專利名稱：煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的檢測(cè)方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域中的病毒檢測(cè)方法，特別是涉及一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的半巢式RT-PCR檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
甘薯裡綠矮化病毒(S^eetpotato chlorotic stunt virus，SPCSV)屬于長(zhǎng)線形病毒科{Closteroviridae)毛形病毒屬iCrinivirus)成員。該病毒的基因組為雙組份單鏈正義RNA，基因組大小為17.6 kbp左右。根據(jù)血清學(xué)關(guān)系和核苷酸序列，SPCSV可劃分為東非(EA)和西非(WA)兩個(gè)株系。上世紀(jì)70年代首先在非洲發(fā)現(xiàn)了 SPCSV，目前主要分布在非洲和南美一些國(guó)家。我國(guó)自2010年首次發(fā)現(xiàn)SPCSV以來(lái)，目前在全國(guó)多個(gè)甘薯種植區(qū)陸續(xù)檢測(cè)到該病毒病的存在。SPCSV是危害甘薯的主要病毒之一，特別重要的是，SPCSV 可與馬鈴薯Y病毒屬的甘薯羽狀斑駁病毒協(xié)生共侵染甘薯引起甘薯病毒病害 SPVD (sweet potato virus disease, SPVD)。SPVD是甘薯上是最嚴(yán)重的病毒病害之一，通?？墒垢适頊p產(chǎn)50%-98%，甚至絕收。SPCSV是SPVD的主要病原之一，主要由煙粉虱(Bemisa babaci)以半持久方式傳播，感染SPCSV的甘薯通常會(huì)迅速形成SPVD，SPVD的流行跟煙粉虱的數(shù)量密切相關(guān)。SPCSV 的長(zhǎng)距離傳播主要通過(guò)種薯和種苗，短距離主要通過(guò)煙粉虱進(jìn)行傳播。煙粉虱生存能力強(qiáng)、 繁殖速度快。據(jù)報(bào)道，煙粉虱經(jīng)過(guò)48h的飼毒就能進(jìn)行有效傳染，而且煙粉虱的數(shù)量越大， 病毒傳播的有效性越強(qiáng)。由于對(duì)SPCSV尚無(wú)特別有效的防治方法，做好煙粉虱帶毒率的檢測(cè)，加強(qiáng)對(duì)煙粉虱的防治，可有效減少SPCSV的蔓延擴(kuò)散，減少病害引起的損失。因此，建立一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的方法，對(duì)于該病的預(yù)警和防治具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題提供一種簡(jiǎn)便、快速、靈敏的半巢式RT-PCR檢測(cè)煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案
一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒SPCSV的檢測(cè)方法，包括以下步驟
(O分別設(shè)計(jì)合成SPCSV病毒的3條引物
CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，
CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，
CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，
其中K為G或T，R為A或G，Y為C或T，HSA、T*C;
(2)用解剖針挑取煙粉虱，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；
(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進(jìn)行半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp ;利用引物CSV70P1和CSV70P3進(jìn)行半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為170bp ；
(4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，0. 5μ 濃度為 10 MmoI/L 的 CSV70P2，I PL 濃度為 10 mmol/L 的 dNTPs，0. 25 PL 濃度為 40υ/μ1 的 RNase抑制劑和O. 5 μ 濃度為5υ/μ1的AMV反轉(zhuǎn)錄酶，余量為DEPC_H20。反應(yīng)程序?yàn)?2°C 反轉(zhuǎn)錄40min,99°C 5min, 5°C 5min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所述半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增的反應(yīng)體系為25μ1，包括2. 5μ 10 X PCR buffer, Iμ 濃度為 2. 5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 MmoI/L 的 CSV70P1 和 CSV70P2 各 O. 5 μ , O. 2μ 濃度為5U/^L的Taq酶，2. 5μ1反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH20 ;擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸45s，完成35個(gè)循環(huán)，最后72°C 延伸IOmin0所述半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增是將第一輪RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，取 WL稀釋產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μ1，包括2.5 PLIOXPCR buffer, μ 濃度為 2· 5 mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 MmoI/L 的 CSV70P1 和 CSV70P3各O. 5 μ , O. 2μ 濃度為5U/^L的Taq酶，用ddH20補(bǔ)足至25 μ 。第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，完成32個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸IOmin0所述的方法在檢測(cè)單頭或多頭煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的應(yīng)用。 本發(fā)明的積極有益效果
(I)本發(fā)明的半巢式RT-PCR檢測(cè)方法能對(duì)單頭或多頭帶毒的煙粉虱進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%，表明該方法能穩(wěn)定地檢測(cè)出單頭或多頭煙粉虱中的SPCSV，而RT-PCR方法只能檢測(cè)出3頭以上煙粉虱中的SPCSV，說(shuō)明半巢式RT-PCR檢測(cè)方法效率更高。(2)本發(fā)明的檢測(cè)方法和RT-PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性比較看出，RT-PCR可檢測(cè)出 SPCSV時(shí)的CRNA最低濃度為5. 69 X IO4拷貝/μ ，半巢式RT-PCR檢測(cè)出SPCSV時(shí)的cRNA最低濃度為5. 69X IO1拷貝/>L，表明半巢式RT-PCR的檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高1000倍。說(shuō)明本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)精度更高。(3)本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便，能快速、靈敏地檢測(cè)單頭或多頭煙粉虱中的甘薯褪綠矮化病毒，實(shí)現(xiàn)對(duì)煙粉虱帶毒情況的有效監(jiān)測(cè)，對(duì)加強(qiáng)煙粉虱的防治和減少該病毒的蔓延擴(kuò)散具有重要意義。


圖I :RT_PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的擴(kuò)增結(jié)果；
圖中M :DL2000 marker ;1_5分別表示10頭、5頭、3頭、2頭和單頭帶毒煙粉虱；6_8 :分別為無(wú)毒煙粉虱、健康甘薯和SPCSV #5^70重組質(zhì)粒。圖2 :本發(fā)明的半巢式RT-PCR檢測(cè)煙粉虱中SPCSV的擴(kuò)增結(jié)果；
圖中M DL2000 marker ;1、3、5、7、9分別為單頭、2頭、3頭、無(wú)毒煙粉虱和甘薯試管苗的
4第一輪RT-PCR產(chǎn)物；2、4、6、8、10分別為單頭、2頭、3頭煙粉虱、無(wú)毒煙粉虱和甘薯試管苗的第二輪PCR產(chǎn)物；11、12分別為SPCSV重組質(zhì)粒的第一輪、第二輪PCR產(chǎn)物。圖3 =RT-PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性的擴(kuò)增結(jié)果；
圖中 M DL2000 marker ;1_7 :分別為 10 倍梯度稀釋的 5. 69X 107_5· 69X IO1 拷貝 /μ 體外反轉(zhuǎn)錄RNA。圖4 :本發(fā)明的半巢式RT-PCR檢測(cè)SPCSV靈敏性的擴(kuò)增結(jié)果；
圖中 M DL2000 marker ；1~7 :分別為 10 倍梯度稀釋的 5. 69X 107_5· 69X IO1 拷貝 /μ 體外反轉(zhuǎn)錄RNA。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的檢測(cè)方法及其應(yīng)用 I材料與方法
I. I供試毒源和煙粉虱
將感染SPCSV的甘薯植株種植于防蟲溫室內(nèi)用于飼養(yǎng)煙粉虱，將飼養(yǎng)3d以上的煙粉虱視為帶毒煙粉虱，將從大田棉花上捕捉的煙粉虱用健康的白菜飼養(yǎng)兩周后作為陰性對(duì)照。 收集帶毒煙粉虱和健康煙粉虱用液氮速凍后，置于_70°C保存?zhèn)溆?。將?jīng)過(guò)NCM-ELISA和 RT-PCR檢測(cè)SPCSV為陰性的甘薯莖尖培養(yǎng)試管苗作為甘薯陰性對(duì)照。1.2試劑及試劑盒
UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；UNIQ_10柱式DNA膠回收試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)公司；RNase抑制劑、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、 PMD19-T載體、T7 RNA Polymerase購(gòu)自TaKaRa公司，其它常用試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。I. 3引物設(shè)計(jì)
根據(jù)GenBank中已登錄的SPCSV也/770基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)三條引物
CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，
CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，
CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，
其中 K 為 G 或 T，R 為 A 或 G，Y 為 C或 T，H*A、T*C ；CSV70P1 和 CSV70P2 用作半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp ；CSV70P1和CSV70P3用作半巢式 RT-PCR的第二輪擴(kuò)增引物，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為170bp。引物由上海生工生物工程公司合成。
I. 4 RT-PCR檢測(cè)煙粉虱中的SPCSV
用解剖針挑取單頭煙粉虱放入加有30μ 預(yù)冷的RNA提取液的I. 5ml離心管中(RNA提取液的成分為20 mmol/L的碳酸銨，2%的SDS，2mmol/L EDTA, 200 μ g/ ml的皂土，其中所用碳酸銨母液的PH值為9. 0)，用DEPC處理過(guò)的研磨棒充分研磨，再用170μ 的抽提液沖洗研磨棒，然后按照UNIQ-10柱式總RNA抽提試劑盒說(shuō)明書，提取煙粉虱體內(nèi)總RNA。利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和PCR。反轉(zhuǎn)錄體系為10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，?！?5μ CSV70P2 (10 Mmol/L),I μ dNTPs (10 mmol/L),0. 25 μ RNase抑制劑(40 U/^L)和0. 5 μ AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5υ/μ1)，用DEPC-H2O補(bǔ)足至10μ 。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?21^反轉(zhuǎn)錄40 min,99°C 5 min, 5°C 5 min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
PCR 反應(yīng)體系為2. 5μ1 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，2. 5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs (2.5 mmol/L),O. 5 μ CSV70P1 (10 Mmol/L)和 0· 5 μ CSV70P2 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/μυ，用 ddH20 補(bǔ)足至 25 μ 0PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件94°C預(yù)變性2 min，94°C變性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸 45s，完成35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)時(shí)上樣量為8μ1，100V穩(wěn)壓電泳30 min, EB染色，經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。I. 5半巢式RT-PCR檢測(cè)煙粉虱中的SPCSV
取4 PL按1.4中方法提取的煙粉虱總1 ^作為模板，利用引物05￥70 1和05￥70 2 進(jìn)行半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp。具體步驟為
利用RT-PCR試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系為10μ1，包括4 μ RNA模板，2μ1 5XRT buffer，?！?5μ CSV70P2C10 Mmol/L), I μ dNTPs(10 mmol/L),0. 25 μ RNase 抑制劑(40 U/ μυ和0. 5 μ AMV反轉(zhuǎn)錄酶(5υ/μ1)，用DEPC-H2O補(bǔ)足至10μ 。反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?42°C反轉(zhuǎn)錄40 min, 99°C 5 min, 5°C 5 min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。PCR 反應(yīng)體系為2. 5μ1 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，2. 5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs (2.5 mmol/L),0. 5 μ CSV70P1 (10 Mmol/L)和 0· 5 μ CSV70P2 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/μυ，用ddH20補(bǔ)足至25 μ 。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性2 min，94°C變性30 s，54°C退火30 s，72°C延伸45s，完成35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍后，取I PL的稀釋產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增模板，第二輪 PCR 擴(kuò)增體系為2.5 μ 10XPCR buffer, I μ dNTPs(2. 5 mmol/L), 0. 5 μ CSV70P1C10 Mmol/L)和 0.5 μ CSV70P3 (10 Mmol/L)，O. 2μ Taq 酶(5 U/^L)，用 ddH20 補(bǔ)足至 25μ 。半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，56°C 退火30s，72。。延伸30s，完成32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin0PCR產(chǎn)物的電泳、染色及成像同I. 4。即用I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，檢測(cè)時(shí)上樣量為8μ1，100V穩(wěn)壓電泳30 min, EB染色，經(jīng)UVP凝膠成像系統(tǒng)觀察和照相。I. 6 RT-PCR和半巢式RT-PCR產(chǎn)物的克隆和序列測(cè)定
將部分RT-PCR和半巢式RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，分別與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR鑒定后獲得陽(yáng)性克隆。核苷酸序列測(cè)定由TaKaRa公司完成，利用DNAMAN和BLAST軟件對(duì)所測(cè)序列進(jìn)行比較分析。 1.7 RT-PCR和半巢式RT-PCR檢測(cè)SPCSV的靈敏性比較
按照T7 RNA Polymerase說(shuō)明書進(jìn)行RNA體外轉(zhuǎn)錄。在上游引物CSV70P1的5端引入T7啟動(dòng)子序列，以SPCSV基因的重組質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的雙鏈DNA
片段(454bp)在T7 RNA聚合酶的作用下經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄形成單鏈RNA(cRNA)，純化后用核酸測(cè)定儀測(cè)得cRNA濃度為148. lng/^L，根據(jù)阿伏伽德羅常數(shù)將濃度換算為5. 69 X IO11拷貝/ PL[cRNA 含量(拷貝 /μ =6. 02Χ IO23X 148. I X 1(Γ9/(454X 345)=5. 69 X IO11 拷貝 /^L]。 將該cRNA濃度用DEPC-H2O按10倍梯度稀釋成5. 69X 1010-5. 69 X IO1拷貝/μ ，分別取濃度為5. 69 X 107-5. 69 X IO1拷貝/μ 的7個(gè)濃度梯度的RNA作為檢測(cè)模板，分別按照I. 4和
1.5的方法進(jìn)行RT-PCR和半巢式RT-PCR的檢測(cè)，比較二者的靈敏性。 2結(jié)果與分析2.I RT-PCR檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)SPCSV的穩(wěn)定性
以提取的煙粉虱總RNA為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，從10、5、3、2和單頭帶毒煙粉虱中均能擴(kuò)增出一條與預(yù)期大小一致的特異性條帶，而從無(wú)毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗均中未能擴(kuò)增出相應(yīng)的條帶(見圖I)。為了檢驗(yàn)RT-PCR檢測(cè)帶毒煙粉虱的穩(wěn)定性，分別對(duì)單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱各進(jìn)行10次RT-PCR重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)單頭煙粉虱中SPCSV的檢出率是40%，2頭檢出率為60%， 3頭的檢出率為100%。說(shuō)明利用RT-PCR方法只能穩(wěn)定檢測(cè)出3頭煙粉虱中的SPCSV，而不能穩(wěn)定檢測(cè)出單頭煙粉虱中的SPCSV。2. 2半巢式RT-PCR檢測(cè)煙粉虱體內(nèi)SPCSV的穩(wěn)定性
采用半巢式RT-PCR分別對(duì)單頭、2頭、3頭帶毒煙粉虱中SPCSV的帶毒情況進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示，半巢式RT-PCR從單頭、2頭和3頭帶毒煙粉虱體內(nèi)均能擴(kuò)增出目的條帶，而不能從無(wú)毒煙粉虱和脫毒甘薯試管苗中擴(kuò)增出相應(yīng)條帶(見圖2 )。對(duì)單頭帶毒煙粉虱進(jìn)行10次半巢式RT-PCR重復(fù)檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%。說(shuō)明利用半巢式RT-PCR方法能穩(wěn)定地檢測(cè)出單頭煙粉虱中的SPCSV。2. 3 RT-PCR和半巢式RT-PCR兩種檢測(cè)方法的擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定
為了進(jìn)一步驗(yàn)證RT-PCR和半巢式RT-PCR擴(kuò)增出的片段為目的病毒的核酸序列，對(duì)部分?jǐn)U增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和序列測(cè)定。將部分利用RT-PCR和半巢式RT-PCR從煙粉虱中擴(kuò)增出的特異性片段克隆到PMD19-T載體上進(jìn)行序列測(cè)定。結(jié)果表明，所克隆片段的核苷酸序列與SPCSV WA株系的相似性為97. 6%-100%，說(shuō)明兩種方法所擴(kuò)增出的片段均為SPCSV的特異性片段。2. 4 RT-PCR和半巢式RT-PCR方法檢測(cè)SPCSV的靈敏性比較
以制備的SPCSV的CRNA作為模板，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，RT-PCR可檢測(cè)的cRNA 最低濃度為5. 69X IO4拷貝/μ (見圖3)。以第一輪RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，進(jìn)行半巢式RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果半巢式RT-PCR最低能從濃度為5. 69 X IO1拷貝/μ 的cRNA中檢測(cè)出 SPCSV (見圖4)，表明建立的半巢式RT-PCR的檢測(cè)靈敏度比RT-PCR高1000倍。
權(quán)利要求
1.一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒SPCSV的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟(O分別設(shè)計(jì)合成SPCSV病毒的3條引物CSV70P1: 5' -GACGGKGGTACKATGAARGTCC-3'，CSV70P2: 5' -GGCTCACAAACHGAYTTCATAAACAT-3'，CSV70P3: 5' -TCAACCCCAACCCATCGTTTTAG-3'，其中K為G或T，R為A或G，Y為C或T，HSA、T*C;(2)用解剖針挑取煙粉虱，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA 作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進(jìn)行半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp ;利用引物CSV70P1和CSV70P3進(jìn)行半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為170bp ；(4)用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10μ1，包括4 μ RNA 模板，2μ1 5 X RT buffer，O. 5μ 濃度為 10 Mmol/L 的 CSV70P2，I PL 濃度為 10 mmol/L 的 dNTPs，0. 25 μ 濃度為 40υ/μ1 的 RNase 抑制劑和 O. 5 μ 濃度為 5υ/μ1 的 AMV反轉(zhuǎn)錄酶，余量為DEPC-H2O15
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)程序?yàn)?2°C反轉(zhuǎn)錄40min,99°C反應(yīng)5min, 5°C反應(yīng)5min,反應(yīng)后得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增的反應(yīng)體系為 25μ1，包括2. 5PL10XPCR buffer, Ιμ 濃度為 2. 5mmol/L 的 dNTPs，濃度為 10 Mmol/L 的 CSV70P1 和 CSV70P2 各 O. 5 μ , O. 2μ 濃度為 5U/^L 的 Taq 酶，2. 5μ1 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作模板，余量為ddH20。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性2min，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸45s，完成35個(gè)循環(huán)， 最后72°C延伸IOmin0
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增是將第一輪RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋20倍，取WL稀釋產(chǎn)物作為第二輪PCR擴(kuò)增的模板，第二輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25μ1，包括2. 5 PLIOXPCR buffer，Iμ 濃度為2. 5 mmol/L的 dNTPs，濃度為 10 Mmol/L 的 CSV70P1 和 CSV70P3 各 0. 5 μ , 0. 2μ 濃度為 5\]/μ 的 Taq 酶， 用ddH20補(bǔ)足至25 μ 0
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?4°C預(yù)變性21^11，941變性308，561退火30s，72°C延伸30s，完成 32個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸IOmin。
8.權(quán)利要求7所述的方法在檢測(cè)單頭或多頭煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種煙粉虱中甘薯褪綠矮化病毒的半巢式RT-PCR檢測(cè)方法，包括設(shè)計(jì)合成SPCSV病毒的3條引物CSV70P1、CSV70P2、CSV70P3；用解剖針挑取煙粉虱，放入加有預(yù)冷RNA提取液的離心管中，提取煙粉虱的總RNA作為PCR模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板，利用引物CSV70P1和CSV70P2進(jìn)行半巢式RT-PCR的第一輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為431bp；利用引物CSV70P1和CSV70P3進(jìn)行半巢式RT-PCR的第二輪擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為170bp；用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明方法能對(duì)單頭或多頭帶毒的煙粉虱進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為100%，能穩(wěn)定地檢測(cè)出單頭或多頭煙粉虱中的SPCSV，檢測(cè)效率較高；檢測(cè)出SPCSV時(shí)的cRNA最低濃度為5.69×101拷貝/μL，靈敏性較高。該方法能實(shí)現(xiàn)對(duì)煙粉虱帶毒情況的有效監(jiān)測(cè)，對(duì)加強(qiáng)煙粉虱的防治和病毒的蔓延擴(kuò)散具有重要意義。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102586484SQ201210061149
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者喬奇, 張德勝, 張振臣, 張盼, 王永江, 王爽, 田雨婷, 秦艷紅 申請(qǐng)人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院