本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種小鼠腎足細(xì)胞細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

腎足細(xì)胞(podocyte)，即腎小囊臟層上皮細(xì)胞，它附著于腎小球基底膜(GBM)的最外側(cè)，與腎小球內(nèi)皮細(xì)胞(glomerular endothelial cells)和毛細(xì)血管內(nèi)皮一起構(gòu)成腎小球?yàn)V過(guò)膜的分子屏障和電荷屏障，足突間形成裂孔隔膜是濾過(guò)膜的最后一道屏障。足細(xì)胞的損傷在蛋白尿的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，而許多伴有足細(xì)胞損傷的腎小球疾病，可能進(jìn)展為慢性腎衰竭。對(duì)足細(xì)胞的生理特性及其細(xì)胞的損傷反應(yīng)機(jī)制的研究可進(jìn)一步了解蛋白尿及腎小球疾病的發(fā)病機(jī)制。但是由于腎臟足細(xì)胞是一種終末分化細(xì)胞，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，定位特殊，體外培養(yǎng)的原代細(xì)胞幾乎不能增殖，而且永生化的足細(xì)胞株的細(xì)胞基因組發(fā)生改變，不能準(zhǔn)確反映腎生理學(xué)及病理學(xué)狀況，可信度不高，因此，本發(fā)明旨在提供一種重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便的小鼠腎足細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，而且可獲得產(chǎn)量高、純度高的小鼠腎足細(xì)胞，為研究足細(xì)胞損傷機(jī)制提供合理的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便，獲得產(chǎn)量高、純度高的小鼠腎足細(xì)胞細(xì)胞分離培養(yǎng)的方法。

為了解決上述所涉及到的問(wèn)題，本發(fā)明采取如下方法獲得小鼠腎足細(xì)胞細(xì)胞：

小鼠腎足細(xì)胞細(xì)胞分離方法的步驟包括：(a)腹腔注射2％戊巴比妥鈉處死小鼠，酒精消毒后取出小鼠腎臟組織，置于預(yù)冷無(wú)菌含雙抗的PBS緩沖液中浸泡洗滌，并剝離除去腎包膜；(b)機(jī)械解離腎臟組織后，預(yù)熱混合酶液消化，完全培養(yǎng)液終止消化；(c)采用差異過(guò)篩的方法獲得腎足細(xì)胞，將足細(xì)胞接種于處理后的細(xì)胞瓶中培養(yǎng)；(d)將培養(yǎng)3d的細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后再次篩網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清，重懸接種于處理后的細(xì)胞瓶中；(e)細(xì)胞免疫熒光鑒定腎足突細(xì)胞。

可選的小鼠為體重22±3gg，6-8周齡的小鼠。

可選的消化所用消化酶液為預(yù)先在37℃預(yù)熱的0.1％-0.2％(m/v)IV型膠原酶和0.05％-0.1％(m/v)II型膠原酶的酶混合液，消化時(shí)間為20-30min；

可選的混合完全培養(yǎng)液為含15％小鼠血清和1％雙抗的DMEM/F12和RPMI1640(1∶1～1∶1.5)；

可選的差速過(guò)篩的方法為將終止消化后的細(xì)胞懸液依次經(jīng)過(guò)80目，100目，400目的篩網(wǎng)，分別收集400目的濾過(guò)液和400目篩網(wǎng)上的細(xì)胞，離心棄上清，完全培養(yǎng)液重懸；

可選的細(xì)胞瓶的處理方法為3-5μg/cm²I型鼠尾膠原蛋白包被之后的細(xì)胞瓶；

可選的純化方法為將培養(yǎng)3d的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，再次通過(guò)400目的篩網(wǎng)，收集濾液，離心棄上清，重懸接種；

本發(fā)明提供的小鼠腎足細(xì)胞細(xì)胞分離方法中消化液選用預(yù)熱的0.1％-0.2％(m/v)IV型膠原酶和0.05％-0.1％(m/v)II型膠原酶混合液用以消化細(xì)胞，不僅避免使用對(duì)細(xì)胞損傷較大的胰酶，而且經(jīng)膠原酶混合液消化后的腎小 球大部分已經(jīng)去掉Bowman囊，也提高了細(xì)胞的貼壁率，縮短了細(xì)胞的貼壁時(shí)間。

本發(fā)明提供一種先消化再過(guò)篩網(wǎng)的方法分離小鼠腎足細(xì)胞，經(jīng)膠原酶混合酶液消化后，足細(xì)胞從腎小球中爬出的時(shí)間縮短，而且消化后的細(xì)胞懸液經(jīng)三層篩網(wǎng)過(guò)濾以及再次過(guò)篩的方法純化小鼠腎足細(xì)胞，操作簡(jiǎn)單，且較磁珠分選的成本節(jié)省很多，而且提高了細(xì)胞的純度及產(chǎn)量。

本發(fā)明提供一種重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便的小鼠腎足細(xì)胞分離及培養(yǎng)方法，而且獲得的小鼠腎足細(xì)胞產(chǎn)量高、純度高。

附圖說(shuō)明

圖1培養(yǎng)7d的細(xì)胞圖片(100×)；

圖2培養(yǎng)7d細(xì)胞圖片(200×)；

圖3細(xì)胞免疫熒光鑒定圖片。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢(shì)更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實(shí)施方式進(jìn)一步闡述。此處所闡述的具體實(shí)施方式僅針對(duì)本發(fā)明進(jìn)行解釋?zhuān)⒉挥糜谙薅ū景l(fā)明。

本發(fā)明選擇6-8周齡的小鼠，分離腎足細(xì)胞。具體操作如下：

1、取6-8周齡的小鼠，腹腔注射2％戊巴比妥鈉處死小鼠，固定小鼠，75％的酒精消毒后取出小鼠腎臟組織，置于預(yù)冷無(wú)菌含雙抗的PBS緩沖液中浸泡洗滌；

2、在冰上于顯微鏡下迅速地去除腎臟上的包膜、血細(xì)胞及結(jié)締組織等附著物，將剝離后的腎臟轉(zhuǎn)至新的PBS緩沖液中清洗2次；

3、在冰上用解剖剪機(jī)械剪碎腎臟組織，大小約1mm³左右的碎塊；

4、將剪碎的組織加入預(yù)熱的4-5倍體積的消化混合液，于37℃消化20-30min，每10min顛倒混勻一次；所述消化混合液包括0.1％-0.2％(m/v)IV型膠原酶和0.05％-0.1％(m/v)II型膠原酶；

5、加入含10％FBS和1％雙抗的的RPMI160和DMEM/F12混合完全培養(yǎng)液終止消化，吹打使細(xì)胞分散，將終止消化后的細(xì)胞懸液依次經(jīng)過(guò)80目，100目，400目的篩網(wǎng)，分別收集400目的濾過(guò)液和400目篩網(wǎng)上的細(xì)胞，1500rpm/min離心5min，棄上清；

6、用混合完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞沉淀，接種于3-5μg/cm²I型鼠尾膠原蛋白包被之后的細(xì)胞瓶中，37℃、5％(m/v)的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

7、培養(yǎng)12h后更換混合完全培養(yǎng)液，顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞已貼壁，細(xì)胞呈扁平樣；

8、培養(yǎng)3d后，將融合度達(dá)90％的細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，再次經(jīng)400目篩網(wǎng)過(guò)濾，收集濾液，1500rpm/min離心5min，棄上清，混合完全培養(yǎng)液重懸，接種于包被后的細(xì)胞瓶中，37℃、5％(m/v)的CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

9、細(xì)胞免疫熒光鑒定：將腎足突細(xì)胞種到放置于24孔板內(nèi)的蓋玻片上，體外培養(yǎng)6-8天，取出蓋玻片，PBS洗3次，每次5min。4％多聚甲醛固定20min，PBS洗3次，0.2％滲透液Triton-100室溫下孵育15min，PBS洗3次，5％BSA室溫封閉1h，吸去封閉液。加入Nephrin抗體于4℃過(guò)夜孵育，PBS洗3次。滴加羊抗鼠PE熒光二抗IgG(1∶100)，在室溫下置于濕盒內(nèi)孵育45min，PBS洗3次，自然晾干后在顯微鏡下觀察。

本發(fā)明中分離得到的小鼠腎足突細(xì)胞貼壁率較高，存活率達(dá)98％以上，細(xì)胞純度達(dá)97％以上。

以上已經(jīng)對(duì)本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)闡述，但本發(fā)明創(chuàng)造不限定于上述實(shí)施例，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)作出任何修改，等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。