專利名稱：吡喹酮在制備肝星狀細(xì)胞激活抑制劑中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，提供了吡喹酮(2-環(huán)己基甲酰基-1，2，3，6，7，lib-六 氫-4H-吡嗪并[2，l-α]異喹啉-4-酮，Praziquantel, PZQ)在制備肝星狀細(xì)胞激活抑制 劑中的應(yīng)用。背景技術(shù)：
肝纖維化是肝臟對(duì)多種病因慢性刺激所致的損傷后修復(fù)反應(yīng)，其特征是以α 1(1 型)膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)的過度沉積，可進(jìn)一步發(fā)展為 肝硬化、門脈高壓、肝衰竭、肝功能失調(diào)。在肝損傷過程中，活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝纖維化過程中產(chǎn)生膠原的主要細(xì)胞。HSC活化后細(xì)胞增殖能力增 強(qiáng)及ECM組分的合成增多，是促纖維生成的關(guān)鍵。HSC活化的機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，尚難完全闡明。正常肝組織包括肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞及Disse間隙內(nèi)星狀細(xì)胞(也 稱為Ito細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、竇狀隙周細(xì)胞、貯脂細(xì)胞)。正常的HSC占肝臟固有細(xì)胞總數(shù)的 15%，其主要功能為貯存視黃醇類。HSC的活化是纖維生成的關(guān)鍵事件，其形態(tài)和功能均 發(fā)生了改變，從靜止的維生素A儲(chǔ)存細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵鲋车?、產(chǎn)生膠原、具收縮性的肌成纖維細(xì) 胞。HSC的活化是一個(gè)復(fù)雜且高效有序的過程，其活化的標(biāo)志是在mRNA和蛋白水平的膠原 合成，I型膠原大量生成，III型及IV型膠原顯著增加。其早期事件稱為啟動(dòng)期，亦稱前炎 癥期。啟動(dòng)期包括HSC基因表達(dá)及表型的快速變化，受炎癥細(xì)胞、受損肝細(xì)胞或膽管細(xì)胞的 旁分泌刺激及早期ECM各成分的影響而致。繼而進(jìn)入持續(xù)活化期，通過自分泌、旁分泌刺激 及ECM的加速重構(gòu)、生長(zhǎng)因子表達(dá)及應(yīng)答性增強(qiáng)等進(jìn)一步放大HSC表型變化，維持其持續(xù)活 化狀態(tài)。HSC活化后向組織損傷部位遷移并累積，分泌大量ECM并同時(shí)調(diào)節(jié)其降解。因此， 抑制HSC的激活是干預(yù)纖維化進(jìn)程的重要手段。尋找HSC的激活抑制劑一直的研究抗肝臟纖維化的熱點(diǎn)?？共《镜母蓴_素近年 來被認(rèn)為能夠抑制HSC激活，進(jìn)而發(fā)揮抗肝臟纖維化的作用，但由于其價(jià)格昂貴，副作用較 大，臨床上沒有得到廣泛應(yīng)用；一些抗氧化劑，如維生素E在實(shí)驗(yàn)室證明對(duì)四氯化碳所致肝 損害有療效，抑制HSC激活，但在臨床用于患者治療時(shí)未能證明效果；一些細(xì)胞因子，如轉(zhuǎn) 化生長(zhǎng)因子可激活HSC，促進(jìn)合成肝臟細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，所以應(yīng)用改變其受體性質(zhì)，或用可 溶性受體阻止其和HSC結(jié)合，可防止實(shí)驗(yàn)性肝硬化。但轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子具有抗癌作用，長(zhǎng)期阻 斷可能有不良反應(yīng)；其他一些藥物，如己酮可可堿磷酸酯酶抑制劑、鹽酸阿米洛利、雷帕霉 素等都處于試驗(yàn)階段，長(zhǎng)期應(yīng)用是否有致畸、致癌、致突變或者其他不良反應(yīng)，尚不得而知。 因此，研究安全、有效的HSC激活抑制劑，仍然是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。吡喹酮作為抗寄生蟲的藥物已經(jīng)有了 30多年的臨床應(yīng)用，被認(rèn)為是效果好、毒 性低、耐受好、口服方便的藥物。吡喹酮口服后80-100%的藥物可以被吸收，且吸收速度 很快。體內(nèi)最高血藥濃度在0.5-1小時(shí)。藥物體內(nèi)分布主要在肝臟，濃度可達(dá)外周血的 10倍以上。吡喹酮在肝臟內(nèi)具有極強(qiáng)的首過效應(yīng)，代謝相當(dāng)完全，以原藥形式排出量?jī)H占 藥量的0.0001-0. 001%。吡喹酮問世以來，各國學(xué)者都對(duì)其進(jìn)行了詳細(xì)的毒理學(xué)研究。急性毒性實(shí)驗(yàn)中，正常小鼠和感染日本血吸蟲小鼠的LD50分別為4420 士 276. 3mg/kg和 3710士276.2mg/kg，這可能由于感染血吸蟲小鼠肝臟和正常動(dòng)物有明顯差異。慢性毒性實(shí) 驗(yàn)中，大鼠口服100-1000mg/kg，連續(xù)4周；犬每天口服60_180mg/kg，連續(xù)13周，均能很好 地耐受，無明顯的血液學(xué)和組織病理性改變。致突變實(shí)驗(yàn)中，多名學(xué)者在各種吡喹酮濃度 下，均未發(fā)現(xiàn)吡喹酮有致突變作用。生殖毒性實(shí)驗(yàn)中，在動(dòng)物妊娠期，用藥總劑量達(dá)臨床的 20-50倍時(shí)，均未發(fā)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物生殖過程有明顯影響。致癌作用實(shí)驗(yàn)中，給倉鼠連續(xù)服藥80 周、給大鼠連續(xù)服藥104周均未發(fā)現(xiàn)吡喹酮有致癌作用。此外，對(duì)于宿主組織病理的研究和 對(duì)心臟的毒性實(shí)驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)有明顯的毒性。因此，吡喹酮是一個(gè)毒性低，無致畸、致癌、致突 變的藥物。吡喹酮能否作為HSC激活的抑制劑，以及能否作為抗日本血吸蟲病肝臟纖維化 的藥物，目前還沒有研究。本發(fā)明提供了吡喹酮作為HSC激活抑制劑的用途。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的本發(fā)明提供了吡喹酮在制備肝星狀細(xì)胞激活抑制劑中的應(yīng)用。技術(shù)方案為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面通過對(duì)吡喹酮的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 來說明其在制藥領(lǐng)域內(nèi)的新應(yīng)用。一、吡喹酮處理3天對(duì)感染日本血吸蟲小鼠及正常小鼠HSC作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) BABL/c雌性小鼠，6 8周齡，購自揚(yáng)州大學(xué)比較動(dòng)物中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。日本血吸蟲陽性 釘螺30只，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組情況感染組小鼠12只，正常 組小鼠12只，感染組小鼠采用腹部透皮感染日本血吸蟲尾蚴12士2條。感染處理組為感染 后12周，感染組小鼠6只經(jīng)口灌胃吡喹酮250mg/kg體重/天，連續(xù)3天，于治療3天后剖 殺；正常處理組為正常組小鼠經(jīng)口灌胃吡喹酮250mg/kg體重/天，連續(xù)3天，于治療3天后 剖殺。同時(shí)剖殺同期用wt羧甲基纖維素鈉溶液處理3天的感染組小鼠6只和正常組小 鼠6只做對(duì)照。分離各組小鼠的HSC。HSC的分離、培養(yǎng)和鑒定用2% wt的戊巴比妥納麻醉小鼠，45mg/kg體重，腹腔注 射。待小鼠麻醉后，以十字型切口打開腹腔，套管針穿刺門靜脈，接通灌注系統(tǒng)，迅速剪開 下腔靜脈放血。以IOmL/分鐘的速率灌注RPMI-1640除盡血液，再將肝完整的分離下來置 于平皿中。以同樣的速率灌注含0.04%膠原酶和0. 2%鏈霉蛋白酶的RPMI-1640。10分鐘 后，肝組織完全軟化，幾乎成液狀時(shí)停止灌注。撕除肝包膜，撕碎肝組織，去除肝結(jié)締組織， 將肝組織轉(zhuǎn)入50mL離心管中，再加含0. 08%膠原酶、0. 08%鏈霉蛋白酶、4U/mL DNA酶的 RPMI-1640液10mL，37°C振蕩消化30分鐘。振蕩分散后的細(xì)胞懸液經(jīng)200目尼龍膜過濾， 收集入50mL離心管中，再加預(yù)冷的RPMI-1640至40mL。450g，4°C，離心7分鐘洗滌細(xì)胞2 次。10% Optipr印密度液梯度離心1700g，4°C，20分鐘。吸取細(xì)胞懸液交界面間的細(xì)胞， 450g，4°C，離心7分鐘洗滌細(xì)胞2次。采用高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC，24小時(shí)后換液， 以后每48小時(shí)換液。HSC鑒定熒光顯微鏡328nm紫外激發(fā)光下觀察細(xì)胞的自發(fā)熒光、相 差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。HSC的RNA抽提取小于107的肝星狀細(xì)胞，加入含ImL Trizol試劑充分混勻，室 溫靜置10分鐘。加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩15秒鐘，室溫靜置2分鐘后，12000g, 4°C，離心 15分鐘。取離心上清，加入500 μ L異丙醇，混勻，室溫靜置10分鐘后，12000g，4°C，離心10 分鐘。棄去上清，加ImL 75%乙醇洗滌，7500g，4°C，離心5分鐘。棄去上清，室溫干燥RNA10分鐘，再用DEPC水溶解RNA。測(cè)定RNA的A26(V280吸光值保證吸光值比例在1. 8 2. 0 之間，并經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR 采用 Fermentas 公司 ReverAid First Strand cDNA Synthesis Kit 反 轉(zhuǎn) 錄1 μ gRNA、Oligo (dT) 18primer 1 μ L、5 X reaction buffer 4 μ L、Rnase inhibitor 1 μ L、dNTP Mix2 μ L、M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μ L、 DEPC-treated water to 20 μ L0 42°C，孵育 1 小時(shí)。70°C，5 分鐘滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-70°C凍 存。采用 Roche Fast Start Universal SYBR Green Master (ROX)試劑、Axygen 96 孑L板 和封口膜。PCR體系上下游引物濃度30 μ Μ、模板0. 5 μ L、SYBR GreenMix 10 μ L、無核酸 酶的水加至20 μ L。PCR參數(shù)設(shè)定:ABI7300 System ；50°C 5分鐘，95°C 10分鐘預(yù)變性；40 個(gè)循環(huán)95°C 15秒；60°C，15秒；72°C 30秒。擴(kuò)增階段收集熒光信號(hào)，并在擴(kuò)增完畢后進(jìn)行 溶解曲線的測(cè)定。采用2-Δ ACt法計(jì)算差異倍數(shù)。Real time PCR 弓| 物=GAPDH 上游 TGGAAAGCTGTGGCGTGAT, GAPDH 下游 TGCTTCACCACCTTCTTGAT ；a-SMA 上游 TCAGCGCCTCCAGTTCCT，a-SMA 下游 AAAAAAAACCACGAGTAACAAATCAA ；Co11a1 上游 ACGTCCTGGTGAAGTTGGTC，Collal 下游 CAGGGAAGCCTCTTTCTCCT ；二、吡喹酮對(duì)感染日本血吸蟲小鼠HSC體內(nèi)作用的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)BABL/c 雌性小鼠，6 8周齡，購自揚(yáng)州大學(xué)比較動(dòng)物中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。日本血吸蟲陽性釘螺30 只，購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。小鼠采用腹部透皮感染日本血吸蟲尾蚴12 士 2條。感 染后12周后經(jīng)口灌胃吡喹酮250mg/kg體重/天，分別于處理0天、1天、2天、3天后剖殺各 組小鼠6只，分離HSC，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)I型膠原的mRNA水平。三、吡喹酮對(duì)感染日本血吸蟲小鼠HSC的體外作用實(shí)驗(yàn)BABL/c雌性小鼠，6 8 周齡，購自揚(yáng)州大學(xué)比較動(dòng)物中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。日本血吸蟲陽性釘螺30只，購自江蘇省 血吸蟲病防治研究所。小鼠采用腹部透皮感染日本血吸蟲尾蚴12士2條。感染12周后， 無菌分離小鼠HSC以完全DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)(高糖DMEM培養(yǎng)基、10% vt胎牛血清、青霉素 100U/mL、鏈霉素0. lmg/mL)，細(xì)胞密度5X 105/mL,直徑10厘米的corning培養(yǎng)皿，37°C，5% C02。吡喹酮溶于DMS0，過濾除菌，加入各培養(yǎng)體系至終濃度為吡喹酮0μ g/mLUOy g/mL、 30 μ g/mL,DMS0的終濃度為0. 。體外培養(yǎng)12小時(shí)，收集細(xì)胞，抽提RNA，反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)定 量PCR檢測(cè)α -SMA、I型膠原的mRNA水平。四、吡喹酮治療感染日本血吸蟲小鼠后脾臟單個(gè)核細(xì)胞增殖水平的實(shí)驗(yàn)BABL/C 雌性小鼠，6 8周，購自揚(yáng)州大學(xué)比較動(dòng)物中心，清潔級(jí)飼養(yǎng)。日本血吸蟲陽性釘螺30只， 購自江蘇省血吸蟲病防治研究所。小鼠采用腹部透皮感染日本血吸蟲尾蚴12士2條。感染 12周后經(jīng)口灌服吡喹酮250mg/kg體重/天，處理3天后剖殺，并以wt羧甲基纖維素鈉 溶液做對(duì)照。然后無菌分離小鼠脾臟，200目尼龍膜研磨，并以3mL不完全RPMI-1640洗滌重 懸。450g、4°C離心5分鐘。細(xì)胞沉淀用ImL不完全RPMI-1640重懸，并加入8mL紅細(xì)胞裂解 液混勻，室溫靜置5分鐘，450g、4°C離心5分鐘。細(xì)胞用不完全RPMI-1640洗滌2次，過200 目尼龍膜制備成單個(gè)核細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)。培養(yǎng)體系為96孔培養(yǎng)板，每孔加入2 X IO5細(xì)胞 /200 μ L完全RPMI-1640，并分別加入日本血吸蟲蟲卵抗原SEA (10 μ g/mL或20 μ g/mL)陽 性對(duì)照(抗⑶_3，1 μ g/mL)或者陰性對(duì)照(完全RPMI-1640)。每組設(shè)3復(fù)孔，于37°C，5 % CO2培養(yǎng)72小時(shí)，終止培養(yǎng)前16小時(shí)加入3H-TdR 0. 4 μ Ci/孔，檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平。
有益效果本發(fā)明中吡喹酮在體內(nèi)、體外均明顯抑制了 HSC的激活及膠原分泌，并 且不影響脾臟細(xì)胞增殖能力。吡喹酮可以作為HSC激活的抑制劑。
四

圖la-d HSC自發(fā)熒光和活化后的形態(tài)圖Ia相差顯微鏡下HSC的形態(tài)(400X)； 圖Ib紫外激發(fā)光下HSC的自發(fā)熒光(400X)；圖Ic HSC體外培養(yǎng)激活后的形態(tài)(100X)； 圖Id HSC體外培養(yǎng)激活后的形態(tài)(400X)。圖2a_c吡喹酮處理3天對(duì)感染日本血吸蟲小鼠及正常小鼠HSC作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 圖2a應(yīng)用吡喹酮處理3天的感染處理組HSC表達(dá)I型膠原的mRNA水平顯著低于未用吡喹 酮處理的感染組。圖2b應(yīng)用吡喹酮處理3天的感染處理組HSC表達(dá)a-SMA的mRNA水平顯 著低于未用吡喹酮處理的感染組。圖2c應(yīng)用吡喹酮處理3天的正常組HSC表達(dá)I型膠原 的mRNA水平顯著低于未用吡喹酮處理的正常組。吡喹酮在體內(nèi)抑制了 HSC表達(dá)I型膠原 的水平和激活的水平。(*，P < 0. 05 ；**，ρ < 0.01 ；ns，無顯著性差異)圖3吡喹酮對(duì)感染日本血吸蟲小鼠HSC體內(nèi)作用的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系實(shí)驗(yàn)隨著吡喹 酮處理天數(shù)的增加，感染日本血吸蟲小鼠HSC表達(dá)I型膠原的mRNA水平逐步下降。吡喹酮 在體內(nèi)抑制HSC表達(dá)I型膠原的水平，并呈現(xiàn)時(shí)間_效應(yīng)關(guān)系。圖4a_b吡喹酮對(duì)感染日本血吸蟲小鼠HSC的體外作用實(shí)驗(yàn)圖4a感染日本血吸 蟲小鼠HSC在30 μ g/mL吡喹酮體外作用12小時(shí)后表達(dá)I型膠原的mRNA水平較0 μ g/mL、 10 μ g/mL吡喹酮組顯著下降；圖4b感染日本血吸蟲小鼠HSC在30 μ g/mL吡喹酮體外作用 12小時(shí)后表達(dá)a-SMA的mRNA水平較0 μ g/mL、10 μ g/mL吡喹酮組顯著下降。吡喹酮在體外 抑制了 HSC表達(dá)I型膠原和激活的水平。圖5吡喹酮治療感染日本血吸蟲小鼠后脾臟單個(gè)核細(xì)胞增殖水平吡喹酮處理組 和未處理組的脾臟單個(gè)核細(xì)胞在10 μ g/mL、20 μ g/mL蟲卵抗原刺激下增殖水平均沒有差 異。吡喹酮處理后，感染日本血吸蟲小鼠脾臟細(xì)胞增殖能力并未受到影響。
五具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 吡喹酮購自Sigma公司，貨號(hào)P4668，純度99. 7%。羧甲基纖維素鈉與滅菌水混合， 濃度為1 % wt，渦旋混合30分鐘形成均勻的乳化劑。分裝入無菌離心管中，封口膜封口，4°C 保存，24小時(shí)內(nèi)使用。
權(quán)利要求
吡喹酮在制備肝星狀細(xì)胞激活抑制劑中的應(yīng)用。
2.吡喹酮在制備抗日本血吸蟲病肝纖維化藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了吡喹酮在制備肝星狀細(xì)胞激活抑制劑中的應(yīng)用。吡喹酮在體內(nèi)、體外均明顯抑制肝星狀細(xì)胞的激活及膠原分泌，并且不影響脾臟細(xì)胞增殖能力。吡喹酮可以作為肝星狀細(xì)胞激活的抑制劑。
文檔編號(hào)A61P1/16GK101810618SQ20101017130
公開日2010年8月25日 申請(qǐng)日期2010年5月13日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日
發(fā)明者張兆松, 梁越進(jìn), 王勇, 羅潔 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)