本發(fā)明涉及硫化氫檢測技術(shù)，具體涉及7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2)及其合成方法，以及BDP-N2作為試劑在檢測H₂S中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

多年來，硫化氫一直被認為是有毒的、對環(huán)境有害的氣體。但近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)它在包括人類在內(nèi)哺乳動物體內(nèi)也廣泛存在，而且起著重要的生物學(xué)作用。H₂S已經(jīng)被認為是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第3種氣體信號分子，具有多種生理功能。在植物體內(nèi)，硫化氫發(fā)揮調(diào)節(jié)種子發(fā)芽，根系生長，葉子氣孔打開與閉合，以及細胞滲透壓，鹽壓等功能，在動物體內(nèi)，硫化氫的作用包括調(diào)制血壓，緩解缺血性再灌注損傷，發(fā)揮抗炎作用，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化應(yīng)激壓力，降低代謝率等。硫化氫水平的改變與多種疾病相關(guān)，如唐氏綜合征和阿爾茨海默氏病和心血管疾病等。例如，研究表明，患有Ⅱ型糖尿病的肥胖人群，血液中硫化氫濃度偏低。最新的研究發(fā)現(xiàn)，硫化氫具有降低癌癥發(fā)病率的作用。到目前為止，已經(jīng)有很多方法用來檢測體內(nèi)及體外硫化氫及硫氫根濃度，如：亞甲基藍法、氣相色譜及小分子熒光探針。其中，小分子熒光探針檢測由于其具有高靈敏度、高選擇性、非侵入性、操作簡便及實時成像的特征已被視為是最有前景的檢測技術(shù)。

在本發(fā)明中，設(shè)計合成了7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2)通過H₂S的硫解反應(yīng)前后熒光強度的變化，實現(xiàn)H₂S的檢測。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種近紅外H₂S檢測試劑及其合成方法，以及將該檢測試劑用于定量檢測H₂S，而且檢測時操作方便、選擇性高、靈敏度高。

本發(fā)明提供的一種H₂S檢測試劑，是7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2),英文名:7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-difluoro-10-(4-methoxyphenyl)-1,9-dimethyl-5H-4l4,5l4-dipyrrolo[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]diazaborinine-3,7-diyl)bis(ethene-2,1-diyl))bis(4,1-phenylene))bis(oxy))bis(4-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazole)，結(jié)構(gòu)式為：

BDP-N2的合成方法，步驟為：

1)在N₂保護下，往二氯甲烷中加入4-甲氧基苯甲醛(1eq.)，2,4-二甲基吡咯(2eq.)，攪拌條件下滴入幾滴三氟乙酸，室溫攪拌6-8h；然后加入溶解于二氯甲烷中的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(1eq.)溶液，再攪拌4-5h；加入過量三乙胺，15-20min后，在0℃下，滴加過量三氟化硼乙醚溶液，然后升溫至室溫再攪拌6-8h反應(yīng)完成。把反應(yīng)液倒入水中，用二氯甲烷萃取，合并有機相，加入Na₂SO₄除水，然后將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，然后柱色譜分離(石油醚：二氯甲烷＝4:1)得到桔紅色固體產(chǎn)物。

2)在N₂保護下，將上一步產(chǎn)物(1eq.)、4-羥基苯甲醛(1eq.)在哌啶和冰乙酸催化下在甲苯中回流4-6h，冷卻至室溫后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲苯，將反應(yīng)混合物用柱色譜分離(石油醚：乙酸乙酯＝7:5)得到深紅色固體4,4'-((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼雜環(huán)戊烯-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))二酚。

3)在適量乙醇中，加入上一步產(chǎn)物(1eq.)，4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(2eq.)再加入三乙胺(1.7eq.)室溫下攪拌14-16小時，然后將反應(yīng)液倒入水中并用二氯甲烷萃取，用氯化鈉溶液洗滌有機相，然后用無水Na₂SO₄除水，抽濾，然后將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，剩余固體用柱色譜分離(洗脫劑：二氯甲烷)得到BDP-N2。

本發(fā)明提供的一種快速檢測H₂S/HS^-的方法，是7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2)，在pH為7.4的PBS溶液中定量地檢測H₂S/HS^-的含量；具體步驟為：

(1)、配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液，配制2mM的BDP-N2的DMSO溶液；

(2)、將1000μL pH 7.4的PBS緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和5μL BDP-N2的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，隨著待測樣的加入，674nm的熒光強度逐漸增強；

(3)、將1000μL pH 7.4的PBS緩沖溶液、1000μL DMSO溶液和5μL BDP-N2的DMSO溶液加到另外六個熒光比色皿中，分別再加入體積為0、20、40、60、80、100μL的H₂S/HS^-溶液，在熒光分光光度儀上測定674nm對應(yīng)的熒光強度F為4.78、158.9、316.2、477.8、646.5、816.7，以H₂S濃度為橫坐標，以熒光強度F為縱坐標繪制圖，得到H₂S濃度的工作曲線；線性回歸方程為：F＝8.12c-2.6，c的單位為μM；

(4)、將1000μL pH 7.4的PBS緩沖溶液和1000μL DMSO溶液和5μLBDP-N2的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，用微量進樣器吸取VμL待測樣品溶液，加入到此干凈的熒光比色皿中，在熒光分光光度儀上檢測，將測得的熒光強度代入步驟(3)的線性回歸方程，得到濃度c，待測樣品C_待測樣＝2000μL×c×10^-6/VμL,即可求得H₂S的濃度。

該檢測方法對H₂S顯示了高的靈敏性和選擇性，檢測過程簡便、檢測結(jié)果準確。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果：1、本發(fā)明的檢測方法，對H₂S顯示了高的靈敏性和選擇性；3、對H₂S實現(xiàn)了近紅外檢測。

附圖說明：

圖1實施例1制備的BDP-N2的核磁氫譜圖

圖2實施例1制備的BDP-N2的核磁碳譜圖

圖3實施例1制備的BDP-N2的質(zhì)譜圖

圖4實施例2試劑與H₂S作用的熒光發(fā)射圖

圖5實施例3試劑與各種分析物的熒光柱狀圖

圖6實施例4測定H₂S的工作曲線

圖7實施例5測定樣品的熒光發(fā)射圖

具體實施方式：

實施例1

7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2)的合成及表征。

1)在N₂保護下，往二氯甲烷中加入4-甲氧基苯甲醛(3mmol，0.408g)，2,4-二甲基吡咯(6mmol，0.855g)，攪拌條件下滴入幾滴三氟乙酸，室溫攪拌6-8h；然后加入溶解于二氯甲烷中的2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌(3mmol，0.68g)溶液，再攪拌4-5h；加入9mL的三乙胺，15-20min后，在0℃下，滴加9mL三氟化硼乙醚溶液，然后升溫至室溫再攪拌6-8h反應(yīng)完成。把反應(yīng)液倒入水中，用二氯甲烷萃取，合并有機相，加入Na₂SO₄除水，然后將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，然后柱色譜分離(洗脫劑為石油醚：二氯甲烷＝4:1)得到桔紅色固體(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-3,7,9-三甲基-5H--4,5,-二吡咯并[1,2-c：2'，1'-f]2]二氮雜硼環(huán)三烯-1-基)甲基0.356g，產(chǎn)率33％。

2)在N₂保護下，將上一步產(chǎn)物(0.5mmol，0.177g)、4-羥基苯甲醛(0.5mmol，0.074g)在0.3mL哌啶和0.3mL冰乙酸催化下在甲苯中回流4-6h，冷卻至室溫后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去甲苯，將反應(yīng)混合物用柱色譜分離(石油醚：二氯甲烷＝7:5)得到深紅色固體4,4'-((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼雜環(huán)戊烯-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))二酚0.12g，產(chǎn)率21.2％。

3)在適量乙醇中，加入上一步化合物(0.18mmol，0.1g)，4-氯-7-硝基苯并-2-氧雜-1,3-二唑(0.36mmol，0.071g)，和三乙胺(0.3mmol，410μL)室溫下攪拌14-16小時，然后將反應(yīng)液倒入水中并用二氯甲烷萃取，用氯化鈉溶液洗滌有機相，然后用無水Na₂SO₄除水，抽濾，然后將二氯甲烷旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去，剩余固體用柱色譜分離(洗脫劑：二氯甲烷)得到目標化合物7,7'-((((1E,1'E)-(5,5-二氟-10-(4-甲氧基苯基)-1,9-二甲基-5H-4,5-二吡咯并[1,2-c:2',1'-f][1,3,2]二氮雜硼烷-3,7-二基)雙(乙烯-2,1-二基))雙(4,1-亞苯基)(4-硝基苯并[c][1,2,5]惡二唑)(BDP-N2)0.063g，產(chǎn)率：39.7％。

¹H NMR(600MHz,DMSO-d6.):δ8.64(d,J＝6Hz,2H),7.83(d,J＝6Hz,2H),7.71(d,J＝18Hz,2H),7.58(d,J＝18Hz,2H),7.52(d,J＝6hz,4H),7.38(d,J＝6Hz,2H),7.17(d,J＝12Hz,2H),7.03(s,2H),6.86(d,J＝12Hz,2H),3.86(s,3H),1.51(s,6H).(圖1)¹³C NMR(150MHz,DMSO-d6):δ159.85,157.18,153.29,152.73,151.63,145.29,144.30,142.13,139.78,135.46,135.27,133.20,130.41,129.44,125.78,121.49,118.76,118.66,118.45,115.08,114.56,110.02.(圖2)ESI-MS m/z:[M+H]⁺calcd for 889.23；Found 889.23.(圖3)

實施例2

配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液，并用DMSO配制2mM BDP-N2的溶液；把2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液及5μL BDP-N2的DMSO溶液加到熒光比色皿中，取H₂S的溶液，逐漸用微量進樣器加到此比色皿中，邊加樣邊在熒光分光光度儀上檢測，隨著HS^-的加入，674nm處熒光強度逐漸增強。熒光發(fā)射圖見圖4。

實施例3

配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液，并用DMSO配制2mM的BDP-N2溶液；在22個熒光比色皿中，各加入2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的試劑的DMSO溶液，再分別加入100μL H₂S，以及100μL(2×10^-2M)的各種分析物：F^-,Cl^-,Br^-,I^-,CN^-,NO₃^-,NO₂^-SO₃^2-,SCN^-,AcO^-,CO₃^2-,SO₄^2-,ClO₂^-,ClO₃^-,ClO₄^-,HS^-,CO₃^2-,PO₄^3-,HCO₃^-Cys,Hcy和GSH在熒光分光光度儀上檢測，繪制不同分析物對應(yīng)的674nm相對熒光強度的柱狀圖，(見圖5)。H₂S使得試劑的熒光強度由4.8變到816.7，其它的分析物基本沒有引起試劑熒光強度的變化。

經(jīng)實驗證明，其它分析物不干擾體系對、H₂S的測定。

實施例4

配制pH＝7.4、濃度為10mM的PBS緩沖溶液，并用DMSO配制2mM的BDP-N2溶液，用蒸餾水配制20mM的NaHS溶液；把2mL PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的試劑的DMSO溶液加到熒光比色皿中，分別再加入體積為0、20、40、60、80、100μL的HS^-溶液，在熒光分光光度儀上測定674nm對應(yīng)的熒光強度F為4.8、158.9、316.2、477.8、646.5、816.7，以H₂S濃度為橫坐標，以熒光強度F為縱坐標繪制圖，得到H₂S濃度的工作曲線(見圖6)；線性回歸方程為：F＝8.12c-2.6，c的單位為μM；

實施例5

配制pH＝7.4的PBS(10mM)緩沖溶液，配制20mM的NaHS水溶液，并用DMSO配制2mM的BDP-N2溶液；把2mL的PBS-DMSO(1:1，pH 7.4)溶液和5μL的BDP-N2的DMSO溶液加到干凈的熒光比色皿中，取NaHS的溶液90μL，用微量進樣器加到此比色皿中，同時在熒光光譜儀上測定674nm的對應(yīng)的熒光強度F為721，通過實施例4的線性回歸方程，求得c＝8.911×10^-5mol/L，偏差為0.98％。見圖7。