本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)基技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
關(guān)節(jié)軟骨主要是由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成的無血管組織，主要依靠關(guān)節(jié)的運(yùn)動(dòng)和擠壓吸收營養(yǎng)物質(zhì)，所以軟骨損傷后自我修復(fù)能力比較弱，其損傷后的修復(fù)移植一直以來是醫(yī)學(xué)界的難題之一。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，自體軟骨移植在軟骨損傷的臨床治療在國內(nèi)外都有應(yīng)用。臨床研究對(duì)患者組織取材有限，并且也因?yàn)檐浌羌?xì)胞是終末分化細(xì)胞，體外增殖能力有限且易去分化，所以對(duì)體外軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增成為目前要解決的關(guān)鍵。
中國專利申請(qǐng)CN104120105A公開了一種用于培養(yǎng)老齡人群軟骨細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加劑，添加劑濃度成分為：233μM-287μM維生素C，3.7μM-8.9μM亞油酸，9μM-17μM膽固醇，6nM-15nM地塞米松，43μM-58μM乙酰半胱氨酸，18μg/mL-32μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白，22nM-52nM亞硒酸鈉，13μM-24μM泛酸鈉，28μM-43μM生物素，7μg/mL-18μg/mL胰島素，2ng/mL-9ng/mL表皮生長因子，2ng/mL-9ng/mL成纖維生長因子，2ng/mL-9ng/mL血小板衍生生長因子，0.5％-2.5％人血清白蛋白。中國專利申請(qǐng)CN104480066A公開了一種軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基及軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法，該軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基包括：基礎(chǔ)培養(yǎng)基、濃度為5-20％的血清、濃度為1-20ng/ml的血小板源性生長因子和濃度為(1-5)*10-5M/Lβ-巰基乙醇。
現(xiàn)有的適用于軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基有的含有血清，因?yàn)檠迨怯珊芏啻笮〔煌锓肿咏M成的極為復(fù)雜的混合物，它能提供細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)所需要的生長因子、激素、結(jié)合蛋白，并提供保護(hù)作用；而且本身血清中還富含有絲分裂因子，也利于細(xì)胞系和原代培養(yǎng)。但血清培養(yǎng)基存在一定的弊端，無法規(guī)避動(dòng)物血清中的異源體，如果使用動(dòng)物血清培養(yǎng)基培育出來的細(xì)胞，會(huì)存在人體異源體排斥和沖突。有的培養(yǎng)基雖然不含血清，但是，存在價(jià)格昂貴的問題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基及其制備方法。本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基不含血清，排除了動(dòng)物來源的病原體污染，提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間，本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基的成本較低，有利于規(guī)模化應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案是：
一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子24-32ng/mL，聚賴氨酸7-10mg/mL，花生四烯酸2-5μM，維生素C10-15μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯5-8μg/mL，丁二胺5-9μM，胰島素7-9μg/mL，亞麻酸3-6μM，黃酮14-18μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白12-16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20-26μg/mL，胰高血糖素8-13μg/mL和纖黏連蛋白20-32ng/mL。
進(jìn)一步地，所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子28ng/mL，聚賴氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，維生素C12μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰島素8μg/mL，亞麻酸5μM，黃酮16μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纖黏連蛋白25ng/mL。
進(jìn)一步地，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640或IMEM培養(yǎng)基。
進(jìn)一步地，所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比8-10∶3-7∶1-3組成。
進(jìn)一步地，所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比9∶5∶2組成。
本發(fā)明的另一目的是提供所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯、丁二胺、胰島素、亞麻酸、黃酮、轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖黏連蛋白，攪拌20-40分鐘，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，繼續(xù)攪拌18-25分鐘，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4-7％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.0-7.3，滅菌溫度為117-122℃，滅菌時(shí)間為18-23分鐘，即得。
優(yōu)選地，所述步驟S1攪拌26分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S1繼續(xù)攪拌22分鐘。
優(yōu)選地，所述步驟S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的氫氧化鈉溶液。
優(yōu)選地，所述步驟S2調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.1。
優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌溫度為120℃。
優(yōu)選地，所述步驟S2滅菌時(shí)間為20分鐘。
本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，添加的添加劑包括細(xì)胞因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、維生素C和銀膠菊內(nèi)酯等。在本發(fā)明的各種培養(yǎng)基的成分中，基礎(chǔ)培養(yǎng)基能夠提供軟骨細(xì)胞的生存和最低的生理活動(dòng)。在本發(fā)明中，細(xì)胞因子主要作為維持軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)生存、增殖和分化所需的補(bǔ)充因子。在本發(fā)明中，聚賴氨酸和纖黏連蛋白共同作用，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的粘附，及其貼壁生長。在本發(fā)明中，花生四烯酸是細(xì)胞膜的主要成分，決定著細(xì)胞膜的生物活性。在本發(fā)明中，維生素C作為營養(yǎng)劑能夠參與細(xì)胞代謝，并且還起到抗氧化的作用。在本發(fā)明中，丁二胺能夠提供細(xì)胞膜合成所需的脂質(zhì)和細(xì)胞生長所需的水溶性脂質(zhì)。在本發(fā)明中，胰島素能夠促進(jìn)RNA、蛋白質(zhì)和脂肪酸的合成，抑制細(xì)胞凋亡。在本發(fā)明中，亞麻酸能夠提供細(xì)胞膜合成所需的脂質(zhì)，并且與本發(fā)明中的其他原料協(xié)同作用，能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，提高細(xì)胞產(chǎn)率。在本發(fā)明中，黃酮主要用作抗氧劑，能消除氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害，另外，還能夠與培養(yǎng)基中的其他原料協(xié)同作用，促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)鐵蛋白能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)鐵元素的代謝，通過細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體將鐵元素轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)；另外，它還可以與其他微量元素結(jié)合，從而調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的生長增殖與功能表達(dá)。在本發(fā)明中，聚乙烯吡咯烷酮能夠吸收酚類物質(zhì)，減輕酚類物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的毒害。在本發(fā)明中，胰高血糖素參與軟骨細(xì)胞的糖代謝、脂類代謝等，能調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖與功能表達(dá)。
研究發(fā)現(xiàn)，在無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中加入銀膠菊內(nèi)酯和黃酮，這兩種成分能與其他成分間協(xié)同作用，使軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度得到進(jìn)一步的提高。本發(fā)明無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基搭配合理，各成分間相互協(xié)調(diào)，共同作用，提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基具有以下優(yōu)勢(shì)：
(1)本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基不含血清，排除了動(dòng)物來源的病原體污染。
(2)本發(fā)明提供的是一種無動(dòng)物源性成分、成分確定的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，可以有效保證產(chǎn)品批次的質(zhì)量穩(wěn)定性，有利于產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)化。
(3)本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基的成本較低，有利于規(guī)模化應(yīng)用。
(4)本發(fā)明提供的無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基提高了軟骨細(xì)胞擴(kuò)增速度，大大縮短了軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的時(shí)間。
具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施方式的描述對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但這并非是對(duì)本發(fā)明的限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的基本思想，可以做出各種修改或改進(jìn)，但是只要不脫離本發(fā)明的基本思想，均在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
本發(fā)明中RMPI 1640培養(yǎng)基可購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，IMEM培養(yǎng)基可購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司，胰高血糖素可購自Sigma公司，聚賴氨酸可購自鄭州拜納佛生物工程股份有限公司，黃酮可購自哈爾濱百愛科技有限公司，銀膠菊內(nèi)酯購自Sigma公司。
實(shí)施例1、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子24ng/mL，聚賴氨酸7mg/mL，花生四烯酸2μM，維生素C10μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯5μg/mL，丁二胺5μM，胰島素7μg/mL，亞麻酸3μM，黃酮14μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白12μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮20μg/mL，胰高血糖素8μg/mL和纖黏連蛋白20ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為RMPI 1640培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比8∶7∶3組成。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯、丁二胺、胰島素、亞麻酸、黃酮、轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖黏連蛋白，攪拌20分鐘，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，繼續(xù)攪拌18分鐘，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.0，滅菌溫度為117℃，滅菌時(shí)間為18分鐘，即得。
實(shí)施例2、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子32ng/mL，聚賴氨酸10mg/mL，花生四烯酸5μM，維生素C15μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯8μg/mL，丁二胺9μM，胰島素9μg/mL，亞麻酸6μM，黃酮18μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白16μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮26μg/mL，胰高血糖素13μg/mL和纖黏連蛋白32ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比10∶3∶1組成。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯、丁二胺、胰島素、亞麻酸、黃酮、轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖黏連蛋白，攪拌40分鐘，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，繼續(xù)攪拌25分鐘，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.3，滅菌溫度為122℃，滅菌時(shí)間為23分鐘，即得。
實(shí)施例3、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子28ng/mL，聚賴氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，維生素C12μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰島素8μg/mL，亞麻酸5μM，黃酮16μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纖黏連蛋白25ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比9∶5∶2組成。
制備方法：
S1向基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子、聚賴氨酸、花生四烯酸、維生素C、銀膠菊內(nèi)酯、丁二胺、胰島素、亞麻酸、黃酮、轉(zhuǎn)鐵蛋白和纖黏連蛋白，攪拌26分鐘，加入聚乙烯吡咯烷酮和胰高血糖素，繼續(xù)攪拌22分鐘，得混合物；
S2向步驟S1所得混合物中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6％的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH至7.1，滅菌溫度為120℃，滅菌時(shí)間為20分鐘，即得。
對(duì)比例1、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子28ng/mL，聚賴氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，維生素C12μg/mL，連翹苷元6μg/mL，丁二胺7μM，胰島素8μg/mL，亞麻酸5μM，黃酮16μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纖黏連蛋白25ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比9∶5∶2組成。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將銀膠菊內(nèi)酯替換為連翹苷元。
對(duì)比例2、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子28ng/mL，聚賴氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，維生素C12μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰島素8μg/mL，亞麻酸5μM，異黃酮16μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纖黏連蛋白25ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比9∶5∶2組成。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，將黃酮替換為異黃酮。
對(duì)比例3、一種無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
所述無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加在所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的添加劑，所述添加劑的成分以終濃度計(jì)，包括：細(xì)胞因子28ng/mL，聚賴氨酸9mg/mL，花生四烯酸3μM，維生素C12μg/mL，銀膠菊內(nèi)酯6μg/mL，丁二胺7μM，胰島素8μg/mL，亞麻酸5μM，黃酮16μg/mL，轉(zhuǎn)鐵蛋白14μg/mL，聚乙烯吡咯烷酮22μg/mL，胰高血糖素11μg/mL和纖黏連蛋白25ng/mL。
所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為IMEM培養(yǎng)基。
所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比1∶1∶1組成。
制備方法與實(shí)施例3類似。
與實(shí)施例3的區(qū)別在于，所述細(xì)胞因子由血清鋪展因子、轉(zhuǎn)化生長因子和表皮生長因子按重量比1∶1∶1組成。
試驗(yàn)例一、本發(fā)明無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)軟骨細(xì)胞生長培養(yǎng)效果
1、試驗(yàn)對(duì)象：本發(fā)明實(shí)施例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基基，以及對(duì)比例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基
2、試驗(yàn)方法：
將獲取的軟骨組織切碎，然后在37℃用0.25％胰蛋白酶先消化40分鐘，再用0.1％Ⅱ型膠原酶消化過夜。在1200r/min離心5分鐘回收細(xì)胞，分別在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基，以及對(duì)比例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中重懸。在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞以5000個(gè)細(xì)胞/cm2的密度鋪板。所有實(shí)驗(yàn)使用T75培養(yǎng)瓶。
細(xì)胞在達(dá)到50％到80％匯合時(shí)進(jìn)行傳代。在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞用PBS沖洗，收獲細(xì)胞，計(jì)數(shù)并重接種。在每次傳代結(jié)束時(shí)，測定細(xì)胞產(chǎn)率并計(jì)算群體倍增數(shù)。結(jié)果如表1和表2所示。
表1：不同培養(yǎng)基測得細(xì)胞產(chǎn)率比較
由表1可以得出，在所有檢測的傳代中，生長在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)率，明顯高于生長在對(duì)比例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中的細(xì)胞產(chǎn)率。
表2：不同培養(yǎng)基測得生長指數(shù)比較
由表2可以得出，在所有檢測的傳代中，生長在本發(fā)明實(shí)施例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長指數(shù)，明顯大于生長在對(duì)比例1-3所得無血清軟骨細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞的生長指數(shù)。