本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種肝原代細(xì)胞分離制備方法。
背景技術(shù)：
：肝臟作為機體的重要器官，在代謝、消化、解毒、凝血、免疫、調(diào)節(jié)等方面均起著非常重要的作用。肝臟由肝細(xì)胞組成，肝細(xì)胞行使了肝臟主要的功能，如清除毒素、參與生物合成和生物轉(zhuǎn)化、代謝多種營養(yǎng)物質(zhì)、儲存葡萄糖、分泌具有促進(jìn)肝細(xì)胞生長的活性物質(zhì)等。從機體分離得到肝細(xì)胞有助于藥理毒理學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等體外研究，而且隨著生物人工肝在治療肝衰竭領(lǐng)域的應(yīng)用，越來越需要大量、高活性的原代肝細(xì)胞作為生物材料。因此，如何分離制備高產(chǎn)量、高純度、高存活率、形態(tài)完整、體外代謝活性高的原代肝細(xì)胞受到研究者的廣泛關(guān)注。自1953年Anderson創(chuàng)剪切法從肝臟分離肝細(xì)胞以來,各實驗室對肝細(xì)胞的分離方法進(jìn)行了不斷改進(jìn)。在眾多方法中,主要分為非灌流的方法和灌流的方法。其中，非灌流的方法以其簡單易行的特點得到了一定的應(yīng)用,但由于存在消化不完全、分離得到的肝細(xì)胞中多細(xì)胞團(tuán)塊存在的問題,不能滿足許多基礎(chǔ)研究或臨床應(yīng)用的要求。1969年，Berry和Friend引入了肝臟灌流法,灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸,不僅提高了分離效率,還使分離所得肝細(xì)胞的活力和數(shù)量大大提高。自從引入灌流法分離肝細(xì)胞以來,許多學(xué)者根據(jù)不同的應(yīng)用條件對灌流法進(jìn)行了改良。其中Seglen[10]經(jīng)過一系列細(xì)致的研究,創(chuàng)立了改良的Seglen兩步灌流法,這一方法已成為應(yīng)用至今的標(biāo)準(zhǔn)的原代肝細(xì)胞分離方法。兩步灌流法主要是通過門靜脈先后用含EDTA或EGTA緩沖液和膠原酶緩沖液進(jìn)行灌注來分離肝細(xì)胞的方法。許多學(xué)者在具體操作中,不斷改進(jìn)兩步灌流法的灌注條件,目的在于進(jìn)一步減少分離過程中肝細(xì)胞的損傷,提高肝細(xì)胞的活率。然而，盡管兩步灌流法在實際應(yīng)用中也經(jīng)過了無數(shù)次改良，但始終沒有擺脫采用單一膠原酶進(jìn)行灌注的觀念。而肝臟是由實質(zhì)細(xì)胞（肝原代細(xì)胞）和非實質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，其比例為3：2。肝臟的復(fù)雜性在于非實質(zhì)細(xì)胞包括：星狀細(xì)胞，竇內(nèi)皮，膽管上皮和免疫細(xì)胞（淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞），而整個肝臟組是由60%實質(zhì)細(xì)包和40%非實質(zhì)細(xì)胞交錯分布組成一個大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，單一酶解達(dá)不到很好的效果，因此，有必要對現(xiàn)有技術(shù)中的肝原代細(xì)胞分離制備方法進(jìn)行改進(jìn)。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)所述的至少一種不足，提供一種的肝原代細(xì)胞分離制備方法，分離制備高產(chǎn)量、高純度、高存活率、形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝原代細(xì)胞。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：一種肝原代細(xì)胞分離制備方法，采用復(fù)合酶對哺乳動物肝臟進(jìn)行灌注分離制得肝原代細(xì)胞。本發(fā)明擺脫原有使用單一酶灌注分離肝原代細(xì)胞的思維，根據(jù)不同肝細(xì)胞的表面特性使用復(fù)合酶進(jìn)行灌注，解決分離肝原代細(xì)胞中血液干擾和組織特異性問題，得到可傳代培養(yǎng)的肝原代細(xì)胞。肝臟是由肝細(xì)胞組成，并有豐富的血管網(wǎng)，呈紅褐色，質(zhì)軟而脆，易受暴力打擊而破裂，導(dǎo)致傳統(tǒng)機械法分離肝原代細(xì)胞得率和存活率十分低下而極少人使用。一般酶解法由于血管網(wǎng)豐富而導(dǎo)致酶的合力低下，另外，肝臟組織中各類細(xì)胞交錯分布，單一酶解達(dá)不到很好的效果。復(fù)合酶的共同作用使得結(jié)構(gòu)復(fù)雜、每種細(xì)胞表面生長基質(zhì)不同的肝臟能夠被充分酶解而得到單個細(xì)胞，而且該過程不會破壞周圍的血管網(wǎng)，使得復(fù)合酶酶解得到的肝原代細(xì)胞具有較高存活率和較高得率。復(fù)合酶的用量根據(jù)動物肝臟的大小來確定，一般每克動物肝臟用30~60mg復(fù)合酶進(jìn)行酶解。進(jìn)一步地，所述復(fù)合酶包括下述重量份的各組分：膠原酶A20~30份、膠原酶D20~30份、膠原酶H5~15份。三種酶除了對膠原有一定分離能力，膠原酶A對纖維素也有一定分離能力，膠原酶D對血管組織有很好分離能力，膠原酶H對脂肪組織有一定分離能力。因為肝臟組的結(jié)構(gòu)復(fù)雜與特異，故采用復(fù)合酶分解。肝原代細(xì)胞與肝星狀細(xì)胞和肝膽管上皮細(xì)胞交錯分布，星狀細(xì)胞需要有纖維分離能力的酶分解，肝膽管上皮需要有血管組織分離能力的酶分解，而肝原代細(xì)胞表面的脂質(zhì)層與需要有脂肪分離能力的酶分解，最后才能很好的釋放肝原代細(xì)胞，得到單個細(xì)胞懸液。優(yōu)選地，所述復(fù)合酶包括下述重量份的各組分：膠原酶A25份、膠原酶D25份、膠原酶H10份。肝原代細(xì)胞分離制備方法，包括如下步驟：S1.灌注：取哺乳動物肝臟，先后用灌注液I、灌注液II進(jìn)行灌注；其中，所述灌注液I包括緩沖液I，所述灌注液II包括緩沖液II和復(fù)合酶；灌注液的用量根據(jù)動物肝臟的大小確定，每克動物肝臟用25~50ml灌注液I、50~100ml灌注液II進(jìn)行灌注；所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl7000~9000mg，KCl350~450mg，NaH2PO4·H2O80~100mg，Na2HPO4100~140mg，HEPES2200~2600mg，NaHCO3300~400mg，EGTA150~250mg，Glucose800~1000mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl7000~9000mg，KCl350~450mg，NaH2PO4·H2O80~100mg，Na2HPO4100~140mg，HEPES2200~2600mg，NaHCO3300~400mg，CaCl2·2H2O500~620mg，其余為H2O；S2.剝離：將步驟S1處理后的肝臟剪碎，得到肝細(xì)胞懸液；S3.過濾：將步驟S2得到的肝細(xì)胞懸液過濾、離心，即得肝原代細(xì)胞。HEPES：4-羥乙基哌嗪乙磺酸；EGTA：乙二醇二乙醚二胺四乙酸；Glucose：葡萄糖。本發(fā)明中，復(fù)合酶的共同作用對肝原代細(xì)胞的分離起到著至關(guān)重要的作用，緩沖體系給復(fù)合酶提供了一個弱堿性環(huán)境，提高復(fù)合酶的催化效率，而NaH2PO4·H2O和Na2HPO4作為一對緩沖鹽可以保持緩沖體系的弱堿性，Glucose為細(xì)胞生活提供了必要能量來源，為分離過程贏得時間。進(jìn)一步地，步驟S1中，所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl7500~8500mg，KCl380~420mg，NaH2PO4·H2O85~95mg，Na2HPO4110~130mg，HEPES2300~2500mg，NaHCO3320~380mg，EGTA170~220mg，Glucose850~950mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl7500~8500mg，KCl380~420mg，NaH2PO4·H2O85~95mg，Na2HPO4110~130mg，HEPES2300~2500mg，NaHCO3320~380mg，CaCl2·2H2O520~600mg，其余為H2O。更進(jìn)一步地，步驟S1中，所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl8000mg，KCl400mg，NaH2PO4·H2O88.17mg，Na2HPO4120.45mg，HEPES2380mg，NaHCO3350mg，EGTA190mg，Glucose900mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl8000mg，KCl400mg，NaH2PO4·H2O88.17mg，Na2HPO4120.45mg，HEPES2380mg，NaHCO3350mg，CaCl2·2H2O560mg，其余為H2O。步驟S1中，灌注灌注液I前先灌注清洗液，洗去肝臟上的代謝廢物及壞死細(xì)胞，提高分離肝原代細(xì)胞的純度，所述清洗液包括緩沖液II。步驟S2中，將步驟S1處理后的肝臟在15~25ml清洗液中剪碎，得到肝細(xì)胞懸液；其中，所述清洗液包括緩沖液II。步驟S3中，將步驟S2得到的肝細(xì)胞懸液過濾得濾液，加入預(yù)冷的清洗液至40~60ml，離心取沉淀，即得肝原代細(xì)胞。加入預(yù)冷的清洗液，防止操作過程中的升程破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。步驟S3中，在4℃溫度下離心，防止離心過程中的升程破壞細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞活性降低。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明的肝原代細(xì)胞分離制備方法能夠有效分離肝原代細(xì)胞，復(fù)合酶的共同作用使得每種細(xì)胞的不同表面生長基質(zhì)都能夠得到充分的酶解，從而得到單個的細(xì)胞懸液。緩沖體系的配合為復(fù)合酶的作用提供了適宜的環(huán)境，使得酶解更為完全，從而提高分離肝原代細(xì)胞的得率。復(fù)合酶的催化特性及緩沖體系為細(xì)胞生活提供了必要環(huán)境，使得分離得到的肝原代細(xì)胞具有較高的存活率。具體實施方式為了讓本領(lǐng)域的技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但實施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。選取90只大小相當(dāng)、種類形同、肝臟大小約1~2g的健康小鼠作為實驗對象，將90只健康小鼠隨機分為9個試驗組，試驗組1采用實施例1進(jìn)行試驗，試驗組2采用實施例2進(jìn)行試驗，以此類推。實施例1一種肝原代細(xì)胞分離制備方法，采用復(fù)合酶對肝臟進(jìn)行灌注分離制得肝原代細(xì)胞。所述復(fù)合酶包括下述重量份的各組分：膠原酶A25份、膠原酶D25份、膠原酶H10份。本實施例的肝原代細(xì)胞分離制備方法，包括如下步驟：一、配制實驗試劑灌注液I：取50ml緩沖液I備用；灌注液II：取100ml緩沖液II加入60mg復(fù)合酶備用；清洗液：取50ml緩沖液II備用；另取50ml緩沖液II預(yù)冷備用。其中，緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl8000mg，KCl400mg，NaH2PO4·H2O88.17mg，Na2HPO4120.45mg，HEPES2380mg，NaHCO3350mg，EGTA190mg，Glucose900mg，其余為H2O；緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl8000mg，KCl400mg，NaH2PO4·H2O88.17mg，Na2HPO4120.45mg，HEPES2380mg，NaHCO3350mg，CaCl2·2H2O560mg，其余為H2O。二、分離制備肝原代細(xì)胞獲取重量為正常小鼠分離制備肝原代細(xì)胞。S1.灌注：用25G留置針插入下腔靜脈，灌注清洗液后結(jié)扎下腔動脈，剪斷肝門靜脈，由肝門靜脈用備好的灌注液I灌注5min，再在10min內(nèi)用備好的灌注液II灌注；S2.剝離：將步驟S1處理后的肝臟置于20ml清洗液中剪碎，得到肝細(xì)胞懸液；S3.過濾：將步驟S2得到的肝細(xì)胞懸液用70um的無菌篩過濾得沉淀置于50ml離心管，加入預(yù)冷的清洗液至50ml，在4℃溫度下以200rpm的速率離心1min，即得肝原代細(xì)胞。S4.培養(yǎng)：用20ml含10%FBS的M199培養(yǎng)基重懸肝原代細(xì)胞，用臺胎藍(lán)染色計數(shù)后接種于預(yù)包被板。實施例2本實施例除了復(fù)合酶各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述復(fù)合酶包括下述重量份的各組分：膠原酶A20份、膠原酶D20份、膠原酶H5份。實施例3本實施例除了復(fù)合酶各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述復(fù)合酶包括下述重量份的各組分：膠原酶A30份、膠原酶D30份、膠原酶H15份。實施例4本實施例除了緩沖液I和緩沖液II各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl7500mg，KCl380mg，NaH2PO4·H2O85mg，Na2HPO4110mg，HEPES2300mg，NaHCO3320mg，EGTA170mg，Glucose850mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl7500mg，KCl380mg，NaH2PO4·H2O85mg，Na2HPO4110mg，HEPES2300mg，NaHCO3320mg，CaCl2·2H2O520mg，其余為H2O。實施例5本實施例除了緩沖液I和緩沖液II各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl8500mg，KCl420mg，NaH2PO4·H2O95mg，Na2HPO4130mg，HEPES2500mg，NaHCO3380mg，EGTA220mg，Glucose850mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl8500mg，KCl420mg，NaH2PO4·H2O95mg，Na2HPO4130mg，HEPES2500mg，NaHCO3380mg，CaCl2·2H2O600mg，其余為H2O。實施例6本實施例除了緩沖液I和緩沖液II各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl7000mg，KCl350mg，NaH2PO4·H2O80mg，Na2HPO4100mg，HEPES2200mg，NaHCO3300mg，EGTA150mg，Glucose800mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl7000mg，KCl350mg，NaH2PO4·H2O80mg，Na2HPO4100mg，HEPES2200mg，NaHCO3300mg，CaCl2·2H2O500mg，其余為H2O；實施例7本實施例除了緩沖液I和緩沖液II各組分的重量份組成不同外，其他同實施例1。所述緩沖液I每升包括下述重量份的各組分：NaCl9000mg，KCl450mg，NaH2PO4·H2O100mg，Na2HPO4140mg，HEPES2600mg，NaHCO3400mg，EGTA250mg，Glucose1000mg，其余為H2O；所述緩沖液II每升包括下述重量份的各組分：NaCl9000mg，KCl450mg，NaH2PO4·H2O100mg，Na2HPO4140mg，HEPES2600mg，NaHCO3400mg，CaCl2·2H2O620mg，其余為H2O；實施例8本實施例與實施例1除了實驗試劑的配置不同外，其他同實施例1。灌注液I：取25ml緩沖液I備用；灌注液II：取50ml緩沖液II加入30mg復(fù)合酶備用；清洗液：取50ml緩沖液II備用；另取50ml緩沖液II預(yù)冷備用。實施例9本實施例與實施例1除了實驗試劑的配置不同外，其他同實施例1。灌注液I：取100ml緩沖液I備用；灌注液II：取200ml緩沖液II加入120mg復(fù)合酶備用；清洗液：取50ml緩沖液II備用；另取50ml緩沖液II預(yù)冷備用。實驗結(jié)果：項目細(xì)胞得率（%）細(xì)胞存活率（%）細(xì)胞純度（%）試驗組192.80%95.60%96.70%試驗組285.30%92.10%90.10%試驗組381.30%84.20%84.50%試驗組489.70%88.90%91.50%試驗組581.60%91.20%86.50%試驗組691.20%84.30%81.50%試驗組784.30%83.60%80.90%試驗組883.60%90.10%82.50%試驗組981.40%89.30%81.70%由以上檢測數(shù)據(jù)可以看出，采用本發(fā)明的肝原代細(xì)胞分離制備方法制得的肝原代細(xì)胞普遍具有較高的細(xì)胞得率、細(xì)胞存活率和細(xì)胞純度，其中，采用實施例1制得的肝原代細(xì)胞的細(xì)胞得率、細(xì)胞存活率、細(xì)胞純度均達(dá)到90%以上，尤其是其細(xì)胞存活率和細(xì)胞純度均達(dá)到95%以上，具有明顯的優(yōu)越性。當(dāng)前第1頁1 2 3