專利名稱：克隆甘薯褪綠矮化病毒spcsv全基因組的引物對及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對及方法。
背景技術(shù)：
甘薯裡綠矮化病毒(S^eetpotato chlorotic stunt virus，SPCSV)屬于長線形病毒科iClosteroviridae')毛形病毒屬iCrinivirus)成員。SPCSV可與馬鈴暮Y病毒屬
狀)的甘薯羽狀斑駁病毒協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害SPVD (sweet potatovirus disease, SPVD)。SPVD是甘薯上的毀滅性病害，通常可使甘薯減產(chǎn)50% 98%，甚至絕收。我國自2010年首次發(fā)現(xiàn)SPCSV以來，目前在全國多個甘薯種植區(qū)陸續(xù)檢測到該病毒 病的存在，嚴(yán)重威脅我國的甘薯產(chǎn)業(yè)。分離克隆該病毒基因組的全長序列，進(jìn)一步研究病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能，有助于探索更有效的抗病毒基因工程途徑，對于SPVD的防治具有重要意義。SPCSV的基因組為雙組分單鏈正義RNA，基因組大小為17.6 kb左右，其基因組是已知的植物病毒中第二大的單鏈正義RNA病毒。分離克隆植物病毒全基因組的常規(guī)方法是首先提純病毒，然后利用純化病毒的RNA或感染病毒的植物葉片的總RNA進(jìn)行克隆。由于SPCSV常常與多種病毒混合侵染甘薯，分離純化極為困難，而且該病毒在甘薯體內(nèi)含量很低，利用常規(guī)的克隆方法很難獲得SPCSV基因組全長序列。因此，截止目前，國際上僅獲得了兩個SPCSV分離物的全基因組序列，國內(nèi)尚未見有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供了一組能使擴(kuò)增片段相互重疊且覆蓋SPCSV基因組兩條RNA近全長序列的引物對；還提供了一種簡便、有效的克隆甘薯褪綠矮化病毒全基因組的方法。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是
一種用于克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對，包括五對引物，其核苷酸序列依次為
RNA1-1-5’5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’
RNA1-2989-3’5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ；
RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’
RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ；
RNA1-4410-5， 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’
RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ；
RNA2-53-5’5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’
RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ；
RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，包括如下步驟
(1)按照上述五組引物核苷酸序列分別合成出對應(yīng)的引物；
(2)將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)，并以其飼養(yǎng)煙粉虱，收集以該感染SPCSV的甘薯植株飼養(yǎng)至少3天的煙粉虱用液氮速凍后，置于_70°C下保存?zhèn)溆茫?br> (3)取上步所得煙粉虱至少10頭，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
(4)以上步所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別利用上述步驟(I)所得的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb ；
(5)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19-T載體連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆；核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，測序完成后，對5個片段進(jìn)行拼接，即獲得SPCSV基因組全長序列。在所述步驟(3)中，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為3.75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer,
0.5ML濃度為10 Mmol/L的下游引物，3 ML濃度為2. 5 mmol/L的dNTPs，0. 25 ML濃度為40U/W的RNase抑制劑和0.5 ML濃度為5U/W的AMV反轉(zhuǎn)錄酶；所述下游引物為RNA1-2989-3’、RNA1_5596_3’、RNAl-8637_3’、RNA2_5599_3’ 或 RNA2-8223-3’ ；反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄60min，99°C 5min，5°C 5min，反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。在所述步驟(4)中，PCR的反應(yīng)體系為50耵，包括5 ML10XPCR buffer，4ML濃度為 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 Mmol/L 的引物各 I ML，0. 5ML 濃度為 5U/ML 的 ZJ Taq酶，5耵反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH20 ;所述引物為RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’，或?yàn)镽NA1-2420-5’ 和 RNA1-5596-3’，或?yàn)?RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’，或?yàn)?RNA2-53-5’ 和RNA2-5599-3’，或?yàn)?RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5 min ；94°C變性30s, 54°C退火30s,根據(jù)目的條帶大小，按照lkb/min計(jì)算延伸時間，72 °C延伸3 6 min,完成35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。本發(fā)明具有積極有益的效果
I.本發(fā)明設(shè)計(jì)的5對引物擴(kuò)增片段相互重疊，覆蓋了 SPCSV基因組兩條RNA近全長序列。2.由于SPCSV常常與多種病毒混合侵染甘薯，分離純化極為困難，而且SPCSV在甘薯體內(nèi)含量很低，因此，利用純化病毒或提取感病甘薯葉片總RNA的常規(guī)方法很難獲得該病毒基因組的全長序列。本項(xiàng)發(fā)明提供了一種利用帶毒煙粉虱克隆甘薯褪綠矮化病毒全基因組的方法，方法簡便、有效，省時、省力，為研究SPCSV提供了一個切實(shí)有效的途徑。


圖I為利用引物RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’從帶毒煙粉虱中擴(kuò)增出的大片段的電泳 圖2為利用引物RNA1-2420-5’和RNA1-5596-3’從帶毒煙粉虱中擴(kuò)增出的大片段的電泳 圖3為利用引物RNA2-53-5’和RNA2-5599-3’從帶毒煙粉虱中擴(kuò)增出的大片段的電泳 圖 4 為利用引物 RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’ 及 RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ 從帶毒煙粉虱中擴(kuò)增出的大片段的電泳圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。下述實(shí)施例中所涉及的試驗(yàn)方法或分析方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法，所用試劑如無特別說明，均為市售。實(shí)施例I :一種從煙粉虱中克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全長基因組的方法
(I)材料與方法
①供試毒源和煙粉虱將感染SPCSV (2010年7月，采自江蘇徐州，采集人張振臣)的 甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)用于飼養(yǎng)煙粉虱，收集飼養(yǎng)3d以上的煙粉虱用液氮速凍后，置于-70°C保存?zhèn)溆?。②試劑及試劑盒UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)公司；RNase抑制劑、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、pMD19-T載體購自TaKaRa公司，其它常用試劑為國產(chǎn)分析純。③引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank中已登錄的SPCSV全基因組(FJ807784和FJ807785)的核苷酸序列設(shè)計(jì)5對引物(如SEQ ID NO. I SEQ ID NO. 10所示)
RNA1-1-5’ 5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’ ，
RNA1-2989-3’ 5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ;
RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’ ，
RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ;
RNA1-4410-5’ 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’ ，
RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ;
RNA2-53-5’ 5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’ ，
RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ;
RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’ ，
RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’。設(shè)計(jì)的5對引物擴(kuò)增片段相互重疊，覆蓋了 SPCSV基因組兩條RNA近全長序列，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb。引物由上海生工生物工程公司合成。④RT-PCR :取_70°C保存的煙粉虱10頭以上，放入加有30ML預(yù)冷的RNA提取液(20mmol/L 碳酸銨，pH9. 0，2%SDS, 2 mmol/L EDTA, 200 y g/ ml 皂土)的 I. 5ml 離心管中，用DEPC處理過的研磨棒充分研磨，再用170ML的抽提液沖洗研磨棒，然后按照UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒說明書，提取煙粉虱體內(nèi)總RNA。利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄體系為10W，包括3. 75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer，0. 5ML濃度為10 Mmol/L 的下游引物(RNA1-2989-3，、RNA1-5596-3’、RNA1-8637-3’、RNA2-5599-3’ 或RNA2-8223-3’)，3 ML濃度為 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，0.25 ML濃度為 40U/W 的 RNase 抑制劑和0. 5 ML濃度為5U/W的AMV反轉(zhuǎn)錄酶。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄60 min, 99°C5 min, 5V 5 min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
PCR 的反應(yīng)體系為 50W，包括5 MLlOXPCR buffer，4ML 濃度為 2. 5 mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 Mmol/L 的引物(RNA1-1-5，和 RNA1-2989-3’ ；RNAl-2420_5’和 RNA1-5596-3’ ;RNA1-4410_5，和 RNA1-8637-3’ ；RNA2-53_5’ 和 RNA2-5599-3’ ；RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’)各 I ML，0. 5ML 濃度為 5U/ML 的 ZJ Taq 酶，5 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH20。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C預(yù)變性5 min，94°C變性30 s，54°C退火30 S，根據(jù)目的條帶大小，按照lkb/min計(jì)算延伸時間，72°C延伸3_6 min,完成35個循環(huán),最后72°C延伸10min。用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測時上樣量為20W，100V穩(wěn)壓電泳50min, EB染色，經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。⑤RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和序列測定將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19_T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST軟件對所測序列進(jìn)行比較分析。(2)結(jié)果與分析
①RT-PCR擴(kuò)增SPCSV基因組序列以提取的煙粉虱總RNA為模板，分別利用上述的5對引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，從帶毒煙粉虱中均能較容易地?cái)U(kuò)增出與預(yù)期大小一致的特異性條帶(見附圖I至圖4)。②RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和序列測定將RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克隆。核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST軟件對所測序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果表明，所克隆的片段與已發(fā)表(Cuellar, W. J.，Cruzado, R. K. , Fuentes, S. , Untiveros, M., Soto, M. and Kreuze, J. F. Sequence characterization of a Peruvian isolate ofSweet potato chlorotic stunt virus: Further variability and a model for p22acquisition Virus Res. 157 (I), 111-115 (2011))的東非株系的核苷酸序列一致性為82%，與已發(fā)表(FJ807784和FJ807785)的西非株系的核苷酸序列一致性分別為99%。③SPCSV基因組近全長序列的拼接利用DNAMAN軟件對獲得的各個片段進(jìn)行拼接，對照測序峰圖糾正錯誤堿基，獲得SPCSV基因組全長序列。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對，包括五對引物，其核苷酸序列依次為 RNA1-1-5’5’ -GAAATACTTCCAGCTATCCAAATTTGGTG-3’ RNA1-2989-3’5’ -ATACGTCTCTCTCCAACGACAAC-3’ ； RNA1-2420-5’ 5’ -AGAGAACAACTTCATTTCTACTCAATTGT-3’ RNA1-5596-3’ 5’ -GATAAATAAGTTTACCTGTATTGTCGGTC-3’ ； RNA1-4410-5， 5’ -GAGCATCAACTGTGGACGGCGAACCAAGC-3’ RNA1-8637-3’ 5’ -AACCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ ； RNA2-53-5’5’ -CATTGGTTGTCGTCATGACTCGCAT-3’ RNA2-5599-3’ 5’ -CCAACTTACCAGATTTCGAGAACTGTAC-3’ ； RNA2-4440-5’ 5’ -ATGCGTCTCGTCGTGACGTCCAGACTG-3’ RNA2-8223-3’ 5’ -GGCCTAGTTATTTAAATACTAGGTTTTCC-3’ 。
2.一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，包括如下步驟 (1)按照權(quán)利要求I所述的引物核苷酸序列合成出五對引物； (2)將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)，并以其飼養(yǎng)煙粉虱，收集以該感染SPCSV的甘薯植株飼養(yǎng)至少3d的煙粉虱用液氮速凍后，置于_70°C下保存?zhèn)溆茫? (3)取上步所得煙粉虱至少10頭，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄； (4)以上步所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別利用所述步驟(I)所得的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小分別為2. 9kb、3. 2kb、4. 2kb、5. 6kb和3. 8kb ； (5)用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19-T載體連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽性克??；核苷酸序列測定由TaKaRa公司完成，測序完成后，對5個片段進(jìn)行拼接，即獲得SPCSV基因組近全長序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，其特征在于，在所述步驟(3)中，反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為3.75 ML RNA模板，2W 5XRT buffer，0. 5ML濃度為10 Mmol/L的下游引物，3 ML濃度為2. 5 mmol/L的dNTPs，0. 25 ML濃度為40U/W的RNase抑制劑和0. 5 ML濃度為5U/W的AMV反轉(zhuǎn)錄酶；所述下游引物為RNA1-2989-3’、RNA1-5596-3’、RNAl-8637_3’、RNA2_5599_3’ 或 RNA2-8223-3’ ；反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄60min,99°C 5min, 5°C 5min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的方法，其特征在于，在所述步驟(4)中，PCR的反應(yīng)體系為50耵，包括5 ML10XPCR buffer，4ML濃度為2.5 mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 Mmol/L 的引物各 I ML，0. 5ML 濃度為 5U/ML 的 ZJ Taq酶，5耵反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH20 ;所述引物為RNA1-1-5’和RNA1-2989-3’，或?yàn)镽NA1-2420-5’ 和 RNA1-5596-3’，或?yàn)?RNA1-4410-5’ 和 RNA1-8637-3’，或?yàn)?RNA2-53-5’ 和RNA2-5599-3’，或?yàn)?RNA2-4440-5’ 和 RNA2-8223-3’ ；PCR 反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性 5 min ；94°C變性30s, 54°C退火30s,根據(jù)目的條帶大小，按照lkb/min計(jì)算延伸時間，72 °C延伸3 6 min,完成35個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。
全文摘要
本發(fā)明涉及涉及一種克隆甘薯褪綠矮化病毒SPCSV全基因組的引物對及方法。該引物有五對，依次具有如SEQIDNO.1～SEQIDNO.10所示的核苷酸序列；以感染SPCSV的甘薯植株飼養(yǎng)煙粉虱，收集感染SPCSV的煙粉虱，提取其總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，分別利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對所得片段進(jìn)行拼接，即獲得SPCSV基因組全長序列。本發(fā)明所設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增片段相互重疊，覆蓋了SPCSV基因組兩條RNA近全長序列；本發(fā)明利用帶毒煙粉虱克隆甘薯褪綠矮化病毒全基因組的方法，方法簡便、有效，省時、省力，為研究SPCSV提供了一個有用工具。
文檔編號C12N15/11GK102747071SQ201210174438
公開日2012年10月24日 申請日期2012年5月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月31日
發(fā)明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艷紅 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院