本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種哌啶酮類生物堿化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：炎癥是機(jī)體對于刺激的一種防御性反應(yīng)，是具有血管系統(tǒng)的活體組織對損傷因子所發(fā)生的防御反應(yīng)。炎癥與動脈硬化、心臟病、中風(fēng)、癌癥、糖尿病等多種疾病密切相關(guān)，是引起多種疾病的重要因素。因此，抗炎是治療許多疾病的基礎(chǔ)。目前我國每年新增癌癥患者400多萬，死亡200多萬，雖然發(fā)病率與世界平均水平接近，但死亡率卻很高。隨著現(xiàn)代生活方式的改變和環(huán)境污染以及食品安全問題，使罹患癌癥人數(shù)持續(xù)升高。治療癌癥的藥物主要分為靶向藥和化療藥。雖然靶向藥物有效性高，但價格昂貴，同時靶向藥物并不是適合所有人，只有特定基因發(fā)生突變的患者才能使用；化療藥物毒副作用大，且容易出現(xiàn)繼發(fā)性耐藥現(xiàn)象，使治療效果隨著用藥時間的延長而大打折扣。因此，持續(xù)不斷地尋找高效低毒、不易出現(xiàn)耐藥的抗癌藥物一直是當(dāng)今醫(yī)藥學(xué)界的難題。天然產(chǎn)物仍然是新藥發(fā)現(xiàn)的重要源泉，自然界中存在的生物堿類化合物是一類具有很大成藥性的天然產(chǎn)物，如喜樹堿，小檗堿，利血平等都已成為臨床上頻繁使用的治療藥物。具有新結(jié)構(gòu)的新生物堿類化合物的發(fā)現(xiàn)對新藥研發(fā)具有特別的意義，它可能被直接或間接地(以此為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾和改造)開發(fā)成某種藥物。民族藥是我國少數(shù)民族人民長期與疾病斗爭過程中積累的瑰寶，是人類文明的重要組成部分，從民族藥中尋找活性好的化合物是新藥研發(fā)的重要途徑之一。興安獨(dú)活(Heracleumdissectum)，也稱坎庫拉，是東北鄂倫春族的民族藥，也是當(dāng)?shù)厝藗兿矏鄣囊环N山野菜，但對其化學(xué)成分和藥理活性的研究報(bào)道極少。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種哌啶酮類生物堿化合物及其制備方法和應(yīng)用，能夠從興安獨(dú)活中提取分離哌啶酮類生物堿化合物，以用于抗炎和/或抗腫瘤。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：本發(fā)明哌啶酮類生物堿化合物分子式為C15H19NO4。進(jìn)一步地，其結(jié)構(gòu)式為：本發(fā)明制備方法，包括以下步驟：1)取興安獨(dú)活的干燥根進(jìn)行回流提取若干次，將提取液減壓濃縮，得到總浸膏或濃縮液；2)將總浸膏混懸于水中，得到浸膏液，浸膏液或濃縮液經(jīng)乙酸乙酯萃取若干次后分離出有機(jī)層，剩余水層通過正丁醇萃取若干次后合并萃取液，減壓除去正丁醇得到正丁醇萃取層；3)將正丁醇萃取層上樣于硅膠柱，以氯仿-甲醇系統(tǒng)作為洗脫液，按體積比(100:0)～(0:100)進(jìn)行梯度洗脫，對流出液進(jìn)行檢測，將洗脫液體積比為9:1的流份合并，除去溶劑，得到第一次過柱部分；4)將第一次過柱部分上樣于反相硅膠層析柱，以甲醇-水系統(tǒng)作為洗脫液，按體積比(0:100)～(100:0)進(jìn)行梯度洗脫，將洗脫液體積比為70:30的流份合并，除去溶劑，得到第二次過柱部分；5)將第二次過柱部分上樣于高效液相色譜分離柱，用流動相進(jìn)行等度洗脫，得到哌啶酮類生物堿化合物。進(jìn)一步地，步驟1)的回流提取中采用甲醇、水或體積分?jǐn)?shù)10～95％的乙醇作為提取劑，興安獨(dú)活的干燥根與提取劑的質(zhì)量體積比為1kg：(1～8)L；當(dāng)提取劑為甲醇或體積分?jǐn)?shù)10～95％的乙醇時，將得到的提取液中溶劑回收得到總浸膏；當(dāng)提取劑為水時，將提取液的體積濃縮至六分之一到十分之一，得到濃縮液。進(jìn)一步地，步驟1)中提取次數(shù)為1～6次，每次1～4小時。進(jìn)一步地，步驟2)中總浸膏和水的體積比為1:1～1:5。進(jìn)一步地，步驟2)中浸膏液或濃縮液直接經(jīng)過乙酸乙酯萃??；或者先依次經(jīng)石油醚和氯仿萃取后，再經(jīng)過乙酸乙酯萃?。幻看屋腿【堑润w積萃?。幻糠N溶劑分別萃取1～6次。進(jìn)一步地，步驟3)中梯度洗脫后每300～800mL收集一個流份；步驟4)中梯度洗脫后每200～500mL收集一個流份；步驟3)和步驟4)中對流出液均是進(jìn)行TLC檢測；步驟5)中等度洗脫的流速為3～6mL/min。進(jìn)一步地，步驟5)中流動相是甲醇-0.5％醋酸水系統(tǒng)或乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)，甲醇-0.5％醋酸水系統(tǒng)中甲醇、水和醋酸的體積比為14：86：0.5；乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)中乙腈、水和醋酸的體積比為11：89：0.5。如上所述的哌啶酮生物堿類化合物在制備抗炎或抗腫瘤藥物和/或保健品方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：本發(fā)明中的哌啶酮類生物堿化合物具有抗炎和抗腫瘤作用，本發(fā)明通過對小鼠RAW264.7細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了哌啶酮類新生物堿能非常有效地抑制細(xì)胞中一氧化氮的產(chǎn)生，且呈劑量依賴關(guān)系。本發(fā)明采用MTT法進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示哌啶酮類新生物堿化合物在藥物濃度為100μM時對小鼠RAW264.7細(xì)胞沒有毒性，這證明該類化合物是安全的。本發(fā)明通過對肝癌組織HepG2細(xì)胞克隆形成的影響實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該哌啶酮類新生物堿化合物具有抑制肝癌細(xì)胞生長的作用。本發(fā)明公開了一種哌啶酮類新生物堿的制備及其在抗炎和抗腫瘤方面的應(yīng)用，用該哌啶酮類新生物堿類化合物制備的藥物具有藥理活性強(qiáng)、安全性高、毒副作用小的特點(diǎn)。盡管該新生物堿的活性較好，但其在植物中的含量較低，并且與其他極性相似的化合物混雜在一起，難以分離純化，用本發(fā)明中的一系列色譜方法能夠簡單順利地將該化合物分離純化出來，尤其是最后一步采用親水色譜柱，是分離純化該化合物的最重要環(huán)節(jié)，因?yàn)椴捎闷胀∣DS色譜柱無法得到分離，同時采用本發(fā)明中的方法得到的化合物純度較高(＞98％)。本發(fā)明為制備抗炎和抗腫瘤藥物開拓了新的應(yīng)用領(lǐng)域?！靖綀D說明】圖1為本發(fā)明化合物1的1H-NMR圖譜；圖2為本發(fā)明化合物1的13C-NMR圖譜；圖3為本發(fā)明化合物1的DEPT圖譜；圖4為本發(fā)明化合物1的1H-1HCOSY圖譜；圖5為本發(fā)明化合物1的HMQC圖譜；圖6為本發(fā)明化合物1的HMBC圖譜；圖7為本發(fā)明化合物1的HR-ESIMS圖譜；圖8為本發(fā)明中化合物1對RAW264.7細(xì)胞毒作用；圖9為本發(fā)明中化合物1對肝癌細(xì)胞克隆形成的影響?！揪唧w實(shí)施方式】下面結(jié)合具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，所述是對本發(fā)明的解釋而不是限定。本發(fā)明新的哌啶酮類生物堿化合物的結(jié)構(gòu)式如下：本發(fā)明的制備方法，包括以下步驟：1)取一定質(zhì)量(kg)的興安獨(dú)活干燥根，用體積為興安獨(dú)活干燥根質(zhì)量1～8倍量的甲醇、體積分?jǐn)?shù)為10～95％的乙醇或水(L)在各自沸點(diǎn)附近加熱回流提取1～6次，每次1～4小時，當(dāng)提取劑為甲醇或體積分?jǐn)?shù)10～95％的乙醇時，合并提取液減壓回收除去溶劑，得到總浸膏，當(dāng)提取劑為水時，合并提取液并將其體積濃縮至六分之一到十分之一，得到濃縮液；2)將總浸膏混懸于水中，總浸膏和水的體積比為1:1～1:5，得到浸膏液，浸膏液或濃縮液分別依次用等體積的有機(jī)溶劑萃取，其中，第一次萃取時用石油醚對浸膏液或濃縮液進(jìn)行等體積萃取，之后每次萃取均是分離出上一次萃取后的有機(jī)層，將剩余的水層用有機(jī)溶劑等體積進(jìn)行下一次萃??；每種溶劑各萃取1～6次，合并萃取液，常壓或減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，分別得到各萃取層和水層。有機(jī)溶劑包括石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇等，且萃取次序?yàn)橄扔脴O性小的溶劑，再用極性大的有機(jī)溶劑，石油醚和氯仿可以省去。3)取正丁醇萃取層，通過采用柱層析純化等分離方法，得到本發(fā)明的哌啶酮類生物堿類化合物。柱層析包括以下三個階段：第一階段：將正丁醇萃取層上樣于硅膠柱，以氯仿-甲醇系統(tǒng)作為洗脫液，按體積比為(100:0)～(0:100)進(jìn)行梯度洗脫，每300～800mL收集一個流份，對流出液進(jìn)行TLC檢測，合并相同流份，常壓或減壓蒸干溶劑，共得到30個流份，分別命名為FrB1-FrB30，取其中的FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，作為第一次過柱部分；第二階段：將第一次過柱部分，上樣于反相硅膠層析柱，以甲醇-水系統(tǒng)作為洗脫液，按體積比(1:100)～(100:1)進(jìn)行梯度洗脫，每200～500mL收集一個流份，對流出液進(jìn)行TLC檢測，合并相同流份，減壓除去溶劑，得到2個亞流份，分別命名為FrB23.1-FrB23.2，將FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，作為第二次過柱部分；第三階段：將第二次過柱部分FrB23.2流份，上樣于高效液相色譜分離柱，分離得到哌啶酮類生物堿化合物。所述的高效液相色譜分離柱為江蘇漢邦的MegresC18柱，高效液相色譜分離是用示差折光檢測器，以甲醇-0.5％醋酸水系統(tǒng)或乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)作為流動相，按3～6mL/min進(jìn)行等度洗脫。其中，甲醇-0.5％醋酸水系統(tǒng)中甲醇、水和醋酸的體積比為14：86：0.5；乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)中乙腈、水和醋酸的體積比為11：89：0.5。本發(fā)明首次從興安獨(dú)活中發(fā)現(xiàn)了一個未見文獻(xiàn)報(bào)道過的新生物堿類化合物，并且具有較好的抗炎和抗腫瘤活性，有望直接或間接開發(fā)成具有抗炎或抗腫瘤的藥物；本發(fā)明哌啶酮類生物堿化合物可用于制備抗炎藥物和/或保健品，可用于制備抗腫瘤藥物和/或保健品。一種具有抗炎和抗腫瘤作用的藥物，將哌啶酮類生物堿化合物與藥用輔料制成藥用劑型；所述的藥用輔料為緩釋劑、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纖維素；所述的劑型為片劑、膠囊劑或丸劑。所述的緩釋劑為羥丙甲基纖維素和/或乳糖。實(shí)施例1一、哌啶酮類新生物堿的提取和萃取、分離1)取坎庫拉干燥根6kg，用體積量為坎庫拉干燥根質(zhì)量5倍的甲醇加熱回流提取3次，每次2小時，合并甲醇提取液減壓回收溶劑，得總浸膏；2)將總浸膏混懸于3倍量水中，用石油醚等體積萃取4次，然后依次經(jīng)氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等體積萃取，每種有機(jī)溶劑萃取4次，將有機(jī)層常壓或減壓蒸餾除去溶劑后分別得到石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和余下的水層。3)取正丁醇萃取層100g，上樣于硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每500mL收集一次，常壓蒸餾回收溶劑，TLC檢識合并相同流份，共得到30個流份(FrB1-FrB30)。4)FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，經(jīng)反相硅膠柱色譜，用甲醇-水按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每200mL收集一次，減壓除去溶劑，TLC檢識合并相同流份，得到2個亞流份(FrB23.1-FrB23.2)。5)然后FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，用半制備高效液相色譜儀，使用MegresC18色譜柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作為流動相等度洗脫(14:86)，流速為3mL/min，得到哌啶酮類新生物堿(保留時間為25min)。本發(fā)明通過理化常數(shù)和現(xiàn)代波譜學(xué)技術(shù)手段(HR-ESI-MS，1D-NMR，2D-NMR)鑒定化合物的結(jié)構(gòu)，化合物1為(S,E)-3-(4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenoxy)piperidin-2-one，我們將其命名為dissectumideA?；衔?的結(jié)構(gòu)鑒定過程如下所述。二、哌啶酮類新生物堿的結(jié)構(gòu)鑒定參見圖1至圖7，在圖1的1HNMR譜中，質(zhì)子δH6.69(1H,d,J＝7.9Hz),6.84(1H,d,J＝7.9Hz),6.98(1H,s)是三取代苯環(huán)的特征信號，分子中還存在一個甲氧基信號δH3.80(3H,3)和它的碳信號δC56.4。在圖1的1H譜和圖2的13CNMR譜中，質(zhì)子δH6.70(1H,d,J＝15.2Hz)和δH6.06(1H,m)和他們相應(yīng)的碳信號δC140.8andδC115.9表明有一個E構(gòu)型的雙鍵連接在苯環(huán)上，這在圖6的HMBC譜中也得到了證實(shí)：δH6.84(1H,d,J＝7.9Hz,H-9)和6.98(1H,s,H-11)的兩個質(zhì)子與δC140.8(C-13)的碳信號相關(guān)，δH6.70(1H,d,J＝15.2Hz,H-13)的質(zhì)子與δC128.9(C-10)的碳信號相關(guān)。圖3的DEPT譜和圖5的HMQC譜顯示有4個亞甲基，在圖4的1H-1HCOSY譜中，連氧亞甲基δH3.85(2H,m)與雙鍵質(zhì)子(δH6.06)相連，三個依次相連的亞甲基δH2.37(1H,m)and2.08(1H,m),δH2.02(1H,m)and1.91(1H,m),δH3.62(1H,m)and3.11(1H,m)連接在含氧次甲基上(δH3.83,δC69.4)，而亞甲基δH3.62(1H,m)and3.11(1H,m)和它相應(yīng)的碳δC55.1應(yīng)該連接在氮原子上。除了苯環(huán)、一個雙鍵和一個羰基共6個不飽和度外，還有一個不飽和度，它應(yīng)該是一個環(huán)，這個環(huán)應(yīng)該是3-O-哌啶-2-酮的結(jié)構(gòu)。其它位置的連接通過綜合解析HMBC譜得到確定，因此化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定為3-(4-(3-hydroxyprop-1-en-1-yl)-2-methoxyphenoxy)piperidin-2-one，即3-(2-甲氧-4-羥丙烯基)苯氧基哌啶-2-酮，這是一個未見文獻(xiàn)報(bào)道的新化合物，我們將其命名為dissectumideA?；衔?為無色油狀物，其圖7的HR-ESIMS顯示準(zhǔn)分子離子峰為[M+Na]+atm/z300.1211(calcd300.1206)，因此確定分子式為C15H19NO4。分子式顯示有7個不飽和度。紅外光譜顯示有芳香環(huán)吸收峰(1602,1512,1457,1417cm-1)和氨基吸收峰(3410cm-1)，以及酰胺羰基吸收峰(1685cm-1)。其結(jié)構(gòu)式如下所示，其1HNMR和13CNMR的數(shù)據(jù)見表1。表1本發(fā)明中化合物1的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)No.δHδC2—173.333.83(1H,m)69.442.37(1H,m),2.08(1H,m)30.352.02(1H,m),1.91(1H,m)24.463.62(1H,m),3.11(1H,m)55.17—148.886.69(1H,d,J＝7.9Hz)116.396.84(1H,d,J＝7.9Hz)122.010—128.9116.98(1H,s)110.912—149.2136.70(1H,d,J＝15.2Hz)140.8146.06(1H,m)115.9153.85(1H,m)58.1OCH33.80(1H,s)56.4藥物制備實(shí)施例1片劑的制備稱取1克化合物1，90克羥丙甲基纖維素，100克聚乙烯吡咯烷酮，85克乳糖，90克微粉硅膠，將化合物1與處方量的緩釋劑混合均勻，加入粘合劑聚乙烯比咯烷酮制粒，在40-70℃下烘干顆粒，在干顆粒中加入處方量的潤滑劑微粉硅膠，混勻，壓片即可。藥物制備實(shí)施例2膠囊劑的制備30克化合物1，加入糊精適量，混勻，85％乙醇制成顆粒，干燥，整粒，加微粉硅膠5g，混勻，裝入膠囊，制成1000粒，即得本發(fā)明膠囊劑，每粒0.035g。三、本發(fā)明的哌啶酮類生物堿的藥效實(shí)驗(yàn)1、體外抗炎實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)方法：將RAW264.7細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)24h后加入LPS(脂多糖)。接著不同組分別加入不同濃度的樣品(本發(fā)明化合物1和2、陽性藥物吲哚美辛)，空白組加入等體積vehicle。50μL細(xì)胞培養(yǎng)液混合等體積Griess試劑I加入上述96孔板中，接著加入Griess試劑II。酶標(biāo)儀測定各組樣品在546nm波長下的OD值，利用下列公式計(jì)算NO產(chǎn)生抑制率，并用SPSS軟件計(jì)算被測試樣品的半數(shù)抑制濃度(IC50值，μM)。NO抑制率(％)＝[1–(樣品組/空白組)]×100％。結(jié)果如表2所示：表2本發(fā)明化合物1對LPS刺激的細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果：表2的數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明中的化合物1具有很好的體外抗炎作用，對脂多糖LPS刺激小鼠RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO具有較好的抑制作用，其半數(shù)抑制濃度IC50為18.1±0.6μM，均優(yōu)于陽性對照藥物吲哚美辛的31.1±1.2μM。說明本發(fā)明中的哌啶酮類生物堿化合物1具有較好的抗炎作用。2、細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)化合物的細(xì)胞毒活性采用MTT法在RAW264.7細(xì)胞系測定，具體做法如下：細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中，接種于96孔板中，接種密度為5×104細(xì)胞/孔。溶于DMSO的不同濃度的樣品加入孔中，在37℃含有5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24或48小時后，吸掉培養(yǎng)基，每孔加入10μLMTT(4mg/mL)，培養(yǎng)4小時，培養(yǎng)完畢后每孔加入DMSO溶解形成的甲臜，與570nm處測定吸光度。結(jié)果見圖8所示。從化合物1的細(xì)胞毒活性結(jié)果來看，該化合物在100μM時對RAW264.7沒有細(xì)胞毒性，這說明該化合物是安全的，且對RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的抑制作用不是通過滅活細(xì)胞進(jìn)行的。3、對肝癌細(xì)胞克隆形成的影響細(xì)胞克隆是指單個細(xì)胞通過有絲分裂形成的細(xì)胞群體，其形成能力與腫瘤細(xì)胞的群體依賴性和增殖能力密切相關(guān)。克隆形成能力的大小可反映腫瘤細(xì)胞的成瘤能力和惡性程度，也是評價單細(xì)胞存活和增殖的良好指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法：分別把HepG2細(xì)胞用胰酶消化并吹打成單個細(xì)胞，懸浮于完全培養(yǎng)基中，將細(xì)胞懸液進(jìn)行梯度稀釋，接種于24孔板中，接種密度分別為150μL/孔，各設(shè)3個平行孔，每孔加化合物1，終濃度為50μM，將細(xì)胞于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4天后棄培養(yǎng)液，用PBS洗2次，4％多聚甲醛固定后用1％結(jié)晶紫染色，流水緩慢洗去染色液，空氣干燥，掃描細(xì)胞培養(yǎng)板。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：結(jié)果見圖9。結(jié)果分析：參見圖9，可以看出，利用哌啶酮類生物堿化合物dissectumideA作用4天后的肝癌細(xì)胞克隆形成率為零，而對照組克隆形成率為100％，故dissectumideA可有效抑制HepG2細(xì)胞克隆形成的能力，進(jìn)一步證實(shí)該新生物堿化合物對肝癌細(xì)胞增殖的抑制作用。實(shí)施例21)取坎庫拉干燥根6kg，用體積量為坎庫拉干燥根質(zhì)量4倍的70％乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，合并甲醇提取液減壓回收溶劑，得總浸膏；2)將總浸膏混懸于4倍量水中，用乙酸乙酯等體積萃取3次，然后經(jīng)正丁醇等體積萃取4次，將有機(jī)層常壓或減壓蒸餾除去溶劑后分別得到乙酸乙酯層、正丁醇層和余下的水層。3)取正丁醇萃取層100g，上樣于硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每500mL收集一次，常壓蒸餾回收溶劑，TLC檢識合并相同流份，共得到30個流份(FrB1-FrB30)。4)取FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，經(jīng)反相硅膠柱色譜，用甲醇-水按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每200mL收集一次，減壓除去溶劑，TLC檢識合并相同流份，得到2個亞流份(FrB23.1-FrB23.2)。5)然后取FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，用半制備高效液相色譜儀，使用MegresC18色譜柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作為流動相等度洗脫(14:86)，流速為3mL/min，得到哌啶酮類新生物堿(保留時間為25min)。實(shí)施例31)取坎庫拉干燥根6kg，用體積量為坎庫拉干燥根質(zhì)量6倍的水加熱回流提取1次，每次4小時，合并甲醇提取液減壓回收溶劑，得總浸膏；2)將總浸膏混懸于2倍量水中，用乙酸乙酯等體積萃取3次，然后經(jīng)正丁醇等體積萃取6次，將有機(jī)層常壓或減壓蒸餾除去溶劑后分別得到乙酸乙酯層、正丁醇層和余下的水層。3)取正丁醇萃取層100g，上樣于硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每800mL收集一次，常壓蒸餾回收溶劑，TLC檢識合并相同流份，共得到30個流份(FrB1-FrB30)。4)取FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，經(jīng)反相硅膠柱色譜，用甲醇-水按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每500mL收集一次，減壓除去溶劑，TLC檢識合并相同流份，得到2個亞流份(FrB23.1-FrB23.2)。5)然后取FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，用半制備高效液相色譜儀，使用MegresC18色譜柱，以甲醇和0.5％的醋酸水作為流動相等度洗脫(14:86)，流速為3mL/min，得到哌啶酮類新生物堿(保留時間為25min)。實(shí)施例41)取坎庫拉干燥根6kg，用體積量為坎庫拉干燥根質(zhì)量8倍的10％乙醇加熱回流提取6次，每次1小時，合并甲醇提取液減壓回收溶劑，得總浸膏；2)將總浸膏混懸于5倍量水中，用石油醚等體積萃取2次，然后依次經(jīng)氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等體積萃取2次，將有機(jī)層常壓或減壓蒸餾除去溶劑后分別得到石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和余下的水層。3)取正丁醇萃取層100g，上樣于硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每300mL收集一次，常壓蒸餾回收溶劑，TLC檢識合并相同流份，共得到30個流份(FrB1-FrB30)。4)取FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，經(jīng)反相硅膠柱色譜，用甲醇-水按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每400mL收集一次，減壓除去溶劑，TLC檢識合并相同流份，得到2個亞流份(FrB23.1-FrB23.2)。5)然后取FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，用半制備高效液相色譜儀，使用制備型MegresC18色譜柱，以乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)作為流動相等度洗脫(11:89)，流速為6mL/min，得到哌啶酮類新生物堿(保留時間為23min)。實(shí)施例51)取坎庫拉干燥根6kg，用體積量為坎庫拉干燥根質(zhì)量5倍的95％乙醇加熱回流提取4次，每次3小時，合并甲醇提取液減壓回收溶劑，得總浸膏；2)將總浸膏混懸于1倍量水中，用石油醚等體積萃取1次，然后依次經(jīng)氯仿，乙酸乙酯和正丁醇等體積萃取2次，將有機(jī)層常壓或減壓蒸餾除去溶劑后分別得到石油醚層、氯仿層、乙酸乙酯層、正丁醇層和余下的水層。3)取正丁醇萃取層100g，上樣于硅膠柱色譜，以氯仿-甲醇按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每600mL收集一次，常壓蒸餾回收溶劑，TLC檢識合并相同流份，共得到30個流份(FrB1-FrB30)。4)取FrB23流份，即洗脫液體積比為9:1的流份，經(jīng)反相硅膠柱色譜，用甲醇-水按體積比為100:0～0:100進(jìn)行梯度洗脫，每300mL收集一次，減壓除去溶劑，TLC檢識合并相同流份，得到2個亞流份(FrB23.1-FrB23.2)。5)然后取FrB23.2流份，即洗脫液體積比為7:3的流份，用半制備高效液相色譜儀，使用制備型MegresC18色譜柱，以乙腈-0.5％醋酸水系統(tǒng)作為流動相等度洗脫(11:89)，流速為6mL/min，得到哌啶酮類新生物堿(保留時間為23min)。對比例1將步驟5)中的流動相換成其它流動相或不同比例的相同流動相(或者色譜柱替換成普通反相色譜柱)，其它步驟和條件與實(shí)施例1相同。發(fā)現(xiàn)無法分離出哌啶酮類生物堿化合物。本發(fā)明公開了一種新的哌啶酮類生物堿化合物及其在抗炎和抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。所述的新哌啶酮類生物堿化合物具有顯著地抑制細(xì)胞中NO的產(chǎn)生，并能明顯地抑制腫瘤細(xì)胞的生長，因此可應(yīng)用于抗炎和抗腫瘤藥物的制備。所述的新的哌啶酮類生物堿化合物可制成藥學(xué)上可接受的任何一種制劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的哌啶酮類生物堿化合物，該化合物具有藥理作用強(qiáng)、安全性高的特點(diǎn)，為廣大炎癥和腫瘤患者提供了一種新的有效的、安全的藥物選擇。當(dāng)前第1頁1 2 3