本發(fā)明涉及動(dòng)物病原分子診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒及其用途。

背景技術(shù)：

豬輪狀病毒(Porcine rotavirus，PoRV))屬于呼長孤病毒科輪狀病毒屬，是一種嚴(yán)重的接觸性腸道傳染病病原，導(dǎo)致仔豬出現(xiàn)嘔吐、腹瀉、脫水和消痩等臨床癥狀，也能夠致使仔豬死亡，特別是對7日齡左右的仔豬造成的危害最為嚴(yán)重。該病主要暴發(fā)于寒冷時(shí)期的冬季以及早春時(shí)節(jié)，且傳播迅速，給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。病毒在豬體內(nèi)的潛伏期較短、傳播迅速，幾天之內(nèi)就可以感染整個(gè)豬群。仔豬感染PoRV會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的病癥，嘔吐，呈嚴(yán)重的黃色、綠色或白色滴水樣腹瀉，患病豬只脫水嚴(yán)重，眼球凹陷，體重降低。7日齡以內(nèi)的仔豬一般在發(fā)病后3-5天內(nèi)會(huì)死亡。母豬感染仔豬主要是通過糞便傳播，除此以外，母豬分泌的乳汁中也含有病毒。在保育豬、育肥豬和母豬中感染PoRV后出現(xiàn)的癥狀一般比較輕，大部分可以耐過，自行康復(fù)，出現(xiàn)死亡的比較少。根據(jù)臨床癥狀和病理變化可以對PoRV感染做出初步診斷，要做出最終確診以防控PoRV還需要利用實(shí)驗(yàn)室手段。

目前，實(shí)驗(yàn)室檢測豬輪狀病毒的主要方法有：(1)電子顯微鏡觀察法：電子顯微鏡可以直接觀察到輪狀病毒粒子，病毒為直徑60-80μm像車輪狀的粒子，所需的糞樣中必須要含有大量的輪狀病毒才容易在電鏡視野中觀察到病毒粒子。此方法快速簡單，但是電鏡設(shè)備昂貴，不能在基層普及。(2)RNA聚丙烯胺凝膠電泳法：輪狀病毒的基因組是由11個(gè)分節(jié)段的雙鏈RNA組成，提取病毒RNA，直接進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，會(huì)出現(xiàn)11個(gè)特定的電泳條帶，可以根據(jù)條帶的電泳型對輪狀病毒確診并對其分群。此方法容易被RNA酶污染影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(3)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)：ELISA既可以直接檢測病原也可以通過檢測抗體推斷抗原。該方法靈敏度高、特異性好，同時(shí)也能夠滿足臨床上大批量樣品檢測的要求，正是以上優(yōu)點(diǎn)，WHO將ELISA檢測方法作為檢測輪狀病毒的標(biāo)準(zhǔn)方法。(4)免疫熒光技術(shù)：免疫熒光技術(shù)就是釆集腹瀉仔豬的腸道內(nèi)容物進(jìn)行涂片，然后用冰丙酮溶液進(jìn)行固定處理，與熒光素標(biāo)記的輪狀病毒抗體反應(yīng)，熒光顯微鏡鏡檢觀察到陽性熒光信號(hào)即可判定。(5)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)：以輪狀病毒VP7或VP4核苷酸序列中的保守序列為模板設(shè)計(jì)引物，利用不同的特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增出不同長度的DNA片段。同時(shí)，可根據(jù)VP4和VP7基因中的高變區(qū)設(shè)計(jì)型特異性引物，以進(jìn)行輪狀病毒的特定血清型別鑒定。

但是現(xiàn)有的檢測方法存在以下不足：①檢測時(shí)間較長?；诓《玖Ｗ拥臋z測方法，如病毒分離培養(yǎng)、電鏡觀察等技術(shù)需要進(jìn)行前期準(zhǔn)備、細(xì)胞培養(yǎng)、病毒分離純化、制樣等，需要長時(shí)間乃至數(shù)月之久才能獲得最終結(jié)果，難于做到快速診斷；基于普通PCR的檢測方法，需要提取核酸、PCR試劑配置、PCR反應(yīng)、電泳、凝集成像、分析結(jié)果等，做一次病原檢測需要近一天時(shí)間。②操作復(fù)雜，技術(shù)要求高。操作過程相對繁瑣，且對操作人員技能要求較高，一般需要專業(yè)專職人員負(fù)責(zé)。③結(jié)果相對不可靠。免疫熒光與ELISA技術(shù)依賴抗體抗原反應(yīng)，可能出現(xiàn)不可避免的交叉反應(yīng)。在檢測方法中檢測步驟越多，過程越繁瑣，出現(xiàn)差錯(cuò)的幾率增加，且環(huán)境中存在的交叉污染造成結(jié)果的不準(zhǔn)確。同時(shí)很多技術(shù)主要針對實(shí)驗(yàn)室檢測，臨床應(yīng)用較少，缺少相應(yīng)的質(zhì)量控制及標(biāo)準(zhǔn)化。④需要復(fù)雜的儀器設(shè)備。為保證檢測結(jié)果可被觀察，現(xiàn)有技術(shù)每個(gè)步驟均得依賴于儀器設(shè)備，某些儀器設(shè)備如電鏡等，過于龐大和貴重，一般檢測機(jī)構(gòu)難于承受，難于在基層推廣。⑤檢測成本高。繁瑣又長時(shí)間的檢測及設(shè)備的維護(hù)，一方面需要投入人力、物力較多，另一方面結(jié)果的不確定亦造成檢測的重復(fù)，成倍的增加成本。

現(xiàn)階段實(shí)驗(yàn)室對PoRV的檢測主要是通過常規(guī)RT-PCR方法，但是此方法靈敏度較低，一般只能檢測發(fā)病嚴(yán)重豬只攜帶的病原，對于PoRV感染早期的豬只，需要使用靈敏度更高的檢測方法，以期在感染的潛伏期就能進(jìn)行診斷，并采取有效的防控措施來減少損失。目前在實(shí)際情況中檢測多是在規(guī)?；i場出現(xiàn)疑似仔豬腹瀉的疫情后，送檢患病仔豬的排泄物和病死豬病料，利用常規(guī)RT-PCR方法進(jìn)行檢測，根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場其他情況給出診斷報(bào)告并制定疫病防控計(jì)劃。一方面由于這種“事后”檢測導(dǎo)致診斷結(jié)果對豬場疫病防控的指導(dǎo)意義有一定的局限性，無法做到未雨綢繆。另一方面，常規(guī)PCR方法操作時(shí)間較長，操作過程中容易發(fā)生污染。

實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR該方法建立在常規(guī)RT-PCR方法之上，敏感度更高、特異性更強(qiáng)、重復(fù)性良好，通過可視化設(shè)備監(jiān)測擴(kuò)增反應(yīng)，無需電泳，省時(shí)省力、快速準(zhǔn)確。對于初期感染輪狀病毒且感染豬群體內(nèi)的病毒含量較低時(shí)，此種方法能做出準(zhǔn)確判斷，對于防治和治療輪狀病毒的爆發(fā)可以發(fā)揮重要的作用。

豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個(gè)體。PoRV一般經(jīng)母豬糞便或乳汁污染傳播至仔豬，亦可能隨同某些病毒的混合感染進(jìn)行臍帶血垂直傳播，因此首創(chuàng)采用從仔豬臍帶血中檢測PoRV來評價(jià)及預(yù)警仔豬腹瀉疾病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、重復(fù)性優(yōu)、檢測結(jié)果快速客觀準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能同時(shí)反映母、仔豬PoRV帶毒狀況，評估母豬疫苗的免疫效果，有益于對豬群PoRV感染和免疫情況的早期預(yù)警評判，進(jìn)一步有助于豬場做好該疾病的防控工作。

基于上述目的，本發(fā)明提供了一種檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒，包括擴(kuò)增引物和特異性熒光探針，所述擴(kuò)增引物和特異性熒光探針的序列如下所示：

上游擴(kuò)增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴(kuò)增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

特異性熒光探針RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，其中Y＝T/C，F(xiàn)AM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為非熒光淬滅基團(tuán)。

合理的引物和熒光探針設(shè)計(jì)是成功應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)的關(guān)鍵。引物和探針的特異性對反應(yīng)有很大影響，如果引物和探針特異性不高，可能在擴(kuò)增構(gòu)成中產(chǎn)生非靶標(biāo)條帶，影響檢測結(jié)果的判定。

輪狀病毒的基因組由11個(gè)不連續(xù)的雙股RNA節(jié)段組成，編碼6種結(jié)構(gòu)蛋白：vp1、vp2、vp3、vp4、vp6和vp7。本發(fā)明根據(jù)GenBank中公布的PoRV病毒流行毒株基因序列進(jìn)行對比分析，篩選出PoRV基因組中外層衣殼蛋白vp7基因的一段基因片段，該基因片段在豬輪狀病毒中高度保守，大小為73bp，作為本發(fā)明設(shè)計(jì)引物的靶片段。vp7是輪狀病毒的外衣殼蛋白，也是一種糖基化蛋白，因不同毒株而異，分別由病毒基因組的基因7或8、9基因編碼，為病毒外膜主要中和抗原，與病毒的毒力及免疫保護(hù)性相關(guān)。因此主要根據(jù)vp7不同基因型序列特點(diǎn)擴(kuò)增大小不同的特異性片段，通過擴(kuò)增片段大小不同來判定不同的基因型。

本發(fā)明從豬輪狀病毒全長vp7基因上篩選出一段高度保守的基因片段，發(fā)明人針對該保守片段設(shè)計(jì)了多對引物和探針，最終根據(jù)擴(kuò)增效果(擴(kuò)增效率、靈敏度等)篩選出本發(fā)明的引物和探針。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的上下游擴(kuò)增引物匹配性和特異性良好。同時(shí)在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)73bp片段間設(shè)計(jì)了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與PoRV核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，熒光探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增PoRV核酸，同其它常見感染豬的病毒無交叉反應(yīng)。

考慮到擴(kuò)增的豬輪狀病毒的范圍更寬，設(shè)計(jì)兼并堿基，即本發(fā)明的引物和探針含有兼并堿基，因此該引物和探針的廣泛性和特異性強(qiáng)，靈敏性好。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物RV73-f、所述下游擴(kuò)增引物RV73-r和所述特異性熒光探針RV73-p的摩爾比為2:2:1。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述上游擴(kuò)增引物RV73-f、所述下游擴(kuò)增引物RV73-r和所述特異性熒光探針RV73-p在所述試劑盒中的終濃度均為0.1～0.4μM。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述試劑盒還包括陰性對照、陽性對照、熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)及說明書。

在RT-PCR反應(yīng)體系中加入熒光RT-PCR反應(yīng)液，該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等。本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)液中還含有dNTPs、反轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶和一些增強(qiáng)成分(MgCl₂、DMSO或甲酰胺)的混合物，具體的增強(qiáng)成分根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行添加。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH₂O，所述陽性對照為含有豬輪狀病毒vp7基因序列的克隆質(zhì)粒pEASY-vp7，克隆質(zhì)粒pEASY-vp7的終濃度為3.2×10⁵copies/μL～3.2×10⁷copies/μL。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述豬輪狀病毒vp7基因序列的核苷酸序列如下所示：

GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGACTGGCTATCGGATAGCTCATTTT AATGTATGGTATTGAATATACCACAG，其為SEQ ID NO:4所示。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述克隆質(zhì)粒pEASY-vp7采用以下方法制備得到：提取豬輪狀病毒RNA，利用引物RV73-f和RV73-r一步法擴(kuò)增得到豬輪狀病毒vp7基因序列，通過TA克隆將該豬輪狀病毒vp7基因序列連接至pEASY-T1載體，轉(zhuǎn)化后篩選陽性克隆，測序正確的克隆質(zhì)粒命名為pEASY-vp7。

進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了所述的檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的使用方法，包括以下步驟：

(1)使用所述的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：

熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：16μL；

10μMSEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物RV73-f：0.4～0.8μL；

10μMSEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物RV73-r：0.4～0.8μL；

10μMSEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針RV73-p：0.2～0.4μL；

RNA模板：2μL；

ddH₂O：補(bǔ)足至20μL；

(2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)；

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為豬輪狀病毒感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為豬輪狀病毒感染陰性。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述RNA模板采用以下方法制備得到：

1)取50-200mL豬臍帶血置1.5mL EP管中，加入1mL裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；

所述裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS0.1-0.2％；③吐溫20 1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40 1-2％；

(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；

(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；

(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(6)加入1mL質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(7)晾干，加入適量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速電泳檢測RNA完整性。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。

在本發(fā)明中，為了使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值，對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度和特異性熒光探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，尤其是探針的濃度。引物濃度過低會(huì)影響擴(kuò)增效率，引物濃度過高會(huì)引起錯(cuò)配和非特異性擴(kuò)增，且增加引物之間形成二聚體的機(jī)會(huì)，同樣特異性熒光探針濃度過低會(huì)引起特異性的熒光信號(hào)變?nèi)酰鴿舛冗^高則會(huì)引起探針與模板發(fā)生非特異性結(jié)合，產(chǎn)生非特異性熒光信號(hào)從而干擾特異性熒光信號(hào)，待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度會(huì)影響PCR擴(kuò)增的效率，應(yīng)根據(jù)目的基因的大小選擇合適的RNA模板濃度。本發(fā)明經(jīng)過一系列優(yōu)化試驗(yàn)，最終確定本發(fā)明的熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，采用本發(fā)明的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測豬輪狀病毒的擴(kuò)增效率接近100％，并可獲得最小的Ct值。

更進(jìn)一步的，本發(fā)明還提供了上述試劑盒在制備檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒試劑中的用途。

本發(fā)明將豬輪狀病毒的vp7基因和TaqMan探針相結(jié)合，在豬輪狀病毒的vp7基因選取保守區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物和特異性探針，通過對待檢臍帶血中提取的RNA模板濃度、引物濃度以及特異性熒光探針濃度等進(jìn)行優(yōu)化，建立了仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法。靈敏度試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為3.2×10⁸-32copies/μL，可以從豬輪狀病毒感染臍帶血中檢測到最低32copies的豬輪狀病毒核酸，靈敏度是常規(guī)PCR方法的300倍。特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、流行性腹瀉病毒與傳染性胃腸炎病毒等的細(xì)胞培養(yǎng)物及正常細(xì)胞均無非特異性反應(yīng)，說明該方法特異性和可靠性強(qiáng)。準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果表明，對于陽性對照與陰性對照的檢測，該方法與常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果100％符合；對于臨床樣品的檢測，該方法檢測豬輪狀病毒陽性5/84，常規(guī)RT-PCR方法檢測豬輪狀病毒陽性2/84，且后者檢測的2份樣品使用該方法檢測均為陽性，說明該方法比常規(guī)RT-PCR方法更敏感，準(zhǔn)確性高。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法對10⁶copies/μl、10⁵copies/μl和10⁴copies/μl濃度的陽性對照pEASY-vp7克隆質(zhì)粒檢測變異系數(shù)(CV)均小于3％，具有較好的重復(fù)性。

本發(fā)明是利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法代替常規(guī)RT-PCR方法，并制備成試劑盒，主要通過檢測仔豬臍帶血中是否含有PoRV核酸，評估及預(yù)警豬群PoRV野毒感染狀況，及時(shí)制定防控計(jì)劃。同時(shí)，本發(fā)明的方法亦可用于對發(fā)病豬病料組織、排泄物的檢測，檢測更準(zhǔn)確、快速。

綜上所述，本發(fā)明建立的檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法和基于該方法建立的試劑盒具有準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)和重復(fù)性優(yōu)的特點(diǎn)，可以用于豬輪狀病毒感染的病原學(xué)研究、早期診斷，對豬輪狀病毒的快速診斷、綜合防控、病原凈化和早期治療具有重要意義。

本發(fā)明應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的工作原理：豬屬于上皮絨毛胎盤，豬胎盤生理正常的結(jié)構(gòu)即血胎屏障，胎盤屏障的存在使正常的臍帶血內(nèi)不存在任何病原和抗體等大分子物質(zhì)，但在如某些病毒單獨(dú)或協(xié)同感染的情況下，屏障通透性變化導(dǎo)致病原從母體垂直傳播至新生個(gè)體。PoRV一般經(jīng)母豬糞便或乳汁污染傳播至仔豬，亦可能隨同某些病毒的混合感染進(jìn)行臍帶血垂直傳播，因此首創(chuàng)采用從仔豬臍帶血中檢測PoRV來評價(jià)及預(yù)警仔豬腹瀉疾病的發(fā)病情況，這種尋找“源頭”的檢測方法更加科學(xué)、直接、有效。在診斷豬輪狀病毒感染時(shí)，一般需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場疫病流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖解變化，對該病進(jìn)行系統(tǒng)全變的診斷。采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)診斷豬輪狀病毒感染的實(shí)施步驟為：(1)評估豬場疫病情況，包括:流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖解變化。(2)采集樣品(包括血清和病料)：A、血清采集：按一定比例對豬群進(jìn)行靜脈采血，分離血清。B、病料采集：采集每頭母豬所產(chǎn)流產(chǎn)或死產(chǎn)胎兒的腦、肺、肝、腎和母豬胎盤合為1份病料，每次至少采集4份病料。(3)送檢：將采集的樣品貼上標(biāo)簽，做好記錄后放入泡沫盒中，加入冰塊，密封后送獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行相關(guān)病原檢測。(4)RNA提?。簩悠愤M(jìn)行處理，進(jìn)行RNA提取。(5)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測：合成特異性引物和熒光探針，利用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測樣品中是否有豬PoRV特異性核酸片段。(6)根據(jù)是否檢測豬PoRV特異性核酸片段，判定檢測結(jié)果。(7)根據(jù)檢測結(jié)果，結(jié)合該豬場疫病流行病學(xué)、臨床癥狀、病理剖解變化，對該病進(jìn)行系統(tǒng)的診斷。

本發(fā)明還提供了一種臍帶血的采集方法，具體步驟如下：

(1)取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

(2)當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可；若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊、死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；

(3)臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；

(4)將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20℃冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測項(xiàng)目的清單。

本發(fā)明臍帶血的采集方法克服現(xiàn)有常規(guī)采血技術(shù)的耗時(shí)長、采血困難、對豬只應(yīng)激大等問題，臍帶血采集簡單、方便、快捷和無應(yīng)激。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的試劑盒具有以下有益效果：

(1)本發(fā)明的檢測方法克服了常規(guī)檢測技術(shù)耗時(shí)長、敏感度低、安全系數(shù)低、抗污染能力差和不能準(zhǔn)確定量等問題，檢測快速高效，不會(huì)造成樣品交叉污染。

(2)本發(fā)明的檢測方法準(zhǔn)確度高，靈敏度高，特異性強(qiáng)，重復(fù)性優(yōu)，可以實(shí)現(xiàn)較大通量樣品的檢測。

(3)本發(fā)明的檢測方法不僅適用于檢測臍帶血檢測，還適用于待檢豬的脾臟、淋巴結(jié)、血清及血漿等樣品，可用于任何實(shí)驗(yàn)室和基層各級防控單位、獸醫(yī)站及大中小型養(yǎng)殖場等。

(4)在日常豬輪狀病毒檢測及疾病凈化過程中，需進(jìn)行活體采樣，對豬群的應(yīng)激較大，難度也高，而臍帶血避免了這些問題，臍帶血雖然含毒量相對于組織而言要低，在實(shí)際應(yīng)用中也對組織及對應(yīng)臍帶血進(jìn)行了相互印證，確保本發(fā)明檢測方法的特異性及敏感性。

(5)本發(fā)明運(yùn)用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，通過一個(gè)PCR反應(yīng)，就可以從臍帶血、血液與組織樣品中檢測出是否有豬輪狀病毒存在，操作簡單操作時(shí)間短，做一次病原檢測僅需要2-3小時(shí)，快捷迅速、節(jié)約成本；而且需要儀器設(shè)備相對簡單，不需要電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)及其分析軟件；結(jié)果相對可靠，不需要電泳，空氣中氣溶膠相對較少，不易污染；技術(shù)操作要求低，可以在基層大量推廣；基于該檢測方法制備的試劑盒易于質(zhì)量控制，易于標(biāo)準(zhǔn)化。

附圖說明

圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度標(biāo)準(zhǔn)曲線；

圖2為本發(fā)明敏感性檢測結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明特異性檢測結(jié)果圖。

圖4為本發(fā)明重復(fù)性檢測結(jié)果圖；

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的組成

(1)熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：該反應(yīng)液中含有UNG酶系統(tǒng)，在擴(kuò)增環(huán)節(jié)可以有效解決擴(kuò)增污染現(xiàn)象，抗污染能力強(qiáng)等；

(2)上下游引物組RV73-f和RV73-r：由上海生工生物工程公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。

上游擴(kuò)增引物RV73-f：5’-CCGGCTTTAAAAGAGAGAATTTC-3’，其為SEQ ID NO:1序列；

下游擴(kuò)增引物RV73-r：5’-CCCTGTGGTATATTCAATACCATACA-3’，其為SEQ ID NO:2序列；

(3)特異性熒光探針RV73-p：由華大基因公司合成，用DEPC水配制成濃度為10μM。

特異性熒光探針RV73-p：FAM-5’-AAGGAGCTAACCGYTAGCCA-3’-TAMRA，其為SEQ ID NO:3序列，Y＝T/C，其中FAM為熒光報(bào)告基團(tuán)，TAMRA為非熒光淬滅基團(tuán)；

本發(fā)明對GenBank中公布的PoRV病毒流行毒株基因序列進(jìn)行對比分析，在PoRV基因組高度保守的外層衣殼蛋白vp7基因上設(shè)計(jì)了上下游擴(kuò)增引物，且匹配性和特異性良好。同時(shí)在該上下游引物擴(kuò)增區(qū)73bp片段間設(shè)計(jì)了高度保守的特異性熒光探針，該特異性熒光探針能與PoRV核酸特異性結(jié)合，引物進(jìn)行擴(kuò)增過程中，探針發(fā)生酶解，致熒光積累被儀器檢測到。該組引物與探針擴(kuò)增效率較好，能特異性擴(kuò)增PoRV核酸，同其它常見感染豬的病毒無交叉。

本發(fā)明的引物和探針含有兼并堿基，因此該引物和探針的廣泛性和特異性強(qiáng)，靈敏性好。

(4)陽性對照為克隆有PoRV外衣殼蛋白vp7基因片段的重組質(zhì)粒pEASY-vp7，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，質(zhì)粒在紫外分光光度計(jì)OD260nm測定質(zhì)量濃度，按公式6.02×10²³×(X ng/μL×10^-9)/DNA length×660換算為拷貝數(shù)，配制濃度為3.2×10⁵copies/μL～3.2×10⁷copies/μL；

其中，克隆質(zhì)粒pEASY-vp7的構(gòu)建方法如下：①按照商業(yè)試劑盒操作說明書提取PoRV核酸；以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2作為特異性引物一步法擴(kuò)增vp7基因73bp目的片段，反應(yīng)條件為：42℃逆轉(zhuǎn)錄60min；95℃預(yù)變性5min；95℃變性30Sec，60℃退火30Sec，72℃延伸30s，共30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min，4℃保溫5min。PCR產(chǎn)物于2％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定；②PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列分析：PCR產(chǎn)物用AXYGEN公司的AxyPrep DNA Gel Excraction Kit膠回收試劑盒回收，通過TA克隆將PoRV病毒vp7基因中73bp目的片段克隆至pEASY-T1載體，然后轉(zhuǎn)化Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基平板上，37℃培養(yǎng)12h-18h。經(jīng)藍(lán)白斑篩選后，用OMEGA公司的Plasmid Mini Kit 1質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，然后用引物進(jìn)行擴(kuò)增和測序，測序后比對成功的克隆質(zhì)粒命名pEASY-vp7。

在本發(fā)明中，所述豬輪狀病毒vp7基因73bp目的片段的核苷酸序列如下所示：

GGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGACTGGCTATCGGATAGCTCATTTT AATGTATGGTATTGAATATACCACAG(SEQ ID NO:4)；

(5)陰性對照為無RNA酶與DNA酶的ddH₂O；

(6)使用說明書。

實(shí)施例2檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的使用方法

本發(fā)明試劑盒使用方法具體包括以下步驟：(1)樣品采集；(2)樣品處理；(3)RNA提??；(4)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR：利用本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物和探針進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測；(5)判定結(jié)果。

1.樣品采集

(1)臍帶血樣品采集

a.取干凈的青霉素瓶和瓶塞，清洗干凈，煮沸滅菌30分鐘，烘干后收集備用；

b.當(dāng)仔豬出生時(shí)，將每頭母豬分娩的所有仔豬的“臍帶血”都擠到一個(gè)干凈的青霉素瓶中，每頭仔豬3-5滴即可，將其“臍帶血”擠到青霉素瓶，密封；

注意事項(xiàng)：①必須要采集同窩母豬產(chǎn)的所有的仔豬，避免同窩母豬所產(chǎn)仔豬的個(gè)體差異造成漏檢；②可以雙人操作，也可以單獨(dú)操作，若仔豬臍帶血不便擠出，可以將臍帶剪成幾段再操作即可；③若母豬分娩出現(xiàn)木乃伊，死胎時(shí)，同窩仔豬臍帶血重點(diǎn)檢測；④弱仔的臍帶血可以另外單獨(dú)再收集一份，重點(diǎn)檢測；

c.臍帶血收集完后蓋好瓶塞，用標(biāo)簽紙或者醫(yī)用白膠布在青霉素瓶做好標(biāo)記，注明采集時(shí)間、母豬耳號(hào)、胎次等信息；

d.將收集的臍帶血的青霉素瓶放至-20°冰箱冷凍保存，送至實(shí)驗(yàn)室檢測，并附上采集臍帶血樣品的數(shù)量、母豬耳號(hào)、需要檢測項(xiàng)目的清單。

(2)病料樣品(扁桃體、腎臟、肺臟和淋巴結(jié)等)

A、剖解取內(nèi)臟：將患病豬剖解，取出完整的上述內(nèi)臟，放置在同一個(gè)干凈塑料袋內(nèi)。

B、記錄：將裝有內(nèi)臟的塑料袋密封，貼標(biāo)簽并記錄發(fā)病豬的日齡、體重、品種、臨床癥狀等信息。

C、將采集的病料樣品集中送至實(shí)驗(yàn)室，并附上所記錄的信息。

2.樣品中模板RNA提取

(1)取50-200mL仔豬臍帶血置1.5mLEP管中，加入1mL裂解液充分勻漿，室溫靜置5min；

裂解液的成分及配比如下：①鹽酸胍4-6M；②十二烷基磺酸鈉SDS，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1-0.2％；③吐溫20，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；④乙基苯基聚乙二醇NP40，其在裂解液中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1-2％；

(2)加入0.6mL異丙醇和10μL磁珠，振蕩15s，靜置2min；

(3)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(4)加入0.5mL異丙醇，將EP管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min；

(5)將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(6)加入1mL質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液，輕輕洗滌沉淀；將EP管放入磁力架吸附1-2min，棄掉液體；

(7)晾干，加入適量的DEPC H₂O溶解，56℃促溶10～15min；

(8)快速電泳檢測RNA完整性。

為監(jiān)測提取過程中的污染，建議在提取樣本的同時(shí)提取一管水作為陰性對照。

本發(fā)明在核酸提取環(huán)節(jié)中，使用鹽酸胍、SDS、吐溫20，NP40，異丙醇和質(zhì)量百分比濃度為70％的乙醇溶液等洗滌，可以有效降低去除溶血的干擾，獲得高質(zhì)量的核酸。

依據(jù)上述方法提取6份隨機(jī)臍帶血樣品總RNA，經(jīng)核酸蛋白檢測儀檢測，濃度均能達(dá)到0.229μg/μl以上，A260/A280比值均在1.9-2.0之間，表明RNA純度高、完整性好，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 RNA質(zhì)量檢測結(jié)果

3.熒光RT-PCR反應(yīng)

對實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化原則為：通過優(yōu)化使同一樣本獲得最大的擴(kuò)增效率和最小的Ct值。經(jīng)過優(yōu)化，實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下所示：

(1)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系以20μL計(jì)為：10μM SEQ ID NO:1所示的上游擴(kuò)增引物RV73-f：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:2所示的下游擴(kuò)增引物RV73-r：0.4～0.8μL；10μM SEQ ID NO:3所示的特異性熒光探針RV73-p：0.2～0.4μL；熒光RT-PCR反應(yīng)液(含酶)：16μL；RNA模板：2μL；ddH₂O：補(bǔ)足至20μL。

同時(shí)設(shè)有陽性對照和陰性對照，陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-vp7：2μL，其余組分相同；陰性對照無RNA酶與DNA酶的ddH₂O：2μL，其余組分相同。

(2)實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)條件為：50℃反轉(zhuǎn)錄30min；95℃預(yù)變性2min；95℃變性15Sec，60℃退火30Sec并收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；結(jié)束反應(yīng)。

(3)結(jié)果分析：

質(zhì)量控制：陰性對照FAM通道檢測無Ct值；陽性對照FAM通道檢測Ct值≤30；上述條件同時(shí)滿足，檢測結(jié)果有效；

結(jié)果判定：FAM通道檢測Ct值≤40，則判定樣品為PoRV感染陽性；FAM通道檢測無Ct值，則判定樣品為PoRV感染陰性。

實(shí)施例3檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒的驗(yàn)證

1.試劑盒擴(kuò)增效率驗(yàn)證

將陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-vp7進(jìn)行10倍梯度稀釋，使其拷貝數(shù)為：10⁸-10¹copies/μl，每個(gè)梯度重復(fù)三次進(jìn)行PoRV實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1為本發(fā)明陽性對照10倍稀釋的梯度擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線(FAM通道)，其中該標(biāo)準(zhǔn)曲線的參數(shù)如下：斜率：-3.26，截距：40.95，相關(guān)系數(shù)：0.99，擴(kuò)增效率：1.02。

綜上，說明該試劑盒檢測PoRV核酸的擴(kuò)增效率均達(dá)到近100％。

2.靈敏度試驗(yàn)

以10倍梯度稀釋的陽性對照克隆質(zhì)粒pEASY-vp7作為模板，進(jìn)行本發(fā)明試劑盒的靈敏度檢測，檢測范圍為3.2×10⁸-32copies/μL。結(jié)果表明，該方法的檢測范圍為3.2×10⁸-32copies/μL，在此范圍的病毒含量可以得到可靠的結(jié)果，即該方法的靈敏度可以檢測到最低32個(gè)拷貝數(shù)的PoRV核酸含量的樣品，檢測結(jié)果見圖2。

3.特異性試驗(yàn)

為了檢測本發(fā)明試劑盒的特異性，利用本發(fā)明的試劑盒檢測檢測豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬藍(lán)耳病毒、流行性腹瀉病毒與傳染性胃腸炎病毒等7種病毒的提取核酸。

檢測結(jié)果表明：本發(fā)明的試劑盒僅對PoRV進(jìn)行擴(kuò)增，表明本發(fā)明試劑盒能特異性擴(kuò)增PoRV，而不與其它病毒核酸發(fā)生交叉反應(yīng)，檢測結(jié)果見圖3。

4.重復(fù)性試驗(yàn)

選用陽性對照pEASY-vp7克隆質(zhì)粒10⁶、10⁵、10⁴copies/μL，對每個(gè)濃度的樣本做3個(gè)重復(fù)，結(jié)果不同核酸濃度的檢測變異系數(shù)(CV)均小于3％，具有較好的重復(fù)性。檢測結(jié)果見表2和圖4。

表2實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測豬輪狀病毒的重復(fù)性試驗(yàn)

5.準(zhǔn)確性臨床驗(yàn)證

使用本發(fā)明的試劑盒同常規(guī)RT-PCR方法對累計(jì)84份臍帶血樣品以及5份健康的臍帶血樣品進(jìn)行了PoRV檢測，結(jié)果表明，對于臨床樣品的檢測，該試劑盒方法檢測PoRV陽性5/84，常規(guī)RT-PCR方法檢測PoRV陽性2/84，且后者檢測的2份樣品使用本發(fā)明試劑盒方法檢測均為陽性，說明試劑盒方法更敏感，檢出率及準(zhǔn)確性更高；對于PoRV陰性臨床樣品的檢測，本發(fā)明試劑盒方法檢測結(jié)果同常規(guī)RT-PCR方法檢測結(jié)果一致。檢測結(jié)果見表3。

表3采用本發(fā)明試劑盒以及普通RT-PCR對臨床樣品進(jìn)行檢測結(jié)果的比較

綜上可見，本發(fā)明設(shè)計(jì)的一對特異性引物和一條特異性熒光探針以及構(gòu)成的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒可以快速鑒定仔豬臍帶血中的豬輪狀病毒，而且該檢測方法簡單、快速、特異性好、靈敏度高、可重復(fù)性好，檢測結(jié)果真實(shí)可靠。

所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：以上任何實(shí)施例的討論僅為示例性的，并非旨在暗示本公開的范圍(包括權(quán)利要求)被限于這些例子；在本發(fā)明的思路下，以上實(shí)施例或者不同實(shí)施例中的技術(shù)特征之間也可以進(jìn)行組合，并存在如上所述的本發(fā)明的不同方面的許多其它變化，為了簡明它們沒有在細(xì)節(jié)中提供。因此，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何省略、修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

序列表

<110>湖南新南方養(yǎng)殖服務(wù)有限公司

<120>一種檢測仔豬臍帶血中豬輪狀病毒的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR試劑盒及其用途

<130> FI160698-ND

<160> 4

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 1

ccggctttaaaagagagaatttc 23

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 2

ccctgtggtatattcaataccataca 26

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

aaggagctaaccgytagcca 20

<210> 4

<211> 73

<212> RNA

<213> PoRV vp7基因序列

<400> 4

ggctttaaaagagagaatttccgactggctatcggatagctcattttaatgtatggtatt 60

gaatatacca cag 73