專利名稱：釀酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種釀酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的應(yīng)用，提供了這種缺失菌株的篩選方法，驗(yàn)證了它在耐糠醛方面的應(yīng)用，屬于生物能源技術(shù)開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著石油資源的枯竭、石油價(jià)格的上漲和環(huán)境的惡化，人們對(duì)可替換能源和環(huán)境友好型能源需求的提高，尋找新型可再生資源替代化石資源和開發(fā)潔凈能源已成為工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。生物質(zhì)能的開發(fā)，可以緩解對(duì)石油資源的依賴、控制二氧化碳的排放，并促進(jìn)農(nóng)業(yè)新型產(chǎn)業(yè)鏈的發(fā)展，對(duì)推動(dòng)我國(guó)社會(huì)主義新農(nóng)村建設(shè)具有重要意義。在尋找可再生資源的過程中，燃料乙醇作為一種可再生潔凈能源從上世紀(jì)70年代在美國(guó)、巴西開始推行。我國(guó)乙醇的生產(chǎn)能力已達(dá)到500多萬(wàn)噸/年，其中燃料乙醇的年產(chǎn)量保持在110萬(wàn)噸左右，僅次于巴西、美國(guó)，居世界第三位。而農(nóng)業(yè)作為可再生能源的提供者的作用變得越來越重要。各種來源的植物纖維素可以作為生產(chǎn)燃料乙醇豐富廉價(jià)的原材料。由于大量使用玉米為原料開發(fā)生物能源導(dǎo)致玉米價(jià)格持續(xù)增長(zhǎng)，所以在經(jīng)過了將糧食轉(zhuǎn)化為乙醇的熱潮之后，纖維素乙醇技術(shù)的開發(fā)和纖維素乙醇的商業(yè)化生產(chǎn)正漸成氣候。但是，以纖維素為原料的乙醇生產(chǎn)過程中產(chǎn)生多種發(fā)酵抑制劑，這大大降低了乙醇的生產(chǎn)效率。其中，糠醛是重要的抑制劑之一。通過功能基因組學(xué)技術(shù)我們獲得能夠耐受糠醛的基因缺失菌株，為提高纖維素乙醇生產(chǎn)效率奠定了理論基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種釀酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的應(yīng)用，還公開了一種大規(guī)模高效篩選耐受糠醛基因缺失菌株的方法，并得到了三個(gè)耐受糠醛的基因缺失菌株，為提高纖維素乙醇生產(chǎn)效率奠定了理論基礎(chǔ)。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案，釀酒酵母缺失菌株KKSC1，其分類命名為 Saccharomyces cererisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012037。釀酒酵母缺失菌株KKSC2,其分類命名為cereFisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012038。釀酒酵母缺失菌株KKSC3,其分類命名為cereFisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012039。所述菌株CCTCC NO M 2012037 缺失基因 SJZ/，CCTCC NO M 2012038 缺失基因 DEPl，CCTCC NO M 2012039缺失基因SAP30。SIZl、DEPl和SAP30三個(gè)基因的缺失具有提高微生物的耐糠醛的能力；
SIZl基因核苷酸序列為SEQ NOl所示，DEPl基因核苷酸序列為SEQ N02所示，SAP30 基因核苷酸序列為SEQ N03所示。
所述釀酒酵母缺失菌株在耐糠醛方面的應(yīng)用，KKSCl、KKSC2、KKSC3的耐糠醛性在
纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。從美國(guó)Invitrogen Inc公司購(gòu)買同源的以BY4741為母菌株的6000個(gè)單基因缺失菌株出發(fā)，進(jìn)行篩選取添加IOmM糠醛的SC固體培養(yǎng)基對(duì)菌株進(jìn)行培養(yǎng)24h，選取出 sizl : ..^a/ MX4、depl: :kanWM 和 sap30 : kanWk\ 三株具有糠醒耐受性的菌株。用PCR技術(shù)擴(kuò)增帶有/7aiMX4遺傳標(biāo)記的DNA片段，將此片段純化后轉(zhuǎn)化到sizl kanWk\菌株細(xì)胞里，此DNA片段通過遺傳重組的方式與.. kanWk\菌株細(xì)胞里的 na MX4遺傳標(biāo)記交換，在YPD+nourseothricin的平板上得到能夠抗nourseothricin抗生素的菌株。再把這個(gè)菌株在YPD+G418的平板上進(jìn)行劃線，3(ie條件下培養(yǎng)2天，如果它在 YPD+G418的平板上不能生長(zhǎng)，它就是sizl .-natWM菌株(既KKSCl菌株)。同樣地,通過相同的方法,從i/e/72 : MX4菌株和知^a/ MX4菌株分別得到 depl na MX4 菌株(KKSC2 )和 sap30 na MX4 菌株(KKSC3 )。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明提供的三個(gè)耐受糠醛基因缺失菌株可以應(yīng)用于搖瓶和發(fā)酵罐里，研究釀酒酵母菌利用含有糠醛的纖維素酸解液發(fā)酵生成乙醇的能力，為纖維素酒精工業(yè)提供高產(chǎn)優(yōu)良基因工程菌株。此外，它們還可以用于研究釀酒酵母菌耐受糠醛的分子機(jī)理。其篩選過程規(guī)模大，效率高，篩選出的菌株切實(shí)提高了糠醛的耐受能力。生物材料樣品保藏釀酒酵母缺失菌株KKSC1,其分類命名為Saccharomyces cerevisae已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年2月27日，保藏編號(hào)為保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012037。釀酒酵母缺失菌株KKSC2,其分類命名為Saccharomyces cererisae,及釀酒酵母缺失菌株KKSC3,其分類命名為Saccharomyces cerevisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，該中心地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年2月27日，保藏編號(hào)為保藏編號(hào) CCTCC NO M 2012038
釀酒酵母缺失菌株KKSC3,其分類命名為Saccharomyces cererisae,及釀酒酵母缺失菌株KKSC3,其分類命名為Saccharomyces cerevisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心， 該中心地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏日期2012年2月27日，保藏編號(hào)為保藏編號(hào)CCTCC NOMM 2012039。


圖 I 釀酒酵母缺失菌株 KKSCl (.sizl natMX4), KKSC2 {depl natMX4),MSC , i.sap30 natMX4)和野生型釀酒酵母菌株BY4741在SC和SC+10mM furfural (糠醛)平板上的生長(zhǎng)表型。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I釀酒酵母缺失菌株KKSCl的耐糠醛性實(shí)驗(yàn)
取釀酒酵母缺失菌株KKSCl在液體YPD培養(yǎng)基里30°C條件下過夜培養(yǎng)8-12h，然后將所得培養(yǎng)物調(diào)至0D600 值為2. 0，得到培養(yǎng)物待用。YPD培養(yǎng)基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物和野生型釀酒酵母菌株，以蒸餾水為溶液，分別按十倍的濃度依次將它們稀釋5次，得到5個(gè)濃度依此遞減的細(xì)胞稀釋溶液，并分別標(biāo)號(hào)備用。從KKSCl和野生型釀酒酵母菌株5個(gè)稀釋后的細(xì)胞溶液樣品中分別取3 μ L點(diǎn)接到不含或者含IOmM糠醛的SC固體培養(yǎng)基上，在30°C條件下平板培養(yǎng)48h。SC固體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和瓊脂20g/L。以不添加糠醛的平板為對(duì)照培養(yǎng)基，經(jīng)檢測(cè)可知KKSCl耐糠醛的能力明顯優(yōu)于野生型釀酒酵母菌株，兩者對(duì)比的生長(zhǎng)表型如圖I所示。左邊為沒有加糠醛的對(duì)照SC培養(yǎng)基。每個(gè)平板上的樣品從左到右均為未稀釋的細(xì)胞過夜培養(yǎng)物及其5個(gè)依次10倍稀釋的細(xì)胞溶液樣品。實(shí)施例2釀酒酵母缺失菌株KKSC2的耐糠醛性實(shí)驗(yàn)
取釀酒酵母缺失菌株KKSC2在液體YPD培養(yǎng)基里30°C條件下過夜培養(yǎng)8_12h，然后將所得培養(yǎng)物調(diào)至0D600 值為2. 0，得到培養(yǎng)物待用。YPD培養(yǎng)基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物和野生型釀酒酵母菌株，以蒸餾水為溶液，別按十倍的濃度依次將它們稀釋5次，得到5個(gè)濃度依此遞減的細(xì)胞稀釋溶液，并分別標(biāo)號(hào)備用。從KKSC2和野生型釀酒酵母菌株5個(gè)稀釋后的細(xì)胞溶液樣品中分別取3 μ L點(diǎn)接到不含或者含IOmM糠醛的SC固體培養(yǎng)基上，在30°C條件下平板培養(yǎng)48h。SC固體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和瓊脂20g/L。以不添加糠醛的細(xì)胞溶液為對(duì)照培養(yǎng)基，經(jīng)檢測(cè)可知KKSC2耐糠醛的能力明顯優(yōu)于野生型釀酒酵母菌株，如圖I所示。實(shí)施例3釀酒酵母缺失菌株KKSC3的耐糠醛性實(shí)驗(yàn)
取釀酒酵母缺失菌株KKSC3在液體YPD培養(yǎng)基里30°C條件下過夜培養(yǎng)8_12h，然后將所得培養(yǎng)物調(diào)至0D600 值為2. 0，得到培養(yǎng)物待用。YPD培養(yǎng)基酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。取培養(yǎng)得到的培養(yǎng)物和野生型釀酒酵母菌株，以蒸餾水為溶液，分別按十倍的濃度依次將它們稀釋5次，得到5個(gè)濃度依此遞減的細(xì)胞稀釋溶液，并分別標(biāo)號(hào)備用。從KKSC3和野生型釀酒酵母菌株5個(gè)稀釋后的細(xì)胞溶液樣品中分別取3 μ L點(diǎn)接到不含或者含IOmM糠醛的SC固體培養(yǎng)基上，在30°C條件下平板培養(yǎng)48h。SC固體培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，不含氨基酸的酵母氮源6. 7g/L和瓊脂20g/L。以不添加糠醛的細(xì)胞溶液為對(duì)照培養(yǎng)基，經(jīng)檢測(cè)可知KKSC3耐糠醛的能力明顯優(yōu)于野生型釀酒酵母菌株，如圖I所示。
權(quán)利要求
1.釀酒酵母缺失菌株KKSC1,其分類命名為cererisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012037。
2.釀酒酵母缺失菌株KKSC2,其分類命名為cererisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012038。
3.釀酒酵母缺失菌株KKSC3,其分類命名為cererisae,已保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)CCTCC NO M 2012039。
4.如權(quán)利要求1、2或3所述釀酒酵母缺失菌株的基因，其特征是所述菌株CCTCCNO M 2012037 缺失基因 SJZ/，CCTCC NO M 2012038 缺失基因 CCTCC NO M 2012039 缺失基因SAP30, SIZU DEPl和SAP30三個(gè)基因的缺失具有提高微生物的耐糠醛的能力；SIZl基因核苷酸序列為SEQ NOl所示，DEPl基因核苷酸序列為SEQ N02所示，SAP30 基因核苷酸序列為SEQ N03所示。
5.權(quán)利要求1、2或3所述釀酒酵母缺失菌株在耐糠醛方面的應(yīng)用，其特征是KKSC1、 KKSC2、KKSC3的耐糠醛性在纖維素乙醇生產(chǎn)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種釀酒酵母缺失菌株及其在耐糠醛方面的應(yīng)用，提供了這種缺失菌株的篩選方法，驗(yàn)證了它在耐糠醛方面的應(yīng)用，屬于生物能源技術(shù)開發(fā)技術(shù)領(lǐng)域。其提供的三個(gè)耐受糠醛基因缺失菌株可以應(yīng)用于搖瓶和發(fā)酵罐里，研究釀酒酵母菌利用含有糠醛的纖維素酸解液發(fā)酵生成乙醇的能力，為纖維素酒精工業(yè)提供高產(chǎn)優(yōu)良基因工程菌株。此外，它們還可以用于研究釀酒酵母菌耐受糠醛的分子機(jī)理。其篩選過程規(guī)模大，效率高，篩選出的菌株切實(shí)提高了糠醛的耐受能力。
文檔編號(hào)C12N1/18GK102586127SQ20121006082
公開日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月9日
發(fā)明者蔣伶活 申請(qǐng)人:江南大學(xué)