本發(fā)明涉及高通量測序領域，具體涉及一種外周血游離DNA深度測序結果的生物信息學分析方法。

背景技術：

ctDNA含量非常少，以10ml外周血為例，從中可以提取到cfDNA含量約30ng，占總DNA的1％，ctDNA在所有cfDNA中的比例非常少，按1％計算,只有約300pg，也就是大約45個細胞裂解的DNA量，實際情況下，如果是做早期篩查，ctDNA的含量可能更低到10ml外周血中只有1～2個細胞的，所以對檢測方法的敏感性要求非常高。

目前用于液體活檢中目標基因檢測的方法主要分為四類：一代測序(Sanger)，二代高通量測序(NGS)，數字液滴PCR(ddPCR)，和ARMS(又稱等位基因特異性PCR)。對于腫瘤基因的篩查來說，NGS檢測在同類中的性價比遠高過其他幾種方法。

NGS方法會涉及到PCR擴增和測序，這兩個過程都會出現一些系統錯誤，如illumina Hiseq平臺的測序錯誤率在0.05％，在普通大量樣本模板檢測中問題并不大，但是，在腫瘤早期篩查中，由于本身模板類就是在萬分之一到千分之一的范圍之內，這些測序錯誤跟我們的檢測下線在一個數量級，就會對結果造成非常嚴重的干擾，其次，由于PCR引入的錯誤也無法進行有效識別。

中國專利申請(申請?zhí)朇N201510225771.5)公開了一種孕婦外周血中胎兒游離DNA比例的定量方法，該方法利用設計的引物將血漿中包含設計SNP的DNA提取出來，經過一系列處理后上機，將測序產物比對到人類基因組序列后確定每個SNP位點的堿基。通過分析SNP中各堿基的比例來定量胎兒游離DNA濃度。本發(fā)明還可通過多個SNP來校正引入的誤差，用統計學的方法對多個SNP同時計算，提高計算出的胎兒游離DNA濃度準確性。

然而，純粹通過改進單一的生物信息分析方法來提高測序準確度，只涉及檢測數據后期處理，并不能在源頭消除或有效降低PCR擴增和測序時引入的系統誤差。

所以目前急需要開發(fā)一種新的方法，用于鑒別真正的基因突變和這些系統錯誤。

技術實現要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種外周血游離DNA深度測序結果的生物信息學分析方法。

第一方面，本發(fā)明提供了一種外周血游離DNA深度測序結果的生物信息學分析方法，包括如下步驟：

1)設計引物標簽；

2)給每個DNA分子接上引物標簽；

3)進行PCR擴增、高通量測序；

4)通過生物信息學分析獲得外周血游離DNA深度測序結果。

本發(fā)明所述的深度測序法，可做本領域技術人員常規(guī)理解，比如與高通量測序技術、NGS等概念在多數情況下可互換。

本發(fā)明所述的深度測序法采用的測序設備包括但不限于Roche/454、Illumina測序儀(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后續(xù)測序儀系列)、BGI(華大公司，BGI500系列以及后續(xù)測序儀)的測序儀、LifeTech測序儀器(Ion，Proton以及后續(xù)測序儀器系列)、PacBio測序儀器(RSII，Sequel以及后續(xù)測序儀器)或基于Nanopore的測序儀器(Genia，Nanopore以及類似的第三代測序儀)。

第二方面，本發(fā)明提供了一種引物標簽結合深度測序法從外周血游離DNA擴增癌癥基因的標簽設計方法，包括如下步驟：

1)設計引物標簽；

2)給模板中的每個DNA分子都接上引物標簽；

3)針對目標癌癥基因設計PCR引物或PCR引物組；

4)進行PCR擴增和測序，篩選出合格的引物標簽。

本發(fā)明提供的從外周血游離DNA中擴增癌癥基因的分子標簽設計的基本原則：通過給每個起始樣品模板兩邊加標簽的方式，給模板中的每個DNA分子都貼上分子標簽，在經過PCR和測序以后，可以通過分子標簽將樣本中原始的DNA分子都鑒別分類。由于經過PCR擴增以后的分子都跟原始模板攜帶同樣的分子標簽，所以理論上來說，來源于同一個分子標簽的某類DNA分子應該攜帶相同的序列，如果后期中間的產物在PCR過程中發(fā)生的突變，就可以通過標簽去除這些突變序列，避免他們干擾最后的測序結果。同樣的，測序錯誤也可以通過這個方法進行鑒別。

第三方面，本發(fā)明提供了一種用于深度測序法從外周血游離DNA擴增癌癥基因的引物標簽。

第四方面，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的引物組、如第二方面提供的引物標簽設計方法、或如第三方面提供了的引物標簽在從外周血游離DNA擴增癌癥基因中的應用、或在高通量測序中的應用。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例提供的一種外周血游離DNA深度測序結果的生物信息學分析方法流程示意圖。

具體實施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也視為本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明實施例中若無特別說明，所用試劑及耗材均為市售商品。

本發(fā)明實施例中若特別說明，測序文庫構建參照羅氏、illumina或ABI的高通量測序文庫構建說明書。

在本發(fā)明第一實施例中，結合圖1，本發(fā)明提供了一種外周血游離DNA深度測序結果的生物信息學分析方法，包括如下步驟：

1)設計引物標簽；

2)給模板中的每個DNA分子都接上引物標簽；

3)針對目標癌癥基因設計PCR引物或PCR引物組；

4)進行PCR擴增、高通量測序；

5)通過生物信息學分析獲得外周血游離DNA深度測序結果。

本發(fā)明所述的深度測序法采用的測序設備包括但不限于Roche/454、Illumina測序儀(NextSeq系列，Hiseq系列，MiSeq系列，XTen，以及后續(xù)測序儀系列)、BGI(華大公司，BGI500系列以及后續(xù)測序儀)的測序儀、LifeTech測序儀器(Ion，Proton以及后續(xù)測序儀器系列)、PacBio測序儀器(RSII，Sequel以及后續(xù)測序儀器)或基于Nanopore的測序儀器(Genia，Nanopore以及類似的第三代測序儀)。

在本發(fā)明第二實施例中，本發(fā)明提供了一種引物標簽結合深度測序法從外周血游離DNA擴增癌癥基因的標簽設計方法，包括如下步驟：

1)設計引物標簽；

2)給模板中的每個DNA分子都接上引物標簽；

3)針對目標癌癥基因設計PCR引物或PCR引物組；

4)進行PCR擴增和測序，篩選出合格的引物標簽。

本發(fā)明提供的從外周血游離DNA中擴增癌癥基因的分子標簽設計的基本原則：通過給每個起始樣品模板兩邊加標簽的方式，給模板中的每個DNA分子都貼上分子標簽，在經過PCR和測序以后，可以通過分子標簽將樣本中原始的DNA分子都鑒別分類。由于經過PCR擴增以后的分子都跟原始模板攜帶同樣的分子標簽，所以理論上來說，來源于同一個分子標簽的某類DNA分子應該攜帶相同的序列，如果后期中間的產物在PCR過程中發(fā)生的突變，就可以通過標簽去除這些突變序列，避免他們干擾最后的測序結果。同樣的，測序錯誤也可以通過這個方法進行鑒別。

在本發(fā)明第三實施例中，本發(fā)明提供了一種用于深度測序法從外周血游離DNA擴增癌癥基因的引物標簽。

在本發(fā)明第四實施例中，本發(fā)明提供了一種如第一方面提供的引物組、如第二方面提供的引物標簽設計方法、或如第三方面提供了的引物標簽在從外周血游離DNA擴增癌癥基因中的應用、或在高通量測序中的應用。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。