專利名稱：骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
I.骨髓間質(zhì)干細胞功能
骨髓中包含兩種完全不同的干細胞造血干細胞和間質(zhì)干細胞(mesenchymal stemcellS，MSCS)，前者維持造血，而后者則構(gòu)成了骨髓造血的微環(huán)境。這兩種獨立而且完全不同的干細胞不僅共存而且在功能上互相協(xié)作，共同完成成人體內(nèi)血液系統(tǒng)的再造。除骨髓夕卜，其他組織也存在少量MSCs，但成人中骨髓中含量最多，約占其有核細胞0. 001 0. 01%,因此骨髓是較為適合的MSCs來源。1970年Friedenstein通過成纖維細胞集落形成單位試驗在體外證明了 MSCs的存在；經(jīng)過長期的研究，人們對其功能已有了比較深入的了解。骨髓MSCs為多潛能的成體基質(zhì)細胞，能分化為多種間質(zhì)起源的組織，如成骨、軟骨和脂肪細胞；在特殊環(huán)境下，還能橫向分化為肌細胞、神經(jīng)細胞、血管內(nèi)皮細胞、肝胰細胞等多種其他組織細胞。MSCs對多種損傷組織具有替代修復(fù)作用，植入體內(nèi)后可在多種造血以外的組織如肺、骨、軟骨和皮膚等處定位和分布。除了分化作用外，骨髓MSCs還具有較強的免疫調(diào)控能力，對T、B、樹突狀細胞和NK細胞均有調(diào)節(jié)性抑制作用。研究表明，MSCs可抑制T細胞增殖，引起T細胞分化停滯，并可抑制T細胞活化,下調(diào)相應(yīng)肽段對幼稚性(naive)及記憶性抗原特異T細胞效應(yīng),誘導(dǎo)T細胞失能(anergy);此外MSCs還可誘導(dǎo)產(chǎn)生調(diào)節(jié)性T細胞來進行調(diào)控。MSCs可抑制B細胞增殖(B細胞/MSCs為1:1時作用最強，而達1:5或1:10時作用消失)，抑制B細胞分化并影響B(tài)細胞趨化(與MSCs共培養(yǎng)后B細胞表達趨化因子CXCR4、CXCR5和CXCR7受體減少，從而出現(xiàn)趨化能力缺陷)。對于樹突狀細胞，MSCs可抑制其增殖及分化成熟，可阻止單核細胞和骨髓前體細胞分化為樹突狀細胞，抑制⑶la、⑶40、⑶80、⑶86及HLA-DR上調(diào)，使細胞維持未成熟狀態(tài)；MSCs還可改變其細胞因子分泌能力，從而影響樹突狀細胞功能。MSCs同樣能夠抑制NK細胞的增殖，其表面存在多種成分可影響NK細胞活化(包括NKG2D配體如MICA、ULBPs 和 DNAM-I 配體如 PVR、nectin-2)。2.間質(zhì)干細胞應(yīng)用現(xiàn)狀
MSCs可在造血干細胞niche中分泌細胞因子起支持作用，并且降低外周血單個核細胞同種免疫刺激活性，從而促進造血干細胞移植后造血系統(tǒng)重建。2000年，首項臨床試驗顯示，28例女性乳腺癌患者在接受自體造血干細胞移植時給予MSCs單次輸注，其造血恢復(fù)加快且無副反應(yīng)。2005年另一項多中心研究也顯示46例患者同時行異基因造血干細胞和MSCs治療后多數(shù)造血恢復(fù)加快，未發(fā)現(xiàn)副作用。
2004年，Le Blanc報道首個MSCs治療移植物抗宿主病(GVHD)病例，患兒為淋巴細胞白血病患者，MSCs由其母親提供，于造血干細胞移植70天和170天時分別輸注I次，患兒癥狀改善，膽紅素水平下降。2008年，Le Blanc報道了 MSCs治療重度難治性GVHD II期臨床研究結(jié)果，共治療55例患者，結(jié)果30例患者完全緩解，另9例部分緩解。目前III期研究正在進行中。MSCs可同時修復(fù)心肌和血管組織、具有免疫調(diào)節(jié)活性，并且具有易培養(yǎng)擴增滿足移植需要的特點，這使其在心血管疾病治療中存在理論價值，目前已應(yīng)用于心肌梗塞、心肌缺血、心功能衰竭的治療。經(jīng)心肌直接注入是最常用的治療方式，初步研究顯示可改善心臟射血分數(shù)，提高患者生存率，但其療效和安全性尚有待對照研究加以證實。
MSCs在神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如多發(fā)性硬化、肌萎縮側(cè)索硬化)、成骨不全、皮膚創(chuàng)傷也有一些初步應(yīng)用。由于MSCs的靶向性，在動物研究中已有用于腫瘤治療的報道。3.自身免疫性疾病常規(guī)治療
自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫應(yīng)答反應(yīng)導(dǎo)致組織器官損傷和相應(yīng)功能障礙為主要發(fā)病機制的一類疾病。是臨床上常見的一大類疾病，目前已被公認的自身免疫性疾病至少有30多種。根據(jù)自身免疫反應(yīng)對組織器官造成損傷的范圍，通常將自身免疫病分器官特異與非器官特性兩大類。臨床上常見的自身免疫性疾病包括結(jié)締組織疾病類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎(JIA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬皮病(SSC)、系統(tǒng)性血管炎；神經(jīng)肌肉疾病多發(fā)性硬化癥(MS)、重癥肌無力(MG)、脫髓鞘疾病；內(nèi)分泌性疾病原發(fā)性賢上腺皮質(zhì)萎縮、慢性甲狀腺炎、青少年型糖尿??；消化系統(tǒng)疾病慢性非特異性潰瘍性結(jié)腸炎(Crohn病)、慢性活動性肝炎、惡性貧血與萎縮性胃炎；泌尿系統(tǒng)疾病自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出血性綜合征；血液系統(tǒng)疾病自身免疫性溶血性貧血、原發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)、特發(fā)性白細胞減少癥。自身免疫性疾病的常規(guī)治療方法有
(I)腎上腺皮質(zhì)激素是多數(shù)自身免疫性疾病最常用的治療藥物，具有較快抑制免疫反應(yīng)和較強的抗炎作用。近年采用的激素沖擊療法提高了危重癥的緩解率，但是激素也有不少副作用，長期應(yīng)用可以抑制下丘腦-垂體-腎上腺系統(tǒng)，垂體前葉分泌促腎上腺皮質(zhì)激素的量明顯減少，使腎上腺皮質(zhì)素分泌減少，皮質(zhì)腺出現(xiàn)萎縮，從而患者需要長期服用激素維持治療，并且他們的應(yīng)激能力減弱，容易出現(xiàn)感冒及各種感染，在受到外傷、冷風(fēng)刺激、精神刺激、手術(shù)治療其它疾病等應(yīng)激狀態(tài)時，由于體內(nèi)激素的分泌不足，一方面可能誘發(fā)自身免疫性疾病發(fā)生或加重，另一方面會出現(xiàn)疲乏無力，食欲減退，低血糖反應(yīng)，肌肉關(guān)節(jié)疼痛等腎上腺皮質(zhì)分泌激素不足的癥狀。此外，激素還可導(dǎo)致肥胖、多毛、高血壓、青光眼、糖尿病、消化道潰瘍、出血、精神癥狀、骨質(zhì)疏松、股骨頭壞死等。(2)免疫抑制劑自身免疫反應(yīng)對多數(shù)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，除激素外，臨床工作中往往還需應(yīng)用I 一數(shù)種免疫抑制劑以控制患者病情發(fā)展。常用的免疫抑制劑有環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、霉酚酸酯等，這些藥物的主要副作用有胃腸道反應(yīng)、血液系統(tǒng)損害、泌尿系統(tǒng)反應(yīng)、影響生育、脫發(fā)、增加腫瘤發(fā)生率等。大劑量人體免疫球蛋白靜脈注射通過抗體封閉作用治療激素和免疫抑制劑不能控制的難治性患者，國內(nèi)外均有成功經(jīng)驗，但此法對不同的病人療效差異很大，也有一定的毒副作用，價格昂貴，應(yīng)用受限。(3)造血干細胞移植盡管給予了激素和免疫抑制劑治療，仍有不少病人病情得不到控制或不能耐受常規(guī)治療帶來的嚴重不良反應(yīng)，這促使臨床工作者不斷探索新的治療方法。造血干細胞移植(HSCT)是近十余年來發(fā)展起來的一項治療手段，在治療自身免疫性疾病時主要采用了自體HSCT方式，其治療原理有兩方面，一是在預(yù)處理時，通過大劑量化療或全身照射摧毀患者的異常免疫系統(tǒng)，對自身免疫性疾病起緩解作用；二是移植的自體外周血干細胞以重建正常的免疫系統(tǒng)，在免疫重建中阻斷自身抗體的產(chǎn)生或誘導(dǎo)對自身抗原的免疫耐受。根據(jù)最新統(tǒng)計，目前全世界有近1000例難治性自身免疫性疾病患者接受了HSCT，其中包括SSc 190例，SLE 86例，PM/DM 14例，RA 86例，MS 368例，克羅恩病21例。由于自體免疫疾病自體HSCT后仍有部分患者病情不能控制，部分病例在術(shù)后復(fù)發(fā)，加之移植治療風(fēng)險較高，相關(guān)死亡率約為7 %，高于非自身免疫性疾病(3 % )，制約了該技術(shù)的廣 泛應(yīng)用。移植相關(guān)死亡率與具體病種相關(guān)，從高到低依次為SSc、SLE、MS和RA ;病例選擇、支持治療、預(yù)處理方案、是否去移植物中的淋巴細胞等也影響患者的存活率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。所述的自身免疫性疾病是指包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、系統(tǒng)性硬化癥、混合性結(jié)締組織病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、自身免疫性溶血性貧血、炎性腸病、白塞病、原發(fā)性膽汁性肝硬化等在內(nèi)的一大類疾病。本發(fā)明中，所述自身免疫性疾病尤其是指系統(tǒng)性硬化癥、克羅恩病、多發(fā)性肌炎/皮肌炎、難治性自身免疫性溶血性貧血、混合性結(jié)締組織病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、白塞病或原發(fā)性膽汁性肝硬化。所述的骨髓間質(zhì)干細胞以如下方法制備
(1)取髂后上棘為穿刺點，用肝素稀釋液接入穿刺針接口，緩慢抽取骨髓，并用PBS稀
釋；
(2)向淋巴細胞分離液(Ficoll)中加入經(jīng)過步驟(I)所述骨髓的稀釋液,離心后，吸出灰白色的淋巴細胞，然后用PBS洗滌；
(3)在37°C、5%CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中，將步驟(2)得到的淋巴細胞，用含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后首次換液，去掉非貼壁細胞，以后每三天以L-DMEM完全培養(yǎng)液換液。(4)培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代，用PBS洗滌細胞，用胰酶消化，PBS洗滌后，置37°C、5 %C02、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中用L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)。(5)取各代骨髓間質(zhì)干細胞測定細胞表面標(biāo)記并測定其核型，得具有間質(zhì)干細胞特征且染色體核型正常的骨髓間質(zhì)干細胞。 發(fā)明人通過調(diào)研大量的案例，發(fā)現(xiàn)自身免疫性疾病患者的骨髓MSCs存在異常，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。例如系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓MSCs體外生長較正常人緩慢，易衰老，傳代過程(10代)中活力會逐漸喪失，白細胞介素6、7mRNA表達降低，并且MSCs存在細胞骨架異常。發(fā)明人最近的研究又發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡骨髓MSCs體外向脂肪及軟骨細胞的分化能力較正常明顯降低，移植到裸鼠體內(nèi)成骨也明顯下降。另外，還發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的骨髓MSCs和正常人外周血單個核細胞在體外共培養(yǎng)時，刺激調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)上調(diào)的能力也明顯低于正常MSCs。由于自身免疫性疾病患者存在MSCs異常，因此，自身免疫性疾病不僅是“造血干細胞病”，而且也是“間質(zhì)干細胞病”。這也是為什么自體HSCT治療自身免疫性疾病復(fù)發(fā)率高的原因，而異體HSCT存在的高排斥反應(yīng)、高死亡率和高費用又限制了它的臨床應(yīng)用。因為骨髓MSCs有獨特的免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)作用，所以能應(yīng)用于制備治療自身免疫性疾病藥物中。本發(fā)明提出骨髓MSCs在制備治療自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用。采用骨髓MSCs制備獲得的治療自身免疫性疾病的藥物與自身免疫性疾病常規(guī)治療藥物相比較，具有以下優(yōu)點骨髓MSCs作為治療自身免疫性疾病藥物的活性成分，有獨特的免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)作用，用于治療自身免疫性疾病具有“治療方便、療效持久”的特點，能幫助患者減少藥物治療的種類和數(shù)量以及藥物帶來的各種副作用，甚至可能停用免疫抑制劑等藥物治療，降低死亡率和致殘率，改善患者生活質(zhì)量；同時，以骨髓MSCs為活性成分的治療自身免疫性疾病的藥物較其他新型的生物制劑費用低，多數(shù)患者具有相應(yīng)的經(jīng)濟能力。因此骨髓MSCs在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用具有巨大的社會和經(jīng)濟效益。


圖I和圖2表示克羅恩病患者骨髓MSCs移植前后腸鏡變化，其中圖I表示移植前羅恩病患者腸鏡照片，圖2表示移植后半月羅恩病患者腸鏡照片；
圖3和圖4表示皮肌炎患者骨髓MSCs治療前后肌肉核磁共振(MRI)變化，其中圖3表示骨髓MSCs治療前皮肌炎患者肌肉MRI，圖4表示骨髓MSCs治療后皮肌炎患者肌肉MRI。
具體實施例方式實施例I骨髓間質(zhì)干細胞體外分離、培養(yǎng) (一)細胞的來源
用于輸注治療自身免疫性疾病患者的MSCs來源于異體骨髓單個核細胞經(jīng)體外擴增培養(yǎng)而成。(二)細胞的采集
I所用設(shè)備，材料，試劑
超凈工作臺、層流潔凈床、肝素、注射用生理鹽水、一次性空針和骨髓穿刺包。2骨髓的采集方法
(I)紫外線消毒超凈工作臺30 min。(2)超凈臺內(nèi)配置肝素-生理鹽水以I ml生理鹽水加入65. 5 U的肝素。(3)骨髓捐獻者俯臥于層流潔凈床上，取髂后上棘為穿刺點，常規(guī)消毒鋪洞巾，用骨髓穿刺針穿刺，固定后，20ml注射針管抽肝素稀釋液5ml，接入穿刺針接口，緩慢抽骨髓至20ml刻度處，共抽取2支空針。(三)骨髓MSCs分離與培養(yǎng) I所用設(shè)備、材料和試劑
超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、水平式離心機、恒溫水浴箱、高壓蒸氣滅菌鍋、細胞培養(yǎng)皿(HO Cm)、離心管(50ml)和吸管(5ml，IOml)。、
淋巴細胞分離液(Ficoll) L-DMEM培養(yǎng)液、肽牛血清、PBS液和胰酶。2骨髓MSCs原代分離、培養(yǎng)
(1)取50ml離心管2支，每管加入骨髓液20ml，用PBS稀釋一倍待用；
(2)取50ml離心管4支，每管加入20 ml Ficoll淋巴細胞分離液(比重I. 077);
(3)沿管壁緩慢向淋巴細胞分離液(Ficoll)中加入經(jīng)過稀釋后的骨髓液，每管加稀釋骨髓液20ml ；
(4)將步驟3中所得混合物離心(常溫2000rpm, 30min)；
(5 )用吸管插入步驟(4)所得樣品的中間淋巴細胞層，輕輕吸出灰白色的淋巴細胞至另一離心管中，加PBS至40 ml，混勻，離心(常溫1000 rpm，5min)后棄上清，PBS重復(fù)洗滌一次;
(6)將分離的細胞用L-DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)調(diào)整細胞濃度為5X IO6個細胞/ml，然后接種于培養(yǎng)皿中，置37°C、5% CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
(7)24 h后首次換液，去掉非貼壁細胞，以后每3d以L-DMEM完全培養(yǎng)液換液。3骨髓MSCs傳代
(1)培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代；
(2)吸除培養(yǎng)皿內(nèi)舊培養(yǎng)液，加入PBS，輕輕搖動培養(yǎng)皿，以洗去殘留在內(nèi)的培養(yǎng)液，吸除 PBS ；
(3)培養(yǎng)皿內(nèi)加入胰酶2ml，輕輕搖動培養(yǎng)皿，使消化液流遍所有細胞表面；在倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)回縮，細胞間隙增大后，應(yīng)立即加入完全培養(yǎng)液2ml終止消化；
(4)反復(fù)吹打瓶壁細胞，細胞脫離瓶壁后形成細胞懸液；
(5)將細胞懸液吸入離心管，離心(常溫1000rpm，5min)，棄上清，PBS稀釋后洗滌棄上
清；
(6 )用L-DMEM完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為5X IO6個細胞/ml，然后接種于培養(yǎng)皿中，每瓶8 ml ;置37°C、5 %C02、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。(7)傳至第三代(P3)時收集細胞備用。4骨髓MSCs細胞凍存
(1)消化貼壁細胞，步驟同3中的(I)-(5)；
(2)加入0.Iml 二甲基亞砜(DMS0)，0. 9ml胎牛血清，移入細胞凍存管；
(3)凍存細胞(4°C，1小時;-20°C，4小時;-70°C，12小時，液氮罐保存)。5骨髓MSCs細胞復(fù)蘇
(1)取出凍存管，立即放入37°C水浴中，搖動，Imin內(nèi)迅速解凍；
(2)吸管吸出細胞懸液，放入50ml離心管，加入40ml
(3)離心(常溫1000rpm, 5min),棄上清，重復(fù)一次；
(4)加入L-DMEM完全培養(yǎng)液接種于培養(yǎng)皿中，
(四)骨髓MSCs的鑒定
I細胞總數(shù) 測量并確定細胞懸液的總體積。充分混勻后，吸取0. Iml細胞懸液滴于細胞計數(shù)板上，計數(shù)。計算出細胞總數(shù)。2活細胞比例進行臺盼藍染色，計數(shù)采集細胞中活細胞所占比例。3流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志 取各代骨髓MSCs用與異硫氰熒光素(FITC)(中文名，全稱)或藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的⑶14、⑶29、⑶34、⑶44、⑶45、⑶105作用，流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示⑶14、⑶14和⑶45為陰性，⑶29、⑶44和⑶105為陽性，呈現(xiàn)為間質(zhì)干細胞的特征。4骨髓MSCs染色體核型測定
取各代骨髓MSCs，培養(yǎng)上清中加入秋水仙素使其最終濃度為liig/ ml，繼續(xù)培養(yǎng)30min,棄上清，1%枸櫞酸鈉低滲液處理50min,用固定液(甲醇冰乙酸3:1)固定,原位收獲細胞，45°C烤片過夜，胰酶法G顯帶。每例標(biāo)本計數(shù)15個中期分裂相，分析5個核型。該染色體核型檢測結(jié)果顯示正常染色體核型。
實施例2骨髓MSCs的給藥方法 (一)骨髓MSCs使用前最終鑒定 I無菌試驗
如培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)任何異常，常規(guī)在骨髓MSCs輸注患者前3天，最后一次換液后，對每一培養(yǎng)瓶中的上清液作無菌試驗，培養(yǎng)細菌和霉菌。無菌試驗按《中國生物制品規(guī)程(1995)))的規(guī)定進行。細胞上清液不得有細菌、霉菌生長。2外觀及鏡下觀察
在輸注的當(dāng)天，如無菌試驗報告無細菌、霉菌生長，對培養(yǎng)瓶中的上清液進行顏色觀察，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、細胞密度、有無細菌或霉菌生長。如有可疑，須再次抽樣作無菌試驗培養(yǎng)細菌、霉菌。3活細胞比例
輸注當(dāng)天對收集的細胞懸液抽樣檢查活細胞比例占95%以上。4染色體核型
骨髓MSCs輸注前3天抽樣行染色體核型檢查應(yīng)為正常染色體核型。5表面標(biāo)志
骨髓MSCs輸注前3天抽樣行表面標(biāo)志測定⑶14、⑶34、⑶45表達陰性KD29、⑶44、CD45表達陽性。(二)骨髓MSCs的給藥方法 I所用設(shè)備，材料，試劑
超凈工作臺離心機一次性注射器注射用生理鹽水人血白蛋白 2輸注前操作
當(dāng)細胞總數(shù)量達到(I 2) X 107kg體重，可考慮輸注準(zhǔn)備
⑴輸注前抽樣留取細胞培養(yǎng)上清液作細菌、真菌培養(yǎng)、支原體檢測及內(nèi)毒素測定；
[2)輸注前抽樣取細胞，計數(shù)細胞濃度、活細胞比例、細胞表面標(biāo)志、細胞染色體核型測定，具體見骨髓MSCs的鑒定。3輸注操作
[I]胰酶消化所有細胞(操作同前)，離心(常溫1000 rpm，5min)，棄上清，反復(fù)充分洗滌；加入含5%人血白蛋白的生理鹽水100ml，輸注的細胞懸液中僅殘留不足0. 5%的細胞培養(yǎng)液。抽取0. Iml細胞懸液計數(shù)。標(biāo)明患者姓名，準(zhǔn)備輸注。[2:1細胞輸注前半小時給患者靜脈甲強龍40mg。[31開放手背靜脈，用輸血器輸入少量生理鹽水，通暢后連接裝有細胞的分離袋，調(diào)
整輸注速度，輸注過程中觀察患者反應(yīng)，及時對癥處理。整個過程耗時約15分鐘。
實施例3骨髓MSCs在制備治療不同自身免疫性疾病的藥物中的應(yīng)用 (一)骨髓MSCs在制備治療系統(tǒng)性硬化癥的藥物中的應(yīng)用
I.病例入選標(biāo)準(zhǔn)I)確診為系統(tǒng)性硬化癥，2)已用激素和I種以上免疫抑制劑治療半年以上，無明顯療效者，3)簽署知情同意書同意MSCs治療。2.排除標(biāo)準(zhǔn)1)患者存在嚴重的感染，2)疾病終末期，已出現(xiàn)重要臟器功能嚴重受損。3.移植方案骨髓MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為I X 106/kg體重。4.治療評價共治療6例患者，其中男性4例。移植前、移植后I月、3月、12月對患者內(nèi)臟損傷及皮膚硬化記分進行評估，結(jié)果顯示患者心、肺、腎功能保持穩(wěn)定，皮膚積分逐步改善，皮膚潰瘍愈合加速。5.典型病例
汪XX，女，45歲，因“雙手指腫脹、僵硬七年伴胸悶、氣喘半年”入院(2008-01-15)?；颊咂吣昵盁o明顯誘因下出現(xiàn)雙手遇冷發(fā)白、發(fā)紫現(xiàn)象，覺雙手麻木，漸出現(xiàn)對稱性手指腫脹僵硬，手指皮膚繃緊感，伴手指間關(guān)節(jié)晨僵、疼痛，癥狀逐漸加重，于本院診斷“系統(tǒng)性硬化癥”，一直給予強的松、愛若華口服，環(huán)磷酰胺0. 4g靜脈滴注，半月余一次，雙手指間關(guān)節(jié)疼痛漸消失，癥狀無進展。近半年出現(xiàn)“面具臉”，半年前始出現(xiàn)無誘因下心慌，并出現(xiàn)活動后胸悶、氣喘，夜間平臥覺呼吸困難，漸出現(xiàn)雙下肢、足踝處浮腫，伴腹脹、納差等不適，查體見面部、頸項皮膚可見少量毛細血管擴張，雙下肢浮腫，左下肢可見皮膚潰破，雙手指腫脹，指端紫紺，皮膚彈性減退，握拳受限，輔檢示抗核抗體顆粒型強陽性，抗RNP陽性，心臟彩超提示肺動脈高壓87mmHg?；颊呦群笮醒獫{置換三次并聯(lián)合激素、CTX治療療效不佳，于2008-01-23行異基因骨髓間質(zhì)干細胞移植術(shù)(供體為患者丈夫)，共輸細胞數(shù)6 X 107，術(shù)后患者皮膚變軟，左下肢皮膚潰破較前變淺。(二)骨髓MSCs在制備治療克羅恩病的藥物中的應(yīng)用
I.病例入選標(biāo)準(zhǔn)1)確診為克羅恩病，2)已采用常規(guī)方法(激素和I種以上免疫抑制齊U)治療半年以上，療效不佳者，3)簽署知情同意書同意MSC治療。2.排除標(biāo)準(zhǔn)并發(fā)嚴重感染的患者。3.移植方案骨髓MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為I X 106/kg體重。4.治療評價共治療3例患者，均為男性。移植前、移植后I月、3月、12月對患者癥狀進行評估，并進行腸鏡檢查。結(jié)果顯示患者腹痛、腹瀉癥狀減輕，腸部潰瘍愈合，一例腸瘺患者分泌物明顯減少。5.典型病例
陳X，男性，27歲，因“雙髖疼痛十二年，反復(fù)解稀糊便半年”入院(2008-04-17)?；颊呤嗄昵盁o明顯誘因出現(xiàn)腰骶部、髖部關(guān)節(jié)疼痛，靜止休息時較嚴重，活動后稍有改善，后病情進展，關(guān)節(jié)疼痛加重，并有眼炎發(fā)作，骶髂關(guān)節(jié)X線示輕度骶髂關(guān)節(jié)炎，診斷為“強直性脊柱炎”，給予“甲氨喋呤、英太青、美卓樂、柳氮磺胺吡啶、益賽普”等治療，2007年10月出現(xiàn)反復(fù)腹瀉，大便呈稀糊樣，3-7次/天，量中，伴下腹部飽脹感，便后減輕，腸鏡提示多發(fā)潰瘍、糜爛，診斷“克羅恩病”。于2008年4月24日行異基因骨髓間質(zhì)干細胞移植術(shù)(供體為患者母親)，共輸細胞數(shù)6. 5X 107，術(shù)后無腹痛腹瀉，復(fù)查電子腸鏡顯示橫結(jié)腸至回腸末端處有多枚息肉形成，息肉大小不等，部分息肉表明潰爛，較入院前有明顯好轉(zhuǎn)。患者于2008年4月30日出院。出院后一周患者無腹痛腹瀉癥狀，復(fù)查電子腸鏡顯示回腸末端輕度息肉樣增生，降結(jié)腸部分區(qū)域間質(zhì)水腫，未見其他異常(如圖I和圖2)。(三)骨髓MSCs在制備治療多發(fā)性肌炎/皮肌炎的藥物中的應(yīng)用
I.病例入選標(biāo)準(zhǔn)1)確診為多發(fā)性肌炎/皮肌炎，2)已用激素和I種以上免疫抑制劑治療半年以上，無明顯療效者，3)簽署知情同意書同意骨髓MSCs治療。2.排除標(biāo)準(zhǔn)1)患者存在嚴重的感染，2)疾病終末期，已出現(xiàn)重要臟器功能嚴重受損。3.移植方案骨髓MSCs靜脈輸入，細胞數(shù)為I X 106/kg體重。4.治療評價共治療3例患者，其中男性2例。移植前、移植后I月、3月、12月對患者肌力、皮損情況進行評估，并行肌酶、肌肉MRI檢查判斷肌肉炎癥有無變化。結(jié)果顯示患者治療后肌無力癥狀改善，肌酶迅速下降并保持穩(wěn)定。5.典型病例
朱X X，男，21歲，因“反復(fù)四肢乏力伴皮疹一年余，加重一周”入院(2008-06-23)?；颊咭荒暧嗲笆軟龊蟾斜侨魈椋浜蟪霈F(xiàn)心悸胸悶，心電圖示心動過速，心肌酶譜CK-MB41U/L, CK496U/L，肌鈣蛋白陰性。隨后出現(xiàn)雙下肢水腫、乏力，查CK-MB 74U/L、CK2372U/L，超聲心動圖大致正常，甲狀腺功能正常，予利尿、營養(yǎng)心肌等治療好轉(zhuǎn)。一年前出現(xiàn)額頭、雙頰水腫性紅疹，皮疹為片狀，高出皮面，無搔癢疼痛，皮疹間皮膚發(fā)紅，皮疹無破潰，肌電圖提示肌源性改變，診斷為“皮肌炎”，一年來反復(fù)出現(xiàn)肌酶升高，最高達4000u/L左右，除激素外曾使用“驍悉、環(huán)磷酰胺沖擊、血漿置換”等治療，效果不顯著，一周前感活動后四肢乏力加重，右小腿酸痛明顯，入院后查體右下肢肌力2級，肌肉壓痛( + )，左下肢肌力
3級，肌張力正常，上肢肌力 4—級，輔查示ALT 241.9U/L，AST 171.8U/L，GGT 475. 2U/L,LDH1032U/L, CK 2007U/L, CK-MB 156U/L, a -HBDH 828. 9U/L (2008-06-25)。于2008年7月4日行異基因骨髓間質(zhì)干細胞移植術(shù)(患者父親供髓)，共輸細胞數(shù)為8X 107，術(shù)中無不適，術(shù)后I月，MRI示肌肉病變基本恢復(fù)正常(如圖3和圖4，治療前肌肉炎癥明顯，如箭頭所示)。隨訪情況如下表。目前此患者已能正常上學(xué)。權(quán)利要求
1.骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性肌炎和皮肌炎藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療多發(fā)性肌炎和皮肌炎藥物中的應(yīng)用，所述的骨髓間質(zhì)干細胞按照如下方法制備 (1)取髂后上棘為穿刺點，用肝素稀釋液接入穿刺針接口，緩慢抽取骨髓，并用PBS稀釋； (2)向淋巴細胞分離液中加入經(jīng)過步驟(I)所述骨髓的稀釋液液，離心后，吸出灰白色的淋巴細胞，然后用PBS洗滌； (3)在37°C、5%CO2、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱中，將步驟(2)得到的淋巴細胞，用含10%胎牛血清的L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，24 h后首次換液，去掉非貼壁細胞，以后每三天以L-DMEM完全培養(yǎng)液換液； (4)培養(yǎng)至貼壁細胞90%融合時，進行傳代，用PBS洗滌細胞，用胰酶消化，PBS洗滌后，置37°C、5 %C02、飽和濕度CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)中用L-DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)； (5)取各代骨髓間質(zhì)干細胞測定細胞表面標(biāo)記并測定其核型，得具有間質(zhì)干細胞特征且染色體核型正常的骨髓間質(zhì)干細胞。
全文摘要
本發(fā)明公開了骨髓間質(zhì)干細胞在制備治療自身免疫性疾病藥物中的應(yīng)用。自身免疫性疾病患者的骨髓間質(zhì)干細胞存在異常，在疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。骨髓間質(zhì)干細胞有獨特的免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)作用，所以能應(yīng)用于制備治療自身免疫性疾病藥物中。
文檔編號C12N5/0775GK102631368SQ201210061129
公開日2012年8月15日 申請日期2009年2月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月18日
發(fā)明者馮學(xué)兵, 孫凌云, 張華勇 申請人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院