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一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測及預(yù)警方法與流程

文檔序號:12413188閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種檢測甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR引物,其特征在于,所述的多重PCR引物包括引物對CP-F和CP-R、引物對VF和VR;其中,各引物對的序列如下:

CP-F:5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R:5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF:5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR:5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

2.一種甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法,其特征在于,包括以下步驟:

(1)提取甘薯塊根的總RNA和總DNA;

(2)以甘薯塊根總RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA;

(3)以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA和甘薯塊根總DNA為模板,利用多重PCR引物,進行PCR擴增;

(4)對PCR擴增產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)檢測結(jié)果進行判定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法,其特征在于,所述的多重PCR引物包括引物對CP-F和CP-R、引物對VF和VR;其中,各引物對的序列如下:

CP-F:5’—ACGAGTATGGCTGATAGCACTAA—3’

CP-R:5’—GTGAAGACCTGTTCCAGTCAACT—3’

VF:5’—GTAAGCGTGTTTGTGTGAAGT—3’

VR:5’—TCCATTCGGATCTTAGCAGTAGT—3’。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法,其特征在于,步驟(2)中反轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系為10μL:dNTP混合物(10mM each)1μL、5×反轉(zhuǎn)錄Buffer 2μL、200U/μL反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、40U/μL RNase抑制劑0.25μL、10μmol/μL引物CP-R 0.5μL、200ng/μL總RNA 5.75μL;

反應(yīng)程序為:42℃反轉(zhuǎn)錄40min,99℃5min,5℃5min。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法,其特征在于,步驟(3)中PCR擴增的反應(yīng)體系為20μL:Premix Ex TaqTM 10μL、10μmol/μL引物CP-F和10μmol/μL引物CP-R各為0.5μL、10μmol/μL引物VF和10μmol/μL引物VR各為1μL、cDNA 0.5μL、200ng/μL DNA 1μL,ddH2O補足20μL;

反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,57.6℃退火40s,72℃延伸50s,35個循環(huán);最后72℃延伸10min。

6.根據(jù)權(quán)利要求2-5任一項所述的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的多重PCR檢測方法,其特征在于,PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳判定結(jié)果為:當出現(xiàn)774bp大小的電泳條帶時,說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒;當出現(xiàn)194bp大小的電泳條帶時,說明甘薯塊根攜帶甘薯雙生病毒;當同時出現(xiàn)774bp和194bp兩個條帶時說明甘薯塊根攜帶甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒兩類病毒。

7.一種利用權(quán)利要求6所述的多重PCR檢測方法的甘薯塊根中甘薯褪綠矮化病毒和甘薯雙生病毒的預(yù)警方法,其特征在于,當電泳結(jié)果出現(xiàn)774bp和194bp任何一個條帶或同時出現(xiàn)兩個條帶時,說明甘薯塊根攜帶病毒,可判斷為不合格脫毒種薯,不能用于生產(chǎn)育苗。

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