本發(fā)明屬于蛋白酶學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一大鼠肝S9的誘導(dǎo)及制備方法。

背景技術(shù)：

大鼠肝細(xì)胞S9是大鼠肝實質(zhì)細(xì)胞勻漿液的去線粒體上清液，包含了大量的CYPs等藥物代謝酶，其在藥物體外代謝的研究中具有快速簡便、靈敏、經(jīng)濟且可進行高通量篩選的特點，因此常用作體外研究藥物代謝和藥物相互作用的工具。同時許多致癌劑的生物轉(zhuǎn)化是依靠細(xì)胞內(nèi)微粒體混合功能氧化酶系來完成的，所以大鼠肝S9是許多體外研究致癌劑生物轉(zhuǎn)化的活化系統(tǒng)。傳統(tǒng)的大鼠肝S9誘導(dǎo)劑為多氯聯(lián)苯，其誘導(dǎo)效果比單獨用苯巴比妥鈉或β-奈黃酮要好，但其是致癌劑，一種嚴(yán)重的環(huán)境污染物，現(xiàn)許多國家已禁止生產(chǎn)?，F(xiàn)研究表明聯(lián)合誘導(dǎo)法可以達到多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的效果，本發(fā)明通過優(yōu)化苯巴比妥和β-奈黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)法以及大鼠肝S9制備方法可以獲得高產(chǎn)量的大鼠肝S9以及較高的P450酶含量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是建立一種可以獲得高產(chǎn)量的大鼠肝S9以及較高的P450酶含量的大鼠肝S9制備方法。

為了解決上述所涉及到的問題，本發(fā)明采取如下方法制備大鼠肝S9：

大鼠肝S9的誘導(dǎo)及制備方法的步驟包括：(a)挑選大鼠，按照大鼠的體重，用不同的方式和劑量腹腔注射兩種誘導(dǎo)劑以確定最佳誘導(dǎo)方法；(b)處死大鼠， 在無菌條件下，除去肝中殘血，取出肝臟；(c)在無菌條件下，按一定的肝濕重比加入預(yù)冷的儲存緩沖液中，充分剪碎，在冰浴中勻漿；(d)將勻漿好的組織液低速離心，收集上清和沉淀，并將上清高速離心收集上清，即首次獲得的大鼠肝S9；(e)將收集的沉淀，按一定的比重加入預(yù)冷的儲存緩沖液，在無菌和冰浴條件下充分研磨并在不同條件下超聲破碎細(xì)胞，將其在高速離心收集上清，即再次獲得肝S9；(f)BCA法和CO還原法檢測不同條件下大鼠肝S9蛋白以及酶含量。

可選的大鼠為SD雄性大鼠，體重為230±20g；

可選的誘導(dǎo)劑為苯巴比妥鈉和β-奈黃酮；

可選的誘導(dǎo)方法為第1d大鼠腹腔注射劑量為30mg/kg的苯巴比妥鈉和劑量為40mg/kg的β-萘黃酮，第2d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第3d注射劑量為60mg/kg的苯巴比妥鈉，第4d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第5d注射苯巴比妥鈉60mg/kg；

可選的除去肝中殘血的方法是將事先冰浴的肝素液經(jīng)肝門靜脈灌洗除去殘血：

可選的加入預(yù)冷的儲存緩沖液的量是肝濕重的3倍(V/m)；

可選的儲存緩沖液為0.15M KCl(pH 7.4)；

可選的低速離心勻漿液，其離心速度為1500rpm/min，時間5min；

可選的肝S9高速離心，其離心速度為9000g，時間20min；

可選的加入預(yù)冷的儲存緩沖液的量是沉淀重量的2倍(V/m)；

可選的超聲條件分別為34w/50w/65w超聲功率下，超聲10s，間隔5s的條件下，超聲20次；

本發(fā)明提供了一聯(lián)合誘導(dǎo)方法，大大提高了大鼠肝S9的P450酶含量，并通 過大鼠肝S9制備方法的優(yōu)化，提高了大鼠肝S9的產(chǎn)量。

附圖說明

圖1：三種誘導(dǎo)方法所產(chǎn)生大鼠肝S9的P450酶含量；

圖2：不同超聲破碎條件下產(chǎn)生的總蛋白含量；

圖3：不同超聲破碎條件下產(chǎn)生的P450酶含量。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)勢更清新地展現(xiàn)，現(xiàn)將具體實施方式進一步闡述。此處所闡述的具體實施方式僅針對本發(fā)明進行解釋，并不用于限定本發(fā)明。

a.實驗前準(zhǔn)備好一盆-80℃的冰，將需要的肝臟灌洗緩沖液和儲存緩沖液提前30min放置在冰上，同時在冰上放置幾個稱重的50mL離心管。

b.挑選SD大鼠，雄性，230±20g；誘導(dǎo)方法1：大鼠腹腔注射苯巴比妥鈉，每天1次，第一天劑量為30mg/kg，余下3d每天劑量為60mg/kg；第3、4天腹腔注射β-萘黃酮：每天1次，劑量為80mg/kg；誘導(dǎo)方法2：第1d大鼠腹腔注射劑量為30mg/kg的苯巴比妥鈉和劑量為40mg/kg的β-萘黃酮，第2d注射為60mg/kg的苯巴比妥鈉和劑量為80mg/kg的β-萘黃酮；第3d不注射誘導(dǎo)劑，第4d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮和劑量為60mg/kg的苯巴比妥鈉；誘導(dǎo)方法3：第1d大鼠腹腔注射劑量為30mg/kg的苯巴比妥鈉和劑量為40mg/kg的β-萘黃酮，第2d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第3d注射劑量為60mg/kg的苯巴比妥鈉，第4d注射劑量為80mg/kg的β-萘黃酮，第5d注射苯巴比妥鈉60mg/kg；大鼠注射誘導(dǎo)劑時正常飲食，在最后一次給藥后，大鼠禁食，可以正常飲水，24h后麻醉處死。

c.在無菌條件下剖腹，將事先冰浴的肝素液(10mM PBS，0.15M KCl，20％肝素(1000U/mL)，pH 7.4)經(jīng)肝門靜脈灌洗除去殘血，洗至土黃色。

d.快速剪下肝臟，立即放到用冰浴冷卻的PBS緩沖液(0.15M KCl，pH 7.4)進一步洗去多余血污。

e.將清洗干凈的肝臟放置冰上預(yù)冷的無菌離心管中，稱重，將其按3ml/g濕重的比例加入預(yù)冷的儲存緩沖液中，充分剪碎，在冰浴中勻漿。

f.將勻漿好的組織液，倒入預(yù)冷的50mL的離心管中，1500r，5min離心，收集上清和沉淀。

g.上清于冷凍高速離心機中9000×g離心15min，取其上清液即為首次獲得的大鼠肝S9，取樣測蛋白含量及P450酶含量。

h.將誘導(dǎo)方法3誘導(dǎo)條件下的沉淀按其重量1∶2的量加入儲存緩沖液，充分混勻，平均分成3等份，在無菌條件下，分別在34w/50w/65w超聲功率下，超聲10s，間隔5s的條件下，超聲20次。

i.超聲后，液體于冷凍高速離心機中9000×g離心15min，取其上清液即為再次獲得的大鼠肝S9，取樣測蛋白含量及P450酶含量。

j.將BCA法測各組樣中蛋白含量，并對收集的樣品定量。

k.在樣品中蛋白濃度一定的條件下，通過CO還原法檢測分組中酶含量，具體步驟為：1)將待測樣蛋白濃度稀釋為5mg/mL，取0.2ml加入到5.4mL的PBS中，然后加入10％的連二硫酸鈉0.5ml，立刻混勻；2)開啟紫外分光光度器，選取波長424、450、490nm，用PBS作為Blank，取3ml的反應(yīng)液作為對照組，讀取OD值，另外3ml反應(yīng)液中充CO 30s，然后立即檢測OD值；3)計算公式ΔOD(450-490)×10³/(91×稀釋后蛋白濃度(mg/ml))結(jié)果發(fā)現(xiàn)：誘導(dǎo)方法3產(chǎn)生的肝S9，其P450酶含量最高，達到579pmol/mg； 在50W的超聲功率下，所產(chǎn)生的總P450酶含量最高，其蛋白含量為53mg/mL，P450酶含量為554pmol/mg。說明沉淀再次研磨并超聲破碎后收集的肝S9與首次獲得的肝S9性質(zhì)相差不大，將兩次獲得的肝S9合并后作為肝S9庫，大大提高了大鼠肝S9的產(chǎn)量。