專利名稱：一種分離原代成人肝細胞的方法及其專用無菌器械盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種分離原代細胞的方法，尤其是涉及一種分離原代成人肝細胞的方法，本發(fā)明還涉及用于分離原代成人肝細胞的專用無菌器械盒。
背景技術(shù)：
肝細胞分離方法有多種，如機械分離法、鰲合法和酶消化法等。1956年Sorrentino 第一次用機械的方法分離新鮮肝組織，但機械分離法獲得的肝細胞，細胞數(shù)量少、活性差， 逐漸被棄用。1967 年 Howard創(chuàng)建了膠原酶灌流法(Howard RB, Pesch LA. Preparation and partial characterization of intact isolated parenchymal cells from rat liver. Biol Chem, 1968，243 :3105_3114)，1972年Seglen進一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法 (Seglen P0. Preparation of isolated rat liver cells. Method Cell Biol,1976,13 29-83)，使獲得的肝細胞數(shù)量和活性都得到了顯著提高，而且減少了肝細胞懸液中的雜質(zhì)。 該方法要求從門靜脈置管，經(jīng)肝臟血管進行灌流，目前已廣泛應(yīng)用于小鼠、大鼠、豬和犬等動物肝細胞的分離培養(yǎng)。對于成人原代肝細胞的分離，利用肝移植手術(shù)配型不合而丟棄供肝進行肝細胞分離仍然可以應(yīng)用該方法，利用手術(shù)切除的大塊肝臟組織進行細胞分離也可以通過殘存的肝臟小血管置管進行肝臟灌流(Lecluyse EL, Alexandre Ε. Isolation and culture of primary hepatocytes from resected human liver tissue. Methods Mol Biol,2010,640 :57_82)。但是，目前肝移植的供肝極為緊張，而因配型不合丟棄的供肝更是稀缺，完全無法滿足基礎(chǔ)研究中對人肝細胞的巨大需求。隨著外科手術(shù)技術(shù)的發(fā)展，伴隨病變切除的正常肝組織也逐漸變小，獲得的正常肝組織塊大多極不規(guī)則，很難找到合適的灌流血管，無法實施肝臟灌流，也就無法通過Seglen兩步法進行細胞分離。因此，迫切需要一種簡便、容易的獲取成人肝細胞的方法，從而為應(yīng)用成人肝細胞進行藥物篩選、細胞移植等研究提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個目的在于提供一種簡單、經(jīng)濟的針對小塊離體不規(guī)則成人肝組織的分離原代成人肝細胞的方法。本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述分離原代成人肝細胞的方法專用的一次性無菌器械盒，該器械盒可以即拆即用。本發(fā)明的第一個目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種分離原代成人肝細胞的方法，其包括以下步驟(1)對已去除結(jié)締組織的離體成人肝組織用針頭注射器在組織表面進行多點穿刺，注射前灌流液，直至整塊肝組織由暗紅色變?yōu)榛野咨?，且流出的前灌流液變清亮?2)另取針頭注射器在肝組織表面再次進行多點穿刺，注射IV型膠原酶溶液，直至整塊肝組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙；(3)分離肝組織，去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，放入無菌瓶中，加入IV型膠原酶溶液在37°C溫度下震蕩消化得到消化物；(4)將消化物吹打成為細胞懸液，在冰浴條件下過濾，收集過濾后的肝細胞懸液， 移至離心管中，離心處理后去上清液，底層沉淀加入紅細胞裂解液，室溫靜置2 3分鐘后， 再進行離心，收集底層沉淀，用肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞，再次過濾、離心處理后棄上清液，收集底層沉淀物；(5)對步驟(4)中得到的底層沉淀物用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后得到原代成人肝細胞。本發(fā)明所述步驟(1)中所述的多點穿刺注射為用帶針頭的注射器在成人肝組織表面選取多個穿刺點，依次穿刺注射前灌注液，穿刺注射總時間控制在10 15分鐘的范圍內(nèi)，在實際操作中，注射前灌注液時所選取的穿刺點的個數(shù)應(yīng)根據(jù)具體肝組織的大小來決定，并以使整塊肝組織全部由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶翞榕袛鄻藴?，一般來說，至少需要取20個穿刺點。整個穿刺灌注過程中成人肝組織均在放置于冰袋之上的培養(yǎng)皿中進行。本發(fā)明所述步驟(1)中所述的前灌流液主要成分為NaCl 8g/L、KCl 0. 4g/L、 Na2HPO4 · 12H20 0. 12g/L、KH2PO4 0. 06g/L、NaHCO3 0. 35g/L、葡萄糖 1. 0g/L、HEPES2. 38g/L、 EDTA 0.74g/L。本發(fā)明所述步驟(1)中所述的前灌注液的溫度為4°C，且前灌注液只一次性使用。 使用低溫的前灌注液，可使肝細胞在酶消化前受到較小的侵害，從而保持細胞活性。本發(fā)明所述步驟(2)中所述的多點穿刺注射為用帶針頭的注射器在肝組織表面選取多個穿刺點，依次穿刺注射IV型膠原酶溶液，穿刺注射總時間控制在10 15分鐘的范圍內(nèi)，在實際操作中，所選取的穿刺點的個數(shù)應(yīng)根據(jù)具體肝組織的大小來決定，以使肝組織變疏松、失去彈性和表面呈龜背狀裂隙為判斷標準，一般來說，至少需要取20個穿刺點。 所述步驟(2)的操作全過程中成人肝組織在放置于38°C熱水袋之上的培養(yǎng)皿中進行。本發(fā)明所述步驟(2)中在進行IV型膠原酶溶液多點注射處理時，所述的IV型膠原酶溶液的溫度為38°C，且IV型膠原酶溶液循環(huán)使用。本發(fā)明所述步驟(2)和步驟(3)中所述IV型膠原酶溶液是由IV型膠原酶溶于 DMEM培養(yǎng)基配制而成，濃度為0. 05% -0. 1%。本發(fā)明所述步驟(3)中所述的震蕩消化條件為在恒溫搖床中在37°C下以120 150轉(zhuǎn)/分鐘的速度消化15 20分鐘。本發(fā)明所述步驟⑷中所述的紅細胞裂解液的采用濃度為0. 15M的氯化銨溶液。 所述的紅細胞裂解液的用量與肝細胞懸液的體積比為1 3 1 4。所述的消化物吹打成為的細胞懸液后優(yōu)選采用100目濾網(wǎng)過濾，而肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞后優(yōu)選用200 目濾網(wǎng)過濾。本發(fā)明所述步驟(4)中所述的肝細胞洗滌緩沖液采用含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液，所述含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液的主要成分為DNase I 0. 15g/L、CaCl2 0. 12g/ L, MgSO4-7H20 0. 15g/L。所述的含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液的用量是為所述步驟(4) 中IV型膠原酶溶液用量的2倍。本發(fā)明中所述步驟(4)所述離心的條件為在4°C下，800 1000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘。
本發(fā)明所述步驟(6)分離所得的原代成人肝細胞可采用細胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度為0. 5 1 X 106/ml，置冰浴中保存，備用。本發(fā)明的第二個目的通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種上述分離原代成人肝細胞的方法專用的一次性無菌器械盒，其包括盒體和操作器械，所述的操作器械包括無菌培養(yǎng)皿、 無菌燒杯、無菌血清瓶、無菌三角燒杯、兩個無菌濾網(wǎng)、無菌注射器、15ml無菌離心管、無菌鑷子和無菌剪刀；所述盒體內(nèi)設(shè)置多個與所述各個操作器械的形狀、體積吻合的凹槽，所述的各個操作器械對應(yīng)嵌裝在相應(yīng)盒體內(nèi)的凹槽中。所述盒體為塑料一體注塑成型的一次性盒。所述的兩個濾網(wǎng)分別為100目濾網(wǎng)和200目濾網(wǎng)。所述的濾網(wǎng)呈皿狀，其底部為濾網(wǎng)，其采用硬質(zhì)材料做成的上緣向外凸出，且上緣外徑略大于三角燒杯口的外徑，上緣內(nèi)徑略小于三角燒杯口的內(nèi)徑，方便所述的濾網(wǎng)安裝于三角燒杯之上進行過濾操作。為節(jié)約成本，所述的濾網(wǎng)采用尼龍濾網(wǎng)，即其底部為尼龍濾網(wǎng)。在所述盒體中對應(yīng)各個操作器械位置處標注序號，并且所述的各個操作器械在所述盒體中的排列順序也基本按照其使用的先后順序，在使用過程中可以方便取用。本發(fā)明的一次性無菌器械盒，所述盒體外輪廓上覆蓋一層外包裝袋，可保持盒體及操作器械的無菌狀態(tài)，可以長期保存，并實現(xiàn)即拆即用。所述的外包裝袋采用塑料袋。以下結(jié)合試驗進行闡述本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果(1)本發(fā)明采用了在離體肝組織表面多點穿刺注射法分離原代成人肝細胞，無需尋找肝組織中血管進行灌注，簡化了操作，適合從肝切除回收的不規(guī)則小塊原代成人肝組織中提取肝細胞。(2)本發(fā)明在分離肝細胞時，離體成人肝組織在體外熱缺血時間在20分鐘以內(nèi)， 而離體成人肝組織的冷缺血時間控制在30 60分鐘內(nèi)，可以保持肝細胞的活性，且分離效率高，所得的肝細胞質(zhì)量好。(3)本發(fā)明提供獲取原代成人肝細胞的器械盒為無菌一次性用品，基本囊括利用本發(fā)明所述方法獲取原代成人肝細胞所需的全部器械，減少了細胞分離前的繁瑣準備工作，具有結(jié)構(gòu)簡單、便于加工生產(chǎn)、使用方便、成本低廉、儲存期長等優(yōu)點。(3)本發(fā)明提供的方法和器械盒不需要肝臟灌注所需的特殊灌流裝置，操作簡單， 單人即可完成，經(jīng)濟實用，易于在常規(guī)實驗室普及。


圖1是本發(fā)明的一次性原代成人肝細胞分離器械包的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2是應(yīng)用本發(fā)明方法剛分離得到的原代成人肝細胞在100X倒置顯微鏡下的顯微圖。圖3是應(yīng)用本發(fā)明方法剛分離得到的原代成人肝細胞在4200X投射電鏡下的電鏡圖。
具體實施方式
實施例一一次性無菌器械盒的設(shè)置圖1所示的分離人原代肝細胞專用的一次性器械盒的一個實施例，其由外包裝袋 1、盒體4和操作器械構(gòu)成，盒體4設(shè)置于外包裝袋1內(nèi)。操作器械包括IOcm無菌培養(yǎng)皿2、 IOOml無菌燒杯7、20ml無菌燒杯8、25ml無菌血清瓶3、50ml無菌三角燒杯9和50ml無菌三角燒杯10、200目無菌尼龍濾網(wǎng)14和100目無菌尼龍濾網(wǎng)5、IOml無菌注射器15和20ml 無菌注射器11、無菌鑷子6和無菌剪刀13、兩個15ml離心管12。在盒體4內(nèi)設(shè)置有多個與上述各操作器械形狀、體積吻合的凹槽，上述各個操作器械對應(yīng)嵌裝在相應(yīng)盒體4內(nèi)的凹槽中。這些操作器械在盒體4中均標注有序號，操作器械在盒體4中基本按照其使用的先后順序進行排列。盒體4左半?yún)^(qū)域的操作器械無菌培養(yǎng)皿2標注①、IOOml無菌燒杯標注②、20ml無菌燒杯標注③、25ml無菌血清瓶標注④、50ml無菌三角燒杯9和50ml無菌三角燒杯10分別標注為⑤和⑥、200目無菌尼龍濾網(wǎng)14和100目無菌尼龍濾網(wǎng)5分別標注為 ⑦，這些操作器械從盒體4內(nèi)左上角的培養(yǎng)皿開始從上到下、從左到右依次取用。盒體4內(nèi)右半?yún)^(qū)域的操作器械為多次使用的器械無菌鑷子6和無菌剪刀13標注A、兩個離心管12 標注B、10ml無菌注射器15和20ml無菌注射器11標注C。實施例二原代成人肝細胞的分離培養(yǎng)DMEM培養(yǎng)基根據(jù)《細胞培養(yǎng)》(司徒鎮(zhèn)強，吳軍正主編.西安世界圖書出版公司，2007.第50 52頁)中的配方配制。前灌流液的成分包含NaCl 8g/L、KCl 0. 4g/L、Na2HPO4 · 12H20 0. 12g/L、 KH2PO4O. 06g/L、NaHCO3 0. 35g/L、葡萄糖 1. Og/L、HEPES 2. 38g/L、EDTA 0. 74g/L。IV型膠原酶溶液是由IV型膠原酶溶于DMEM培養(yǎng)基配置而成，IV型膠原酶濃度為 0.05 0. 1%。IV型膠原酶溶液的用量可根據(jù)肝組織大小重量來確定，然而為節(jié)約資源，經(jīng)實驗證明肝組織的重量為1. 0 3. Og時采用15ml IV型膠原酶溶液，3. Ig 4. Og時采用 20mlIV型膠原酶溶液，4. 1-5. Og時采用25mlIV型膠原酶溶液。紅細胞裂解液為濃度為0. 15M的氯化銨溶液。肝細胞洗滌緩沖液采用含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液，該含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液的成分包含 DNase I 0. 15g/L、CaCl2 0. 12g/L、MgSO4 · 7H20 0. 15g/L。離體成人肝組織均指不規(guī)則的小塊的成人肝組織，形狀不規(guī)則，重量在1克至5克之間，且無法找到可供灌流血管的肝組織，而且離體成人肝組織在體外熱缺血時間最好控制在20分鐘以內(nèi)，冷缺血時間最好控制在30 60分鐘內(nèi)。采集離體成人肝組織得到了廣州南方醫(yī)院倫理委員會的批準。分離方法(1)先打開制冰機制冰，搖床調(diào)到38°C，將IV型膠原酶溶液預(yù)熱至38°C，專用器械盒拆包后置于生物安全柜中備用。(2)取無菌的離體不規(guī)則小塊成人肝組織放置于冰袋之上的無菌培養(yǎng)皿2中，清洗血污，用無菌剪刀13去除不需要的結(jié)締組織，并修剪組織塊，之后稱取肝組織重量，約為 2g。在去除結(jié)締組織、修剪組織塊和沖洗組織塊表面血液時，盛裝離體成人肝組織的無菌培養(yǎng)皿2始終放置在冰袋之上。(3)取100ml4°C冰箱保存的前灌流液至IOOml燒杯7中，用20ml無菌注射器11吸取前灌注液，然后在肝組織表面取約20個穿刺點，依次穿刺注射4°C的前灌流液，灌注時間為15分鐘，此時肝組織已由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅那肮嗔饕鹤兦辶痢９嘧r壓力、 流速要恒定，不能有氣泡，且前灌流液只一次性使用。(4)用IOml無菌注射器15吸取38°C的IV型膠原酶溶液，然后在肝組織表面取約 20個穿刺點，依次穿刺注射38°C的IV型膠原酶溶液，IV型膠原酶溶液循環(huán)使用，灌注時間為15分鐘，使組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙。在本操作步驟中，為保持IV型膠原酶溶液的溫度，將培養(yǎng)皿2置于熱水袋之上。(5)將消化后的肝組織轉(zhuǎn)移至20ml無菌燒杯8中，用無菌剪刀13剪開組織塊，用無菌鑷子6鈍性分離肝組織，并去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，然后移入25ml血清瓶3 中，加入IV型膠原酶溶液15ml，置于37°C的恒溫搖床中以120轉(zhuǎn)/分鐘的速度震蕩消化15 分鐘；(6)用粗口吸管將消化物吹打成為細胞懸液，加入IOml含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基終止消化。在冰浴條件下，用三角燒杯收集經(jīng)100目尼龍濾網(wǎng)5過濾后的肝細胞懸液，移至兩只15ml離心管12中，4°C下，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，然后去上清液，得到底層沉淀的肝細胞。(7)在所得的肝細胞加入紅細胞裂解液1. 5ml室溫靜置3分鐘后，加入6mlDMEM培養(yǎng)基混勻，4°C下，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，收集底層沉淀，用30ml含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞，用三角燒杯收集經(jīng)200目尼龍濾網(wǎng)14過濾的肝細胞懸液，再移至兩只15ml離心管12中，4°C下，1000轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，棄上清液，收獲沉淀于底層的肝細胞。(8)步驟(7)中得到的的肝細胞用IOml無血清DMEM培養(yǎng)基重懸，在4°C下，1000 轉(zhuǎn)/分鐘，離心5分鐘，重復(fù)3次，得到成人原代肝細胞。所得的原代成人肝細胞用細胞培養(yǎng)基重懸，調(diào)節(jié)細胞濃度為lX106/ml，置冰浴中備用。取原代成人肝細胞置于倒置顯微鏡下觀察，可見活細胞透亮、呈近似球形且邊界清晰，多數(shù)呈單個均勻散在分布；而破損的肝細胞表現(xiàn)為細胞腫脹、出現(xiàn)空泡，胞膜有缺損 (圖2)。透射電鏡下新鮮分離的肝細胞呈圓形、胞膜完整、細胞較核大、胞漿內(nèi)可見大量的線粒體以及少量脂肪滴(圖3)。上述實施例只是本發(fā)明的其中優(yōu)先實施方式，然而本發(fā)明的實施方式不限于此， 根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，本發(fā)明做出其它多種形式的修改、替換或變更，均實現(xiàn)本發(fā)明的目的。
權(quán)利要求
1.一種分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，其包括以下步驟(1)對已去除結(jié)締組織的離體成人肝組織用針頭注射器在組織表面進行多點穿刺，注射前灌流液，直至整塊肝組織由暗紅色變?yōu)榛野咨?，且流出的前灌流液變清亮?2)另取針頭注射器在肝組織表面再次進行多點穿刺注射IV型膠原酶溶液，直至整塊肝組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀裂隙；(3)分離肝組織，去除殘存的包膜和纖維結(jié)締組織，放入無菌瓶中，加入IV型膠原酶溶液在37°C溫度下震蕩消化得到消化物；(4)將消化物吹打成為細胞懸液，在冰浴條件下過濾，收集過濾后的肝細胞懸液，移至離心管中，離心處理后去上清液，底層沉淀加入紅細胞裂解液，室溫靜置2 3分鐘后，再進行離心，收集底層沉淀，用肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞，再次過濾、離心處理后棄上清液， 收集底層沉淀物；(5)對步驟(4)中得到的底層沉淀物用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后得到原代人肝細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，所述的步驟(1)所述的離體成人肝組織在體外熱缺血時間控制在20分鐘以內(nèi)；而所述的離體人肝組織冷缺血時間控制在30 60分鐘內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，所述步驟(1)中多點穿刺注射為用帶針頭的注射器在肝組織表面選取多個穿刺點，依次穿刺注射前灌注液， 穿刺灌注總時間控制在10 15分鐘的范圍內(nèi)；所述步驟(2)中的前灌流液成分包含NaCl 8g/L、KCl 0. 4g/L、Na2HPO4 · 12H20 0. 12g/L、KH2PO4O. 06g/L、NaHCO3 0. 35g/L、葡萄糖 1. Og/ L、HEPES 2.38g/L、EDTA 0. 74g/L ；所述步驟(2)中的前灌注液的溫度為4°C，且前灌注液只一次性使用。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的多點穿刺注射為用帶針頭的注射器在肝組織表面選取多個穿刺點，依次穿刺注射IV型膠原酶溶液，穿刺注射總時間控制在10 15分鐘的范圍內(nèi)；所述的IV型膠原酶溶液的溫度為38°C，且IV型膠原酶溶液循環(huán)使用；所述步驟(2)的操作全過程在放置于38°C熱水袋之上的培養(yǎng)皿中進行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，所述步驟(2)和步驟(3)中所述IV型膠原酶溶液是由IV型膠原酶溶于DMEM培養(yǎng)基配制而成，IV型膠原酶的重量百分比濃度為0. 05% -0. 1% ；所述步驟(3)中所述的震蕩消化條件為在恒溫搖床中在37°C下以120 150轉(zhuǎn)/分鐘的速度消化15 20分鐘；所述步驟(3)中IV型膠原酶溶液的用量根據(jù)肝組織大小重量來確定。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，；所述步驟(4)中所述的紅細胞裂解液的采用濃度為0. 15M的氯化銨溶液，所述的紅細胞裂解液的用量與肝細胞懸液的體積比為1 3 1 4;所述的消化物吹打成為的細胞懸液后采用100目濾網(wǎng)過濾，而肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞后用200目濾網(wǎng)過濾。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離原代成人肝細胞的方法，其特征在于，所述步驟(4)中所述的肝細胞洗滌緩沖液采用含DNase I的肝細胞洗滌緩沖液，所述含DNaseI的肝細胞洗滌緩沖液的成分包含 DNase I 0. 15g/L、CaCl2 0. 12g/L、MgS04 ·7Η200· 15g/L ；所述的含 DNase I的肝細胞洗滌緩沖液的用量是為所述步驟(3)中IV型膠原酶溶液用量的2倍。
8.—種權(quán)利要求1 2任一權(quán)利要求所述的分離原代成人肝細胞的方法專用的一次性無菌器械盒，其特征在于，其包括盒體和操作器械，所述的操作器械包括培養(yǎng)皿、燒杯、血清瓶、三角燒杯、兩個濾網(wǎng)、注射器、15ml離心管、鑷子和剪刀；所述盒體內(nèi)設(shè)置多個與所述各個操作器械的形狀、體積吻合的凹槽，所述的各個操作器械對應(yīng)嵌裝在相應(yīng)盒體內(nèi)的凹槽中。
9.根據(jù)權(quán)利要求9所述的一次性無菌器械盒，其特征在于，所述的濾網(wǎng)呈皿狀，其底部為濾網(wǎng)，其采用硬質(zhì)材料做成的上緣向外凸出，且上緣外徑略大于三角燒杯口的外徑，上緣內(nèi)徑略小于三角燒杯口的內(nèi)徑，使濾網(wǎng)安裝于三角燒杯之上進行過濾操作。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一次性無菌器械盒，其特征在于，所述的盒體外輪廓上覆蓋一層保持盒體及操作器械的無菌狀態(tài)的外包裝袋。
全文摘要
本發(fā)明公開一種分離原代成人肝細胞的方法，其包括以下步驟(1)對已去除結(jié)締組織的離體成人肝組織用針頭注射器在組織表面進行多點穿刺，注射前灌流液；(2)用針頭注射器在組織表面再次進行多點穿刺注射IV型膠原酶溶液；(3)分離肝組織加入IV型膠原酶溶液在37℃溫度下震蕩消化得到消化物；(4)消化物經(jīng)過濾后、用紅細胞裂解液處理，然后離心、收集底層沉淀，再用肝細胞洗滌緩沖液重懸肝細胞，再次過濾、離心處理后棄上清液，收集底層沉淀物；(5)對步驟(4)中得到的底層沉淀物用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌后得到原代成人肝細胞。本發(fā)明還公開了上述分離原代成人肝細胞的方法專用的一次性無菌器械盒。本發(fā)明利用一次性專用器械盒通過肝組織表面多點穿刺注射分離成人肝細胞，簡化了操作，降低了成本，適合從肝切除回收的不規(guī)則小塊離體成人肝組織中提取肝細胞。
文檔編號C12M1/00GK102220278SQ20111011047
公開日2011年10月19日 申請日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者劉思德, 匡雷, 李愛民, 林建華, 王亞東, 趙芯梅 申請人:南方醫(yī)科大學(xué)