專利名稱：：大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島β細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島3細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：胰島素抵抗和胰島0細(xì)胞功能衰退是2型糖尿病的主要發(fā)病機(jī)理。英國(guó)糖尿病前瞻性研究(UKPDS)的結(jié)果表明，初診2型糖尿病人群的0細(xì)胞功能僅及正常人的50%，而且此后以每年4.5%的速率下降。目前臨床上缺乏有效的]保護(hù)和修復(fù)胰島0細(xì)胞功能的治療。大黃酸(Rhein)類化合物或其鹽是是一種結(jié)構(gòu)確知的化合物，其結(jié)構(gòu)式如下<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>其中，M為H、堿金屬、堿土金屬或有機(jī)堿殘基，禮、R2各自獨(dú)立地為H或乙酰基。目前大黃酸類化合物或其鹽的代表有大黃酸(M、Ri、R2均為H)，大黃酸鈉鹽(M為Na,R”R2均為H)、鉀鹽(M為K，R”R2均為H)、1，8_二乙酰大黃酸(M為H，禮、R2均為乙酰基)、1，8_二乙酰大黃酸鈉鹽(M為妝，禮術(shù)均為乙?；?和1，8-二乙酰大黃酸鉀鹽(M為K，禮、&均為乙?；?。在腸內(nèi)，1，8_二乙酰大黃酸(l，8-DiaCelyrhein)的乙?；赏耆凰獾?，有效物質(zhì)形式為大黃酸。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島3細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用。研究表明，口服大黃酸能夠非常顯著地改善2型糖尿病db/db小鼠葡萄糖耐量，減少胰島0細(xì)胞丟失，保護(hù)胰島0細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了大黃酸對(duì)胰島0細(xì)胞的保護(hù)作用，能夠應(yīng)用于治療糖尿病。實(shí)驗(yàn)表明，大黃酸改善葡萄糖耐量。2型糖尿病db/db小鼠經(jīng)大黃酸治療8周后，腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)結(jié)果顯示，大黃酸治療組小鼠糖負(fù)荷后0分鐘，60分鐘和120分鐘的血糖水平顯著低于未經(jīng)治療的對(duì)照db/db小鼠(p<0.05)(表1，圖1A)。同時(shí)大黃酸治療組db/db小鼠血漿胰島素水平在30分鐘和60分鐘顯著升高(圖1B)。大黃酸治療組小鼠血糖曲線下面積(AUC)較未治療組小鼠顯著降低，而胰島素AUC顯著升高，尤其是糖負(fù)荷后30分鐘差別最為明顯(表2)。上述結(jié)果表明，大黃酸改善葡萄糖耐量是由于胰島3細(xì)胞功能改善所致。表1.db/db小鼠經(jīng)大黃酸治療8周后的腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>與db/db小鼠比較，*p<0.05表2.腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)中葡萄糖和胰島素的曲線下面積(AUC)<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>AUCINS0_30030分鐘胰島素曲線下面積；與db/db小鼠比較，*p<0.05實(shí)驗(yàn)表明，大黃酸提高2型糖尿病db/db小鼠第一相胰島素分泌。胰島灌流是評(píng)價(jià)第一相胰島素分泌的金指標(biāo)，從分泌時(shí)相和分泌數(shù)量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)胰島3細(xì)胞的胰島素分泌功能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。16.7mmol/L高糖刺激下，未治療組db/db小鼠胰島素水平略有升高，胰島素峰值水平只有基線水平的三倍。而大黃酸治療組小鼠的胰島素水平在高糖刺激1分鐘后即顯著升高，是基線水平的7倍(圖2)，兩組有顯著性差異。實(shí)驗(yàn)表明，大黃酸增加胰島0細(xì)胞含量。給藥8周后，未治療組db/db胰島3細(xì)胞含量相當(dāng)?shù)停簏S酸治療顯著減少胰島0細(xì)胞的丟失(圖3)。在db/m正常對(duì)照組小鼠，胰島胰島素染色強(qiáng)而且分布均勻，db/db對(duì)照組胰島呈現(xiàn)出微弱而稀疏的胰島素表達(dá)，其染色強(qiáng)度僅為db/m對(duì)照組的50%。與db/db對(duì)照組相比，大黃酸治療顯著增強(qiáng)了胰島內(nèi)胰島4素表達(dá)的強(qiáng)度(圖4)。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明大黃酸類化合物或其鹽能夠改善糖尿病狀態(tài)下糖耐量，保護(hù)和修復(fù)胰島0細(xì)胞功能，能應(yīng)用于制備預(yù)防和治療胰島0細(xì)胞功能衰退的藥物。圖1大黃酸治療組與對(duì)照組IPGTT結(jié)果。圖2離體胰島灌流大黃酸明顯促進(jìn)糖尿病db/db小鼠第一相胰島素的分泌。圖3大黃酸干預(yù)增加db/db小鼠胰島3細(xì)胞質(zhì)量。圖4大黃酸治療組與對(duì)照組胰島細(xì)胞的胰島素染色。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1大黃酸改善葡萄糖耐量的作用藥品大黃酸，0.1%纖維素鈉溶解。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥取4周齡db/db糖尿病小鼠30，隨機(jī)分為治療組和對(duì)照組，另取15只4周齡db/m健康小鼠作為正常對(duì)照組。其中db/db糖尿病治療組給予連續(xù)8周的大黃酸灌胃干預(yù)(120mg/Kg，0.纖維素鈉溶解)，db/db糖尿病對(duì)照組及db/m正常對(duì)照組用0.1%纖維素鈉灌胃。實(shí)驗(yàn)方法投藥8周后，小鼠行腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)。隔夜禁食后，腹腔注射給予0.5g/kg體重葡萄糖，于0、30、60和120min時(shí)從鼠尾采血，測(cè)量全血葡萄糖和胰島素水平，計(jì)算胰島素曲線下面積(AUC)，030分鐘胰島素曲線下面積(AUCinsci_3(i)按(30分鐘胰島素水平-0分鐘胰島素水平)X15計(jì)算，以此評(píng)價(jià)早期胰島素分泌能力；實(shí)驗(yàn)結(jié)果大黃酸改善葡萄糖耐量。2型糖尿病db/db小鼠經(jīng)大黃酸治療8周后，腹腔葡萄糖耐量試驗(yàn)(IPGTT)結(jié)果顯示，大黃酸治療組小鼠糖負(fù)荷后0分鐘，60分鐘和120分鐘的血糖水平顯著低于未經(jīng)治療的對(duì)照db/db小鼠(p<0.05)(表1，圖1A)。同時(shí)大黃酸治療組db/db小鼠血漿胰島素水平在30分鐘和60分鐘顯著升高(圖1B)。大黃酸治療組小鼠血糖曲線下面積(AUC)較未治療組小鼠顯著降低，而胰島素AUC顯著升高，尤其是糖負(fù)荷后30分鐘差別最為明顯(表2)。上述結(jié)果表明，大黃酸改善葡萄糖耐量是由于胰島3細(xì)胞功能改善所致。實(shí)施例2大黃酸對(duì)2型糖尿病db/db小鼠第一相胰島素分泌的影響藥品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同例1實(shí)驗(yàn)方法投藥8周后，每組隨機(jī)選取5只，分離胰島行灌流。麻醉后活體夾閉膽總管十二指腸乳頭開口，實(shí)體顯微鏡下行膽總管穿刺后注射lmg/ml濃度的IV型膠原酶2ml，逆行進(jìn)入胰管使胰腺膨大后迅速分離胰腺，將胰腺置于含IV型膠原酶lmg/ml的Hank’s平衡液中消化40分鐘，去除膠原成份后多次振蕩洗滌，顯微鏡下成功分離胰島，50個(gè)胰島一組，于二氧化碳溫箱孵育2小時(shí)，然后置于專門制作的恒溫灌流設(shè)備中，使用Harvard微量泵先給予2.8mM葡萄糖饑餓灌流，速度為0.5ml/分鐘，30分鐘后給予16.7mM高糖灌流，速度為1ml/分鐘，每20秒收集灌出液保存，5分鐘后改為每分鐘收集一次灌出液，留待ELISA法測(cè)定胰島素水平。第一相胰島素分泌及胰島素動(dòng)態(tài)分泌水平可從測(cè)得的胰島素水平曲線中反映。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)表明，大黃酸提高2型糖尿病db/db小鼠第一相胰島素分泌。胰島灌流是評(píng)價(jià)第一相胰島素分泌的金指標(biāo)，從分泌時(shí)相和分泌數(shù)量?jī)蓚€(gè)方面對(duì)胰島3細(xì)胞的胰島素分泌功能進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。16.7mmol/L高糖刺激下，未治療組db/db小鼠胰島素水平略有升高，胰島素峰值水平只有基線水平的三倍。而大黃酸治療組小鼠的胰島素水平在高糖刺激1分鐘后即顯著升高，是基線水平的7倍(圖2)，兩組有顯著性差異。實(shí)施例3大黃酸對(duì)胰島0細(xì)胞含量的影響藥品及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物同例1實(shí)驗(yàn)方法免疫組織化學(xué)測(cè)定。小鼠苯巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)心臟灌注生理鹽水和4%多聚甲醛(pH7.4)固定，剝離胰腺后置4%多聚甲醛4-6h，石蠟包埋，5iim厚度切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟，不同濃度梯度乙醇再水化后，0.3%過氧化氫室溫20min封閉內(nèi)源性過氧化物酶活性，高壓蒸汽121°C持續(xù)lOmin抗原修復(fù)，10%山羊血清封閉非特異性抗原，加入兔抗小鼠胰島素抗體后4°C過夜反應(yīng)14h加入生物素化山羊抗兔二抗室溫反應(yīng)30min，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精染色后脫水包埋。胰島測(cè)量學(xué)分析所有切片用日本尼康E800光學(xué)顯微鏡觀察并使用與其連接的日本索尼數(shù)碼照相機(jī)拍照，利用Axiovision4.3軟件獲得數(shù)字照片后用Image-ProPlus5.0.1分析，每只小鼠隨機(jī)選取15張胰島照片，每組分析至少50張胰島照片。胰島3細(xì)胞含量測(cè)定使用胰島素染色照片分析，并用下述公式計(jì)算胰島0細(xì)胞含量(mg)=(胰島3細(xì)胞面積/胰腺面積)X胰腺重量(15張胰腺照片/組。胰島素染色強(qiáng)度用ScionImageB4.0.3forwindows(美國(guó))測(cè)定(胰島30個(gè)/組)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果大黃酸增加胰島0細(xì)胞含量。給藥8周后，未治療組db/db胰島3細(xì)胞含量相當(dāng)?shù)?，大黃酸治療顯著減少胰島0細(xì)胞的丟失(圖3)。在db/m正常對(duì)照組小鼠，胰島胰島素染色強(qiáng)而且分布均勻，db/db對(duì)照組胰島呈現(xiàn)出微弱而稀疏的胰島素表達(dá)，其染色強(qiáng)度僅為db/m對(duì)照組的50%。與db/db糖尿病對(duì)照組相比，大黃酸治療顯著增強(qiáng)了胰島內(nèi)胰島素表達(dá)的強(qiáng)度(圖4)。權(quán)利要求大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島β細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用，所述大黃酸類化合物的結(jié)構(gòu)如下所示其中，M為H、堿金屬、堿土金屬或有機(jī)堿殘基，R1、R2各自獨(dú)立地為H或乙?；?。FDA0000021305110000011.tif2.如權(quán)利要求1所述的大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島0細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用，其特征在于，禮、R2均為H，或禮、R2均為乙?；?。3.如權(quán)利要求1或2所述的大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島0細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用，其特征在于，M為H或堿金屬。全文摘要本發(fā)明涉及大黃酸類化合物或其鹽在制備預(yù)防和治療胰島β細(xì)胞功能衰退藥物中的應(yīng)用。研究表明，口服大黃酸能夠非常顯著地改善2型糖尿病db/db小鼠葡萄糖耐量，減少胰島β細(xì)胞丟失，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)了大黃酸對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)作用，能夠應(yīng)用于治療糖尿病。大黃酸類化合物或其鹽能夠改善糖尿病狀態(tài)下糖耐量，保護(hù)和修復(fù)胰島β細(xì)胞功能，能應(yīng)用于制備預(yù)防和治療胰島β細(xì)胞功能衰退的藥物。文檔編號(hào)A61K31/222GK101822660SQ20101017107公開日2010年9月8日申請(qǐng)日期2010年5月13日優(yōu)先權(quán)日2010年5月13日發(fā)明者劉志紅申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍腎臟病研究所