本發(fā)明涉及一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測(cè)引物、方法及脫毒種薯質(zhì)量預(yù)警方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甘薯是我國重要的糧食作物，也是重要的食品加工和工業(yè)原料。我國是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國，甘薯種植面積占全世界種植面積的45％左右。病毒病是危害甘薯的一類重要病害，可造成嚴(yán)重的產(chǎn)量損失和種性退化。目前全世界已報(bào)道侵染甘薯的病毒有30余種，其中，甘薯褪綠矮化病毒(SPCSV)和甘薯雙生病毒(Sweepoviruses)是侵染甘薯的兩類重要病毒，SPCSV侵染甘薯一般可引起15-88％的產(chǎn)量損失，特別是SPCSV可與多種病毒復(fù)合侵染甘薯形成協(xié)生病害，引起更嚴(yán)重的產(chǎn)量損失，甚至絕收。侵染甘薯的菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)病毒與侵染其它植物的Begomovirus明顯不同，把這類病毒稱之為“Sweepoviruses”。Sweepoviruses是甘薯上的一類重要病毒，據(jù)研究，我國甘薯上至少存在10種Sweepoviruses，包括SPLCV、SPLCCNV、SPLCGoV、SPLCCaV、SPLCShV、SPLCCSV、SPLCHnV、SPLCHnSV、SPLCGxV和SPLCJsV。甘薯雙生病毒侵染甘薯一般可引起11-86％的產(chǎn)量損失，對(duì)甘薯生產(chǎn)危害很大。目前對(duì)甘薯病毒病尚無特別有效的化學(xué)防治方法，種植脫毒甘薯是防治病毒病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。在培育和推廣種植脫毒甘薯的過程中，需要對(duì)脫毒種薯種苗進(jìn)行嚴(yán)格的病毒檢測(cè)，只有經(jīng)過檢測(cè)不含病毒，特別是不含SPCSV和Sweepoviruses的種薯種苗才能在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，否則會(huì)引起產(chǎn)量損失和病毒病的流行和擴(kuò)散蔓延。目前對(duì)SPCSV和Sweepoviruses的檢測(cè)主要采用血清學(xué)方法或單一PCR方法。單一PCR方法需多次進(jìn)行PCR，成本高，效率低，特別是甘薯塊根中由于淀粉和多糖含量高，嚴(yán)重影響核酸提取質(zhì)量和病毒的檢測(cè)效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測(cè)及預(yù)警方法，該方法一次PCR反應(yīng)，可檢測(cè)甘薯塊根中是否存在SPCSV和Sweepoviruses兩類甘薯病毒，有效地提高了檢測(cè)效率，降低了檢測(cè)成本。同時(shí)，本發(fā)明可通過檢測(cè)種薯是否攜帶病毒，進(jìn)而判斷種薯質(zhì)量是否合格，為脫毒甘薯種薯質(zhì)量預(yù)警提供了一種方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：

一種檢測(cè)甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR引物，所述的多重PCR引物包括引物對(duì)CP-F和CP-R、引物對(duì)VF和VR；其中，各引物對(duì)的序列如下：

CP-F：5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R：5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF：5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟：

(1)提取甘薯塊根的總RNA和總DNA；

(2)以甘薯塊根總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA；

(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和甘薯塊根總DNA為模板，利用多重PCR引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

(4)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判定。

所述的多重PCR引物包括引物對(duì)CP-F和CP-R、引物對(duì)VF和VR；其中，各引物對(duì)的序列如下：

CP-F：5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R：5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF：5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR：5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

步驟(2)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反轉(zhuǎn)錄Buffer2μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、40U/μL RNase抑制劑0.25μL、10μmol/μL引物CP-R 0.5μL、200ng/μL總RNA 5.75μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃反轉(zhuǎn)錄40min，99℃5min，5℃5min。

步驟(3)中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq^TM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μL引物CP-R各為0.5μL、10μmol/μL引物VF和10μmol/μL引物VR各為1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA 1μL，ddH₂O補(bǔ)足20μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57.6℃退火40s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果為：當(dāng)出現(xiàn)774bp大小的電泳條帶時(shí)，說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒；當(dāng)出現(xiàn)194bp大小的電泳條帶時(shí)，說明甘薯塊根攜帶甘薯雙生病毒；當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)774bp和194bp兩個(gè)條帶時(shí)說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒兩類病毒。

一種利用多重PCR檢測(cè)方法的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的預(yù)警方法，當(dāng)電泳結(jié)果出現(xiàn)774bp和194bp任何一個(gè)條帶或同時(shí)出現(xiàn)兩個(gè)條帶時(shí)，說明甘薯塊根攜帶病毒，可判斷為不合格脫毒種薯，不能用于生產(chǎn)育苗。

本發(fā)明的有益效果：

1、本發(fā)明了針對(duì)SPCSV和Sweepoviruses兩類病毒，設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)CP-F和CP-R、引物對(duì)VF和VR，檢測(cè)引物具有很好的特異性，僅能從目標(biāo)病毒樣品中擴(kuò)增到特異大小的條帶，不能從相近病毒或其他病原中檢測(cè)到條帶。

2、本發(fā)明利用多重PCR引物建立的甘薯SPCSV和Sweepoviruses病毒的檢測(cè)方法，能夠通過一次PCR反應(yīng)，同時(shí)檢測(cè)甘薯塊根中是否存在SPCSV和Sweepoviruses兩類甘薯病毒，建立了一種根據(jù)甘薯種薯是否帶毒，進(jìn)一步判斷種薯質(zhì)量的預(yù)警方法。

3、本發(fā)明明確了甘薯塊根帶毒與甘薯苗期、大田期病毒癥狀及產(chǎn)量損失的關(guān)系，為通過檢測(cè)種薯是否攜帶病毒，進(jìn)而判斷種薯質(zhì)量是否合格提供了依據(jù)，對(duì)于脫毒甘薯種薯質(zhì)量和病害流行預(yù)警具有重要意義。

4、本發(fā)明的方法不僅可用于種薯(塊根)的檢測(cè)，也可用于薯苗的檢測(cè)。

附圖說明

圖1為不同引物濃度對(duì)多重PCR檢測(cè)結(jié)果的影響。其中，M為Marker，1-6分別對(duì)應(yīng)引物濃度處理(1)-(6)。

圖2為不同退火溫度對(duì)多重PCR檢測(cè)結(jié)果的影響。其中，M為Marker，1-8分別對(duì)應(yīng)從低到高的退火溫度。

圖3為不同模板濃度對(duì)多重PCR檢測(cè)結(jié)果的影響。其中，M為Marker，1-5分別對(duì)應(yīng)模板濃度處理(1)-(5)。

圖4為多重PCR和單一PCR的檢測(cè)結(jié)果比較。其中，(1)為多重PCR；(2)為單一PCR(SPCSV)；(3)為單一PCR(Sweepoviruses)。

圖5為多重PCR引物的特異性試驗(yàn)。其中M為Marker，1、2為含SPCSV和Sweepoviruses的薯塊，3為含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯塊。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1一種同時(shí)檢測(cè)甘薯塊根中褪綠矮化病毒(SPCSV)和雙生病毒(Sweepoviruses)的多重PCR方法

(一)材料和方法

1、病毒材料與取樣方法

田間收獲并保存的病株薯塊，分別為單含SPCSV、單含Sweepoviruses、同時(shí)含有SPCSV和Sweepoviruses的薯塊以及含甘薯羽狀斑駁病毒(SPFMV)和/或潛隱病毒(SPLV)等混合病毒的薯塊。檢測(cè)前用消毒的解剖刀片橫切甘薯塊根結(jié)薯端2-3cm處，挖取薯肉用于檢測(cè)。

2、引物的合成

3、核酸的提取

甘薯塊根總RNA提取用Gene Mark公司生產(chǎn)的植物總RNA提取試劑盒，按照RNA LysisSolution B說明書步驟進(jìn)行。甘薯塊根總DNA提取用美國OMEGA公司生產(chǎn)的植物總DNA提取試劑盒，按照提取說明書步驟進(jìn)行。RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及其它PCR產(chǎn)品為TAKARA公司的產(chǎn)品。

4、單一PCR反應(yīng)體系

以單含SPCSV的甘薯塊根總RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA。反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系為10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 2μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、40U/μL RNase抑制劑0.25μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、200ng/μL總RNA5.75μL。

RT反應(yīng)程序?yàn)?2℃反轉(zhuǎn)錄40min，99℃5min，5℃5min。

SPCSV的鑒定：以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq^TM(version 2.0)10μL、10μmol/μL CP-F 0.5μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、cDNA2μL，ddH₂O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火40s，72℃延伸40s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

Sweepoviruses的鑒定：以單含Sweepoviruses的甘薯塊根總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq^TM 10μL、10μmol/μL VR 1μL、10μmol/μL VF 1μL、200ng/μL DNA模板1μL，ddH₂O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

5、多重RT-PCR反應(yīng)條件篩選

以同時(shí)含有SPCSV和Sweepoviruses的甘薯塊根為樣品，進(jìn)行多重RT-PCR反應(yīng)條件篩選。

在其他條件不變情況下，篩選合適的引物濃度，共設(shè)6個(gè)處理：(1)CP-F 0.5μL，CP-R0.5μL，VF 1μL，VR 1μL；(2)CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 0.5μL，VR 0.5μL；(3)CP-F 0.8μL，CP-R 0.8μL，VF 1.2μL，VR 1.2μL；(4)CP-F 1μL，CP-R 1μL，VF 1μL，VR 1μL；(5)CP-F1.5μL，CP-R 1.5μL，VF 0.5μL，VR 0.5μL；(6)CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 1.5μL，VR 1.5μL。

其他條件不變，篩選退火溫度，設(shè)置8個(gè)處理：48℃、50.4℃、51.8℃、54.7℃、56.2℃、57.6℃、58.8℃、60℃。

其他條件不變，篩選模板濃度，設(shè)置5個(gè)處理，(1)cDNA 0.5μL，DNA 1μL；(2)cDNA0.5μL，DNA 0.5μL；(3)cDNA 0.5μL，DNA0.8μL；(4)cDNA 1μL，DNA 1μL；(5)cDNA0.8μL，DNA 1.2μL。

6、多重PCR體系的建立

在單一PCR的基礎(chǔ)上，分別對(duì)引物濃度、退火溫度、模板濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化，建立同時(shí)檢測(cè)兩類病毒的多重PCR體系。

7、PCR產(chǎn)物的電泳分析

用1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，90V穩(wěn)壓電泳50min，EB染色，凝膠成像儀觀察拍照。

8、多重PCR的特異性檢測(cè)

利用建立的多重PCR方法對(duì)含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯塊進(jìn)行檢測(cè)。

(二)結(jié)果與分析

1、多重PCR反應(yīng)條件篩選

為了確定多重PCR的最優(yōu)反應(yīng)條件，分別對(duì)引物濃度、退火溫度、模板濃度等進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，設(shè)置的6個(gè)引物濃度都能擴(kuò)增出目的條帶，考慮條帶的清晰程度和成本，選擇最佳引物濃度為CP-F 0.5μL，CP-R 0.5μL，VF 1μL，VR 1μL(見附圖1)。設(shè)置的8個(gè)溫度都能擴(kuò)增出目的片段，但當(dāng)退火溫度54.7℃-58.8℃能夠更清晰擴(kuò)增出目的條帶(見附圖2)。cDNA和DNA模板設(shè)置了5個(gè)濃度，結(jié)果表明cDNA 0.5μL和DNA 1μL，cDNA0.5μL和DNA0.8μL，cDNA 1μL和DNA 1μL能擴(kuò)增出清晰目的片段，綜合考慮目的條帶的清晰度和成本，最佳模板濃度為cDNA 0.5μL和DNA 1μL(見附圖3)。

2、多重PCR同時(shí)檢測(cè)SPCSV和Sweepoviruses體系的建立

根據(jù)不同條件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，綜合考慮擴(kuò)增效果和試驗(yàn)成本，最終優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系為：

反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10μL：dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 2μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、40U/μL RNase抑制劑0.25μL、10μmol/μL CP-R 0.5μL、200ng/μL總RNA 5.75μL。RT反應(yīng)程序?yàn)?2℃反轉(zhuǎn)錄40min，99℃5min，5℃5min。

多重PCR反應(yīng)體系為20μL：Premix Ex Taq^TM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μLCP-R各為0.5μL、10μmol/μL引物VR和10μmol/μL VF各為1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA1μL，ddH₂O補(bǔ)足20μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57.6℃退火40s，72℃延伸50s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

3、多重PCR同時(shí)檢測(cè)SPCSV和Sweepoviruses的應(yīng)用

利用建立的多重PCR體系對(duì)薯塊樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與單一PCR的檢測(cè)結(jié)果一致(見附圖4)。

4、多重PCR的特異性檢測(cè)

以含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯塊為材料提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，含SPCSV和Sweepoviruses病毒薯塊均能擴(kuò)增出目的條帶，而從含SPFMV和/或SPLV等混合病毒的薯塊中未擴(kuò)增出任何條帶，說明建立的多重PCR方法有較好的特異性。(見附圖5)。

實(shí)施例2種薯帶毒對(duì)甘薯植株苗期和大田期癥狀及產(chǎn)量的影響

1、材料與方法

實(shí)驗(yàn)室薯窖保存的發(fā)病田薯塊，隨機(jī)取100個(gè)，品種為商薯19。

利用建立的檢測(cè)方法分別對(duì)100個(gè)薯塊進(jìn)行病毒檢測(cè)，然后將這100個(gè)薯塊分別在裝有蛭石的花盆中進(jìn)行育苗，觀察苗期癥狀，并把每個(gè)薯塊長出的薯苗移栽到大田種植，每個(gè)薯塊的薯苗種植一個(gè)小區(qū)，小區(qū)隨機(jī)排列，共100個(gè)小區(qū)，大田期定期觀察記載植株癥狀，調(diào)查每小區(qū)的病害嚴(yán)重度，收獲期進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。

2、結(jié)果與分析

(1)薯塊病毒檢測(cè)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，100個(gè)薯塊中，檢測(cè)單含SPCSV的有26份，單含Sweepoviruses病毒的有17份，同時(shí)檢測(cè)到含SPCSV和Sweepoviruses兩類病毒的有51份，未檢測(cè)到兩類病毒的有6份。

(2)不同處理的癥狀表現(xiàn)

苗期癥狀觀察結(jié)果表明，檢測(cè)單含SPCSV和同時(shí)含SPCSV和Sweepoviruses兩類病毒的薯塊，苗期癥狀有葉片褪綠、皺縮、明脈、植株矮化等癥狀，單含SPCSV薯塊的薯苗顯癥率為100％，同時(shí)含SPCSV和Sweepoviruses兩類病毒的顯癥率為100％；單含Sweepoviruses薯塊的薯苗癥狀較輕微，主要為皺縮和葉片褪綠，但顯癥率仍為100％。

移栽大田后45天調(diào)查結(jié)果表明，單含SPCSV和同時(shí)含SPCSV、Sweepoviruses兩類病毒的癥狀主要有葉片褪綠、皺縮、明脈、植株矮化等，單含SPCSV和同時(shí)含SPCSV、Sweepoviruses兩類病毒的小區(qū)顯癥率均為100％，單含Sweepoviruses的癥狀主要有褪綠、皺縮、明脈、植株矮化等，顯癥率為34％；未檢測(cè)到兩類病毒的健康薯塊的植株均未表現(xiàn)癥狀。

(3)不同處理的產(chǎn)量損失情況

測(cè)產(chǎn)結(jié)果表明，單含SPCSV小區(qū)的產(chǎn)量損失為52.6-93.9％；同時(shí)含SPCSV和Sweepoviruses小區(qū)的產(chǎn)量損失為25.9-98.3％；單含Sweepoviruses小區(qū)的產(chǎn)量損失為1.7-97.4％。

(4)結(jié)論

檢測(cè)單含SPCSV或Sweepoviruses以及同時(shí)含SPCSV和Sweepoviruses病毒薯塊育出的薯苗與健康薯塊育出的薯苗相比，都有不同程度的產(chǎn)量損失或表現(xiàn)不同類型的病毒癥狀，因此，通過檢測(cè)薯塊是否攜帶病毒，可判斷種薯能否用于生產(chǎn)，為種薯質(zhì)量安全提供預(yù)警。

以上所述僅為本發(fā)明最佳的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，本發(fā)明可以有各種更改和變化。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所

<120> 一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測(cè)及預(yù)警方

法

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

acgagtatgg ctgatagcac taa 23

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gtgaagacct gttccagtca act 23

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtaagcgtgt ttgtgtgaag t 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tccattcgga tcttagcagt agt 23