意突變。以該突變位置附近前后250bp為模板序列，設(shè)計上游引物，突變型基因下游富集引物和野生型基因下游富集引物。

在所述的步驟2中，取1 ml全血，2000 rpm離心 10 min，將上清移至新的離心管中；重復(fù)離心，將剩余上清轉(zhuǎn)入離心管后，加入介孔納米磁珠 50 μl；用NaCl調(diào)節(jié) Na⁺ 濃度至0. 4 mol / L，漩渦震蕩1 min；室溫吸附 10 min ；將離心管輕微漩渦震蕩5 sec，立即置于磁力吸附架上，靜置 5 sec，吸棄液體；用洗滌液 300 μl（0. 4 mol / L NaCl）重復(fù)上述步驟2次；開蓋干燥 10 min，加入去離子水 100 μl，漩渦震蕩混勻，65℃ 水浴 10 min；將離心管漩渦震蕩10 sec，立即置于磁力吸附架上，靜置 5 sec，吸取液體備用。

在所述的步驟3中，qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：

反應(yīng)1：1μl EGFR基因上游引物（濃度5-10 μM ），1μl EGFR突變型基因下游富集引物（濃度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 2-5 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)2：1μl EGFR基因上游引物（濃度5-10 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（濃度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 2-5 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。

qPCR 程序設(shè)置為：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec, 35-50 cycles; 72℃ 1min; 4℃ ∞。

在所述的步驟3中的定量計算方法，相對值RQ=(1+Ex)^-ΔCt, 其中ΔCt=Ct_mut.- Ct_wt, 在本試劑盒中，擴(kuò)增效率Ex=97%，Ct_mut為PCR反應(yīng)1的Ct值，Ct_wt為PCR反應(yīng)2的Ct值。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點與效果：本發(fā)明的下游富集引物可以特異的擴(kuò)增含單個堿基不同的目的基因；富集引物在富集擴(kuò)增中可以阻滯非目的基因的擴(kuò)增；在測定突變型的Ct值與野生型的Ct值后，可以快速判斷突變型基因占野生型基因拷貝數(shù)的比值；由于不涉及到探針的使用，試劑盒操作簡單，檢測價廉，可以大規(guī)模推廣；試劑盒檢測速度快，檢測過程只需要2.5小時完成。

附圖說明

圖1是本發(fā)明EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒的引物設(shè)計策略。其中F-primer指EGFR基因上游引物，M-primer指EGFR突變型基因下游富集引物（野生型阻滯引物），W-primer指EGFR野生型基因下游富集引物（突變型阻滯引物），N表示堿基。

圖2是本試劑盒對L858R突變型和野生型質(zhì)粒的qPCR檢測圖。

圖3是本試劑盒對L858R突變型和野生型質(zhì)粒的qPCR產(chǎn)物的熔點分析圖。

圖4是本試劑盒對L858R突變型質(zhì)粒的qPCR靈敏度檢測，其中1×10¹，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵表示25 μl PCR體系中的質(zhì)?？截悢?shù)。

圖5是本試劑盒對L858R野生型質(zhì)粒的qPCR靈敏度檢測，其中1×10¹，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵表示25 μl PCR體系中的質(zhì)?？截悢?shù)。

圖6是本試劑盒對L858R突變型質(zhì)粒不同梯度濃度qPCR后，用Ct值與不同梯度拷貝數(shù)的對數(shù)值擬合計算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖7是本試劑盒對L858R野生型質(zhì)粒不同梯度濃度qPCR后，用Ct值與不同梯度拷貝數(shù)的對數(shù)值擬合計算的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖8是本試劑盒對臨床樣本循環(huán)腫瘤DNA EGFR基因L858R突變型定量檢測的結(jié)果。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實施例是用于說明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體應(yīng)用要求的條件做進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。

主要材料和儀器：ABI7500熒光定量PCR儀；熱啟動taq酶（Taq hot Start version，Takala公司）；Oligo 7 引物分析軟件；介孔納米磁珠（珠海喬治生物技術(shù)有限公司），磁力架。

實施例1用于EGFR基因 L858R突變檢測的引物設(shè)計及其特異性和敏感性驗證。

1、查詢目的基因序列：EGFR的 L858R 突變型在NCBI SNP數(shù)據(jù)庫中的識別號為：rs121434568（CATGTCAAGATCACAGATTTTGGGC[G/T]GGCCAAACTGCTGGGTGCGGAAGAG），其中野生型為T，突變型為G，突變后氨基酸L [Leu] 轉(zhuǎn)變?yōu)镽 [Arg]，形成錯意突變。

2、設(shè)計qPCR引物：參考圖1的qPCR設(shè)計原理，用oligo7分子軟件設(shè)計上游引物TGAAAACACCGCAGCATGTCA；下游L858R突變型富集擴(kuò)增引物：GCACCCAGCAGTTTGGCTC；下游L858R野生型富集擴(kuò)增引物：GCACCCAGCAGTTTGGCGA。由于下游引物3’端第二個堿基與模板非互補(bǔ)關(guān)系，只有3’端第一個堿基與模板互補(bǔ)的引物才能產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。

3、PCR 擴(kuò)增體系為2種，反應(yīng)1：1μl EGFR基因上游引物（濃度5-10 μM ），1μl EGFR突變型基因下游富集引物（濃度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 2-5 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)2：1μl EGFR基因上游引物（濃度5-10 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（濃度5-10 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 2-5 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。

4、qPCR 程序設(shè)置為：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec, 35-50 cycles; 72℃ 1min; 4℃∞。約2×10³拷貝數(shù)的L858R突變型與L858R野生型質(zhì)粒1∶1混合后作為模板。qPCR檢測結(jié)果見圖2。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體后，測序驗證，驗證結(jié)果與qPCR設(shè)計一致。

5、熔解曲線分析：經(jīng)過 95℃預(yù)變性15 sec，升溫速率為0.5℃/步，在65℃到95℃溫度范圍內(nèi)采集SYBR熒光。實驗結(jié)果見圖3，兩種反應(yīng)體系的溶解曲線均呈現(xiàn)單峰，且出鋒位置與退火溫度一致，表明實驗結(jié)果特異且有效。

6、擴(kuò)增效率估計：末端經(jīng)過改造的引物在PCR過程中，其擴(kuò)增效率Ex會發(fā)生改變。用L858R突變型與L858R野生型陽性質(zhì)粒稀釋不同濃度（1×10¹，1×10²，1×10³，1×10⁴，1×10⁵）做qPCR后（圖4，圖5），發(fā)現(xiàn)能夠檢測到的最低質(zhì)粒拷貝數(shù)的質(zhì)粒量為0.4拷貝/ μl，用Ct值與各個梯度拷貝數(shù)的對數(shù)值擬合作圖得出的標(biāo)準(zhǔn)曲線（如圖6，圖7），其中L858R突變型回歸方程為y = -3.069x + 32.033，R2= 0.9986， L858R野生型

y = -3.403x + 32.985，R2= 0.9994，因此估計擴(kuò)增效率E=10^-1/斜率，Ex=（E-1）×100%，其中L858R突變型E值為2.11，而L858R野生型的E值為：1.97。考慮到質(zhì)粒與實際標(biāo)本擴(kuò)增效率并不一致，因此估計本試劑盒的擴(kuò)增效率Ex為97%。

實施例2用于EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒對臨床樣本的檢測。

1、提取DNA：取1 ml全血，2000 rpm離心 10 min，將上清移至新的離心管中；重復(fù)離心，將剩余上清轉(zhuǎn)入離心管后，加入介孔納米磁珠 50 μl；用NaCl調(diào)節(jié) Na⁺ 濃度至0. 4 mol / L，漩渦震蕩1 min；室溫吸附 10 min ；將離心管輕微漩渦震蕩5 sec，立即置于磁力吸附架上，靜置 5 sec，吸棄液體；用洗滌液 300 μl（0. 4 mol / L NaCl）重復(fù)上述步驟2次；開蓋干燥 10 min，加入去離子水 100 μl，漩渦震蕩混勻，65℃ 水浴 10 min；將離心管漩渦震蕩10 sec，立即置于磁力吸附架上，靜置 5 sec，吸取液體-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2、PCR 擴(kuò)增體系為2種，反應(yīng)1：1μl EGFR基因上游引物（濃度5 μM ），1μl EGFR突變型基因下游富集引物（濃度5 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 3 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。反應(yīng)2：1μl EGFR基因上游引物（濃度5 μM ），1μl EGFR野生型基因下游富集引物（濃度5 μM ）；12.5μl 2× SYBR Green (含熱啟動Taq酶 1U)； dNTP 0.5 mM；MgCl₂ 3 mM，模板DNA 5 μl，總反應(yīng)體系25 μl。

3、qPCR 程序設(shè)置為：94℃ 2 min; 94℃ 50 sec，62℃ 30 sec, 72℃ 10 sec, 50 cycles; 72℃ 1min; 4℃ ∞。約2×10³拷貝數(shù)的L858R突變型與L858R野生型質(zhì)粒1∶1混合后作為模板。qPCR檢測結(jié)果見圖2。qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體后，測序驗證，驗證結(jié)果與qPCR設(shè)計一致。

4、L858R突變型相對定量：對血液樣本的DNA做qPCR結(jié)果如圖8，突變型對野生型基因的相對值RQ=(1+Ex)^-ΔCt, 其中ΔCt=Ct_mut.- Ct_wt, 在本試劑盒中擴(kuò)增效率Ex=97%，其中Ct_mut為PCR反應(yīng)1的Ct值，Ct_wt為PCR反應(yīng)2的Ct值。在測試臨床樣本時，L858R野生型Ct值為23.8，L858R突變型Ct值為32.1，根據(jù)簡要計算公式，突變型占野生型的比值為0.360%。

5、熔解曲線分析判斷擴(kuò)增特異性：經(jīng)過 95℃預(yù)變性15 sec，升溫速率為0.5℃/步，在65℃到95℃溫度范圍內(nèi)采集SYBR熒光（參考圖3）。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法與其核心思想，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 陳超 孫青 唐玉玲 孫塬 覃曉云 宋燕燕 李志鵬

<120> 一種EGFR/L858R突變液體活檢試劑盒及其應(yīng)用

<130> 3

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgaaaacacc gcagcatgtc a 21

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcacccagca gtttggctc 19

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcacccagca gtttggcga 19