專利名稱：體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本公開涉及一種用于擴(kuò)增肝細(xì)胞(例如人肝細(xì)胞)的方法，具體來說涉及利用免疫缺陷且Fah缺陷小鼠擴(kuò)增肝細(xì)胞的方法。致謝政府支持本發(fā)明是在國(guó)立衛(wèi)生研究院(the National Institutes of Health)授予的課題編號(hào)DK051592的政府支持下作出。美國(guó)政府在本發(fā)明中擁有一定權(quán)利。
背景技術(shù)：
肝是異生化合物(包括醫(yī)用藥物)代謝的重要位點(diǎn)。因?yàn)樵S多肝酶是種屬特異性的，因此必需使用培養(yǎng)的原代人肝細(xì)胞或它們的微粒體級(jí)分，來評(píng)估候選藥物的代謝 (Brandon et al., Toxicol. Appl. Pharmacol. 189 :233-246,2003 ；Gomez-Lechon et al., Curr. Drug Metab. 4 J92-312，2003)。盡管微粒體肝細(xì)胞級(jí)分可用于闡釋某些代謝功能，但其他的測(cè)試依賴于活的肝細(xì)胞。例如，某些化合物誘導(dǎo)肝酶，因此它們的代謝隨著時(shí)間而變化。為了分析酶的誘導(dǎo)，肝細(xì)胞不僅必須是活的，而且必須是完全分化和有功能的。對(duì)于藥物代謝和其他研究來說，通常將肝細(xì)胞從遺體器官供體分離，并運(yùn)送到要進(jìn)行測(cè)試的場(chǎng)所。遺體來源的肝細(xì)胞的狀態(tài)(存活性和分化狀態(tài))差異很大，許多細(xì)胞制品的質(zhì)量勉強(qiáng)合格。高質(zhì)量人肝細(xì)胞的可獲得性受到了下述事實(shí)的進(jìn)一步妨礙，即它們不能在組織培養(yǎng)中大量擴(kuò)增(Runge et al.，Biochem. Biophys. Res. Commun. 274 :1-3,2000 ； Cascio S. M.，Artif. Organs 25 =529-538,2001) 在鋪板后，細(xì)胞存活，但是不分裂。來自容易獲得的哺乳動(dòng)物物種(例如小鼠)的肝細(xì)胞，不適合于大多數(shù)藥物測(cè)試研究，因?yàn)樗鼈兙哂胁煌某商状x酶，并在誘導(dǎo)研究中以不同方式應(yīng)答。永生的人肝細(xì)胞(肝細(xì)胞瘤) 或胎兒成肝細(xì)胞不足以代替完全分化的成年細(xì)胞。在微生物學(xué)領(lǐng)域中的研究也需要人肝細(xì)胞。許多人病毒(例如引起肝炎的病毒)不能在任何其他細(xì)胞類型中復(fù)制。由于這些限制，非常需要擴(kuò)增原代人肝細(xì)胞的方法。因此，本文提供了用于擴(kuò)增人肝細(xì)胞的強(qiáng)力系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本文描述了免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其可以應(yīng)用于多種目的，包括用于從其他物種(特別是人)擴(kuò)增肝細(xì)胞，并且作為人肝臟疾病的動(dòng)物模型，所述肝臟疾病包括肝硬化、纖維化、肝細(xì)胞癌(HCC)和肝感染。本文提供了一種體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法。所述方法包括將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷且延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷小鼠中，允許所述肝細(xì)胞擴(kuò)增，并任選收集人肝細(xì)胞。在數(shù)個(gè)實(shí)施方案中，為了提高移植物移入效率，對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠給予IL-IR拮抗劑，或者所述小鼠還有IL-IR缺陷。在一些實(shí)施方案中，在移植人肝細(xì)胞過程中和/或之后對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠給予IL-IR拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述小鼠的免疫缺陷是由于遺傳突變、免疫抑制或它們的組合引起的。還提供了一種通過以下方式選擇可有效治療人肝臟疾病的試劑的方法將候選試劑給予免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟疾病的效果，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。一種或多種所述肝臟疾病的體征或癥狀的改善表示所述候選試劑可有效治療所述肝臟疾病。還提供了一種通過以下方式選擇可有效治療人肝臟病原體感染的試劑的方法將候選試劑給予移植人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟感染的效果，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，且其中所述移植的人肝細(xì)胞被所述肝臟病原體感染。還提供了一種通過以下方式選擇可有效治療肝硬化的試劑的方法將候選試劑給予移植人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述小鼠肝硬化的至少一種診斷標(biāo)記的效果。在該方法中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷， 或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。還提供了一種通過以下方式選擇可有效治療HCC的試劑的方法將候選試劑給予移植人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述小鼠HCC的效果，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。還提供了一種評(píng)估外源性試劑在體內(nèi)對(duì)人肝細(xì)胞效果的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括將所述外源性試劑給予免疫缺陷且Fah缺陷小鼠并測(cè)量所述小鼠肝功能的至少一種標(biāo)記物，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。還提供了評(píng)估用于肝的基因治療方案和載體(包括基因表達(dá)和基因敲除載體)； 藥物代謝、藥代動(dòng)力學(xué)、效力、毒性和安全性；以及人遺傳性肝臟疾病的方法。這類方法可以利用移植人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，或者可以利用在此類小鼠中擴(kuò)增并從其收集的人肝細(xì)胞，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。本發(fā)明的上述和其他目標(biāo)、特征和優(yōu)點(diǎn)通過以下詳細(xì)說明將更加清晰，所述詳細(xì)說明參考附圖給出。


圖IA是顯示了在用人肝細(xì)胞進(jìn)行移入(engraftment)和再殖(!^population) 后，三重突變FRG小鼠(#471)和兩只雜合子同窩仔畜(#469，#470)的相對(duì)重量的圖。FRG 小鼠在移植后6周維持了其體重；但是，I12rg基因雜合子同窩仔畜持續(xù)地減重。NTBC只在第一和第四周施用，其用陰影指示。圖IB是凝膠的數(shù)字照片，顯示了來自肝細(xì)胞-受體肝臟的基因組DNA上人Alu序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。只有FRG小鼠是陽性的。圖IC-E是顯示了野生型(C)、Fah+⑶和人源化小鼠肝臟(E)中的FAH酶活性的圖片。FAH底物濃度在野生型小鼠肝臟中下降了，但是使用Fah+小鼠肝時(shí)沒有變化。人源化小鼠肝臟顯示出充足的酶活性。圖IF是再殖的小鼠肝臟中FAH免疫染色的數(shù)字照片，顯示出超過80%的肝細(xì)胞是FAH陽性的(由深染色和較大箭頭指示)。小箭頭區(qū)別指示了 FAH陰性細(xì)胞。圖IG 是相同肝切片的H&E染色的數(shù)字照片，顯示了人肝細(xì)胞嗜曙紅性較低(由箭頭指示)。原始放大倍數(shù)X 200。圖2A-H是來自嵌合體小鼠的組織學(xué)和免疫組織化學(xué)組織切片的數(shù)字照片。圖2A 是數(shù)字照片，顯示了 FAH陽性人肝細(xì)胞被整合到小鼠肝臟組織中，并且不擾亂受體肝臟的微觀結(jié)構(gòu)。圖2B是數(shù)字照片，顯示了高度再殖的嵌合肝臟也保留了正常的結(jié)構(gòu)。圖2C和 2D是H&E染色的數(shù)字照片，顯示了人肝細(xì)胞簇嗜曙紅性較低。圖2E是數(shù)字照片，顯示了對(duì) FAH染色的系列切片。圖2F是數(shù)字照片，顯示了對(duì)H印Par染色的系列切片。圖2G是來自高度再殖小鼠的腎臟切片的數(shù)字照片，顯示出即使在移植后4個(gè)月，也沒有腎小管或腎小球破壞。圖2H是數(shù)字照片，顯示了脾臟中FAH陽性的人肝細(xì)胞。原始放大倍數(shù)X100(圖 2C)，X 200 (圖 2A、2B、2E、2F 禾口 2G)，X 400 (圖 2D 和 2H)。圖3A是一系列凝膠切片，顯示了來自嵌合小鼠肝臟的RT-PCR產(chǎn)物。人ALB、FAH、 TAT、TF、TTR和UGTlAl基因在嵌合小鼠肝(#697和#785)中表達(dá)。人肝細(xì)胞和小鼠肝細(xì)胞被分別用作陽性和陰性對(duì)照。圖3B(正常作圖)和圖3C(對(duì)數(shù)作圖)是顯示了使用ELISA 測(cè)定的原代肝細(xì)胞受體的血液人白蛋白濃度的圖。所述系統(tǒng)的閾值濃度為大約0. 005 μ g/ ml。圖3D(正常作圖)和圖3E(對(duì)數(shù)作圖)是顯示了次級(jí)受體的人白蛋白濃度的圖。對(duì)數(shù)作圖顯示了白蛋白濃度的倍增時(shí)間是大約一周。圖4A是示意圖，顯示了從原代細(xì)胞開始(在最左側(cè)的深色框中)的連續(xù)的移植流程。深色框指示了再殖的連續(xù)受體，白色框指示未被移植的小鼠。只有1/4的初級(jí)受體被再殖，但是所有的6個(gè)次級(jí)受體都被移植了。圖4B是凝膠的數(shù)字照片，顯示了來自連續(xù)移植的受體肝臟的Alu序列的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4C-E是通過FAH免疫細(xì)胞化學(xué)分析的肝細(xì)胞的數(shù)字照片，證明了來自第三級(jí)小鼠的培養(yǎng)肝細(xì)胞中超過70%對(duì)FAH是陽性的。圖4F-H 是組織切片的數(shù)字照片，顯示了連續(xù)移植的小鼠肝臟的FAH免疫組織化學(xué)。初級(jí)(F)、次級(jí) (G)和第三級(jí)(H)受體肝臟均通過人肝細(xì)胞進(jìn)行了再殖。圖5A-C是嵌合小鼠肝細(xì)胞的抗小鼠白蛋白抗體和抗FAH抗體免疫細(xì)胞化學(xué)的數(shù)字照片。大多數(shù)來自嵌合肝臟的肝細(xì)胞是小鼠白蛋白或FAH單一陽性的。圖5D-F是嵌合小鼠肝細(xì)胞的抗人白蛋白抗體和抗FAH抗體免疫細(xì)胞化學(xué)的數(shù)字照片。大多數(shù)肝細(xì)胞是人白蛋白和FAH雙重陽性的。原始放大倍數(shù)X100。圖5G-5L是顯示了嵌合小鼠肝細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析的圖。使用了 FITC結(jié)合的抗HLA A、B、C抗體和PE結(jié)合的抗H-2Kb抗體。顯示了針對(duì)HLA-A、B、C的對(duì)照人肝細(xì)胞(G)；針對(duì)HLA-A、B、C的對(duì)照小鼠肝細(xì)胞(I)；針對(duì) H-2Kb的對(duì)照人肝細(xì)胞(H)；針對(duì)H-2Kb的對(duì)照小鼠肝細(xì)胞(J)；以及來自兩個(gè)高度嵌合小鼠的肝細(xì)胞(K和L)，它們各自對(duì)于HLA或H-2Kb是陽性的。圖6A和6B是顯示了乙氧基9_羥基_3_異吩噁唑酮_0_脫乙基酶(CYP1A1依賴) 的代謝(A)，以及睪酮向6-β-羥基睪酮的轉(zhuǎn)化(CYP3A4介導(dǎo)的)⑶的圖。分析了來自三只具有不同的人肝細(xì)胞再殖水平(Μ79010%;Μ69730%;Μ78560% )的小鼠的培養(yǎng)肝細(xì)胞。圖6C是描繪了通過定量RT-PCR測(cè)定的與藥物代謝、運(yùn)輸和綴合相關(guān)的人特異性基因的mRNA 水平的圖。人藥物代謝基因的比例是成年人肝細(xì)胞特有的。圖7A-7H是描繪了在來自三只具有不同的人肝細(xì)胞再殖水平(M79010 % ； M69730% ；M78560% )的小鼠的肝細(xì)胞中，肝臟特異性基因和參與肝細(xì)胞中藥物代謝的基因的基礎(chǔ)基因表達(dá)水平的圖。圖7A是三個(gè)樣品中針對(duì)小鼠肌動(dòng)蛋白mRNA標(biāo)準(zhǔn)化的肝臟特異性基因的基礎(chǔ)表達(dá)條形圖。圖7B-7H是響應(yīng)于β-萘黃酮(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)而對(duì)參與藥物代謝的mRNA的誘導(dǎo)的條形圖，相對(duì)于在未誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中的誘導(dǎo)。顯示的是 CYPA4 (B)，CYP2B6 (C)，CAR (核激素受體)(D)，MDRl (轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(E)，MRP (F)， BSEP(轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)(G)，以及PXR(核激素受體)(H)。CYP3A4被苯巴比妥的誘導(dǎo)甚至比在酶的水平上更顯著。圖8是從人源化FRG小鼠分離的肝細(xì)胞的FACS圖。細(xì)胞以抗人⑶46抗體和抗小鼠肝細(xì)胞(HC)表面標(biāo)記物抗體共染色。大多數(shù)(> 85% )肝細(xì)胞是人的。序列表在隨附的序列列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用了核苷酸堿基的標(biāo)準(zhǔn)字母縮寫和氨基酸的三字母編碼，正如在37C. F. R. 1. 822中定義的。每個(gè)核酸序列只顯示了一條鏈，但是應(yīng)該理解對(duì)所顯示的鏈的任何引用也包含了互補(bǔ)鏈。序列表以ASCII文本文件——2010年4月16日生成的附件C/St. 25文本文件， 17KB——提交，該文本文件以引用的方式納入本文。在隨附的序列列表中SEQ ID NO :1和2是用于擴(kuò)增人Alu序列的PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 3是人ALB的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 4是人ALB的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 5是小鼠Alb的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 6是小鼠Alb的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 7是人TAT的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 8是人TAT的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 9是人TF的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 10是人TF的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 11是人FAH的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO 12是人FAH的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 13是人TTR的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 14是人TTR的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 15是人UGTlAl的正向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 16是人UGTlAl的反向RT-PCR引物的核酸序列。SEQ ID NO 17和18分別是人IL-1RA的核酸和氨基酸序列(在2003年1月24日以 GenBank 登記號(hào) No. NM 000577. 3 登記)。SEQ ID NO 19和20分別是小鼠IL-1RA的核酸和氨基酸序列(在2007年4月6 日以 GenBank 登記號(hào) No. NM 001039701 登記)。SEQ ID NO 21是阿那白滯素(anakinra)的氨基酸序列。
具體實(shí)施例方式I.縮寫AAV腺相關(guān)病毒ALB白蛋白ALT丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶AST天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶BNFβ -萘黃酮CMV巨細(xì)胞病毒DAB二氨基聯(lián)苯胺ELISA酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法EROD乙氧基9-羥基_3_異吩噁唑酮_0_脫乙基酶ES胚胎干細(xì)胞FACS熒光激活細(xì)胞分選術(shù)FAH延胡索酰乙酰乙酸水解酶FISH熒光原位雜交FITC異硫氰酸熒光素FRGFahi/Ragf^/IUrg+三重突變體小鼠H&E蘇木精和伊紅HBV乙型肝炎病毒HCV丙型肝炎病毒HLA人白細(xì)胞抗原HTl1型遺傳性酪氨酸血癥IL-I白細(xì)胞介素-1IL-IR白細(xì)胞介素-1受體IL-IRA白細(xì)胞介素_1受體拮抗劑IL-IRAP白細(xì)胞介素_1受體輔助蛋白IL-2RY白細(xì)胞介素_2受體γiPS誘導(dǎo)多能干IPSC誘導(dǎo)多能干細(xì)胞MHC主要組織相容性復(fù)合物mTOR雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶NOD非肥胖糖尿病NTBC2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?_1，3環(huán)己二酮PB苯巴比妥PBS磷酸鹽緩沖鹽水PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PE藻紅蛋白PFU噬斑形成單位
RAG重組酶活化基因Rif利福平RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)SA琥珀酰丙酮SCID重度聯(lián)合免疫缺陷TAT酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶TF轉(zhuǎn)鐵蛋白TTR運(yùn)甲狀腺素蛋白UGTlAl UDP葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1家族，多肽AluPA尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑II.術(shù)語和方法除非特別指明，技術(shù)術(shù)語按照常規(guī)用法使用。分子生物學(xué)中常用術(shù)語的定義可見于 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press,1994(ISBN 0-19-854287-9) ；Kendrew et al. (eds. ), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9)；以及 Robert A. Meyers (ed. ) , Molecular Biology and Biotechnology -.a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc.，1995(ISBN 1-56081-569-8)。為了便于瀏覽本發(fā)明的各種不同實(shí)施方案，提供了下面對(duì)具體術(shù)語的解釋給藥通過任何有效途徑向受試者提供或給予試劑，例如治療劑。示例性給藥途徑包括但不限于注射(例如皮下、肌肉、真皮內(nèi)、腹膜內(nèi)和靜脈)、口服、管內(nèi)、舌下、直腸、經(jīng)皮、鼻內(nèi)、陰道和吸入途徑。抑制或阻止肝臟疾病發(fā)生的藥劑當(dāng)給予FRG小鼠、FpmRG小鼠或其他類型的Fah 缺陷小鼠時(shí)，在所述小鼠中阻止、延遲或抑制肝臟疾病發(fā)生的化合物或組合物。肝臟疾病或肝功能障礙的特征為多種體征或癥狀中的任何一種，包括但不限于肝組織學(xué)的改變 (例如壞死、炎癥、纖維化、發(fā)育異常或肝癌)，肝特異性酶和其他蛋白(例如天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白)的水平的改變，或肝總體衰竭(generalized liver failure)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抑制肝臟疾病的試劑是2_ (2_硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?-1，3環(huán)己二酮(NTBC)。羊水細(xì)胞在胚胎周圍的羊水中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。阿那白滯素白細(xì)胞介素-I(IL-I)受體拮抗劑。阿那白滯素可通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制 IL-I對(duì)IL-I受體的結(jié)合阻斷天然IL-I的生物學(xué)活性，IL-I受體在多種組織和器官中表達(dá)。IL-I在對(duì)炎癥刺激的應(yīng)答中產(chǎn)生，并介導(dǎo)多種生理學(xué)應(yīng)答，包括炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。 阿那白滯素是從經(jīng)遺傳修飾的大腸桿菌(Escherichia coli)培養(yǎng)物制備的重組的、非糖基化形式的人IL-1RA(IL-1受體拮抗劑)。阿那白滯素蛋白質(zhì)有153個(gè)氨基酸，具有大約 17. 3kD的分子量，與天然人IL-IRA(SEQ ID NO 18)的不同之處在于它在其氨基末端具有單個(gè)甲硫氨酸殘基(阿那白滯素的氨基酸序列在本文中列出為SEQ ID N0:21)。阿那白滯素還被稱為KINERETTM。拮抗劑抵消另一種化合物的效應(yīng)的化合物(例如藥物、蛋白質(zhì)或小分子)。在一些情況下，拮抗劑結(jié)合于具體的細(xì)胞受體，但不引發(fā)生物學(xué)反應(yīng)。
抗體包含一種或多種基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段編碼的多肽的蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)復(fù)合物)。公認(rèn)的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、Υ、δ、ε和μ 恒定區(qū)基因，以及無數(shù)的免疫球蛋白可變區(qū)基因。輕鏈被分類為κ或λ。重鏈被分類為 Υ、μ、α、δ或ε，它們相應(yīng)地分別定義了免疫球蛋白類型IgG, IgM, IgA, IgD和IgE0基本的免疫球蛋白(抗體)結(jié)構(gòu)單元一般是四聚體。每個(gè)四聚體由相同的兩對(duì)多肽鏈構(gòu)成，每對(duì)具有一條“輕鏈”(大約25kDa)和一條“重鏈”(大約50-70kDa)。每條鏈的 N-末端界定了大約100到110個(gè)或以上氨基酸的可變區(qū)，主要負(fù)責(zé)抗原識(shí)別。術(shù)語“可變輕鏈” (\)和“可變重鏈”(Vh)分別是指這些輕鏈和重鏈。本文中使用的術(shù)語“抗體”包括完整的免疫球蛋白以及許多已充分表征的片段。例如，與靶蛋白(或蛋白質(zhì)或融合蛋白中的表位)結(jié)合的FabS、FvS以及單鏈FVS(ScFVS)，也是該蛋白(或表位)的特異性結(jié)合劑。這些抗體片段定義如下(l)Fab，含有抗體分子的單價(jià)抗原結(jié)合片段的片段，通過用木瓜蛋白酶消化完整抗體而得到完整的輕鏈和一條重鏈的一部分而產(chǎn)生；(2)Fab'，通過用胃蛋白酶處理完整抗體，然后還原產(chǎn)生完整的輕鏈和重鏈的一部分而獲得的抗體分子的片段；每個(gè)抗體分子獲得兩個(gè)Fab'片段；(3) (Fab' )2， 通過用胃蛋白酶處理整個(gè)抗體，隨后不進(jìn)行還原而獲得的抗體的片段；(4)F(ab' )2，通過兩個(gè)二硫鍵連接在一起的兩個(gè)Fab'片段的二聚體；(5)Fv，遺傳工程的片段，含有表達(dá)為兩條鏈的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)；以及(6)單鏈抗體，含有輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的遺傳工程分子，所述輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)通過適合的肽接頭連接成遺傳融合的單鏈分子。制造這些片段的方法是常規(guī)的(參見，例如Harlow and Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, CSHL, New York,1999)。用于本公開內(nèi)容的方法的抗體可以是單克隆的或多克隆的。僅舉例來說，單克隆抗體可以用鼠類雜交瘤按照Kohler和Milstein的經(jīng)典方法(Nature 256:495-97， 1975)或其衍生方法制備。單克隆抗體生產(chǎn)的詳細(xì)步驟記載在Harlow and Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, CSHL, New York,1999 中?？乖梢栽趧?dòng)物中刺激抗體產(chǎn)生或T細(xì)胞應(yīng)答的化合物、組合物或物質(zhì)，包括注射或吸收至動(dòng)物中的組合物?？乖膳c具有特異性體液免疫或細(xì)胞免疫性的產(chǎn)物反應(yīng)?！安≡w特異性抗原”是抗原，例如由病原體(例如病毒、細(xì)菌或寄生蟲)表達(dá)的在受試者中可引發(fā)免疫反應(yīng)的蛋白質(zhì)。硫唑嘌呤(azathioprine)作為嘌呤合成抑制劑的免疫抑制劑，抑制細(xì)胞特別是白細(xì)胞增殖。該免疫抑制劑經(jīng)常用于治療自身免疫病或器官移植排斥。它是一種前藥，在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成活性代謝物6-巰基嘌呤(6-MP)和硫代肌苷酸。硫唑嘌呤由多個(gè)一般制造商 (generic manufacturer)制備，以及具有商品名(Salix 的 Azasan ;GlaxoSmithKline 的 Imuran ；Azamun ；和 Imure 1 )。B細(xì)胞一種類型的淋巴細(xì)胞，在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。B細(xì)胞的基本功能是制造針對(duì)可溶性抗原的抗體。B細(xì)胞是獲得性免疫系統(tǒng)的必要組分。生物樣品或樣品獲自受試者的細(xì)胞、組織或體液，例如外周血、血清、血漿、腦脊液、骨髓、尿、唾液、組織活檢切片(biopsy)、手術(shù)標(biāo)本和尸檢材料的樣品。肝硬化是指一組慢性肝臟疾病，特征在于失去正常的微觀小葉結(jié)構(gòu)，并且以結(jié)締組織的纖維束再生性地替換壞死的組織，這最終使該器官收縮并分成不規(guī)則小結(jié)。肝硬化具有長(zhǎng)潛伏期，之后通常突然腹疼和腫脹，伴有嘔血、墜積性水腫或黃疸。在后期，可能有腹水、明顯黃疸、門靜脈高血壓、靜脈曲張和中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，最終導(dǎo)致肝昏迷。收集本文中使用的“收集”擴(kuò)增的人肝細(xì)胞，是指從已經(jīng)注射過分離的人肝細(xì)胞的小鼠(也被稱為受體小鼠)取出擴(kuò)增的肝細(xì)胞的過程。收集任選地包括將肝細(xì)胞與其他細(xì)胞類型分離開。在一個(gè)實(shí)施方案中，從Fah缺陷小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人肝細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，從FRG小鼠或FpmRG小鼠的肝臟收集擴(kuò)增的人肝細(xì)胞。白細(xì)胞介素受體的共同Y鏈(I12rg):編碼白細(xì)胞介素受體的共同Y鏈的基因。 I12rg是許多白介素的受體成分，所述白介素包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(Di Santo et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :377_381，1995)。I12rg 缺陷的動(dòng)物表現(xiàn)出 B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞減少，并缺乏自然殺傷細(xì)胞。I12rg也被稱為白細(xì)胞介素-2受體γ鏈。冷凍保存的本文使用的“冷凍保存的”是指通過冷卻到較低的零下溫度(例如 77K或-196°C (液氮的沸點(diǎn)))來保存或維持的細(xì)胞或組織。在這些低溫下，任何生物活性 (包括導(dǎo)致細(xì)胞死亡的生物化學(xué)反應(yīng))都被有效停止。環(huán)孢菌素A 作為土壤真菌雪白白僵霉菌(Beauveria nivea)產(chǎn)生的具有11個(gè)氨基酸的非核糖體環(huán)肽的免疫抑制劑化合物。環(huán)孢菌素A可在器官和組織移植中用于預(yù)防移植排斥。環(huán)孢菌素A也被稱為環(huán)孢菌素A(cyclosporine)和環(huán)孢素(ciclosporin)。降低的肝功能用于度量肝的健康或功能的許多參數(shù)中任何一個(gè)的異常變化。降低的肝功能在本文中也被稱為“肝功能障礙”。肝功能可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中公知的許多手段中的任何一種進(jìn)行評(píng)價(jià)，例如但不限于檢查肝組織學(xué)和測(cè)量肝酶或其他蛋白質(zhì)。例如， 肝功能障礙可以由肝的壞死、炎癥、纖維化、氧化損傷或發(fā)育異常所指示。在某些情況下，肝功能障礙由肝癌指示，例如肝細(xì)胞癌?？梢员粶y(cè)試以評(píng)估肝功能障礙的肝酶和蛋白質(zhì)的實(shí)例，包括但不限于丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白。肝功能障礙也可以導(dǎo)致肝總體衰竭。用于測(cè)試肝功能的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的，例如由 Grompe 等(Genes Dev. 7 :2298_2307，1993)和 Manning 等(Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 96 11928-11933，1999)所講述的。缺陷本文中使用的“Fah缺陷”或“Fah中的缺陷”是指動(dòng)物(例如小鼠)在Fah 中含有突變，導(dǎo)致了 Fah mRNA表達(dá)和/或功能性FAH蛋白的顯著減少或不存在。本文使用的術(shù)語功能性FAH蛋白“喪失表達(dá)”不是僅指完全喪失表達(dá)，而且還包括功能性FAH蛋白表達(dá)的顯著降低，例如降低約80%、約90%、約95%或約99%。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷的動(dòng)物在Fah基因中含有純合型中斷，例如純合型缺失。中斷包括例如插入、缺失、一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，或者它們的任意組合。作為一個(gè)實(shí)例，一種純合的缺失是在Fah的外顯子5 中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah缺陷的動(dòng)物在Fah基因中含有一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。適合的 Fah點(diǎn)突變的實(shí)例在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見例如Aponte et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 98 (2) =641-645, 2001)。類似地，"IL-IR 缺陷”或“ IL-IR 中的缺陷”是指包含 IL-IR突變的動(dòng)物例如小鼠，所述突變導(dǎo)致IL-IR mRNA表達(dá)和/或功能性IL-IR蛋白顯著減少或喪失。IL-IR敲除小鼠以前已有記載(參見例如Norman et al.，Ann. Surg. 223 (2) 163-169,1996 ；Glaccum et al.，J. Immunol. 159 :3364_3371，1997)，并可市購獲得，例如來自 The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)。另夕卜，Ragl 缺陷、Rag2 缺陷禾口 I12rg 缺陷是指這樣的動(dòng)物，即分別包含Ragl、Rag2和I12rg突變，導(dǎo)致mRNA表達(dá)或功能性蛋白質(zhì)的
12產(chǎn)生顯著降低或喪失。Ragl、Rag2和I12rg敲除小鼠以前已有記載，并可市購獲得。消除減少或除去。本文中使用的“巨噬細(xì)胞消除”是指清除、除去、減少或殺死動(dòng)物中的巨噬細(xì)胞的過程。已經(jīng)被消除巨噬細(xì)胞的動(dòng)物，不必完全不含巨噬細(xì)胞，但是至少表現(xiàn)出巨噬細(xì)胞數(shù)量的減少或活性的降低。在一個(gè)實(shí)施方案中，巨噬細(xì)胞消除導(dǎo)致功能性巨噬細(xì)胞減少了至少10 %、至少25 %、至少50 %、至少75 %、至少90 %或100 %。中斷本文使用的基因“中斷”是指任何插入、缺失或點(diǎn)突變，或者它們的任意組合。在一些實(shí)施方案中，所述中斷可導(dǎo)致mRNA表達(dá)和/或功能性蛋白質(zhì)部分或完全喪失。胚胎干(ES)細(xì)胞從發(fā)育中的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)分離的多能細(xì)胞。ES細(xì)胞是多能細(xì)胞，意味著它們可以產(chǎn)生身體中存在的所有細(xì)胞(骨骼、肌肉、腦細(xì)胞等)。用于產(chǎn)生鼠類ES細(xì)胞的方法可見于美國(guó)專利No. 5，670，372。用于產(chǎn)生人ES細(xì)胞的方法可見于美國(guó)專利 No. 6，090, 622,PCT 公布 No. WO 00/70021 和 PCT 公布 No. WO 00/27995。本文還考慮誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)，這是通過誘導(dǎo)某些基因(例如0CT3/4、S0X2、NANOG, LIN28、Klf4 和/或c-Myc)表達(dá)從非多能細(xì)胞(例如成年體細(xì)胞)以人工方法得到的一種多能干細(xì)胞類型(Yu et al.，Science318(5858) 1917-1920，2007 ；Takahashi et al.，Celll31(5) 861-872，2007)。迄今，已經(jīng)報(bào)道了來自小鼠(Okita et al. ,Nature 448(7151) :313_317， 2007)、人(Yu et al. , Science 318(5858) 1917-1920,2007 ；Takahashi et al., Celll31(5) :861_872，2007)、大鼠(Li et al.，Cell Stem Cell4(l) 16-19，2009)、猴子 (Liu et al. ,Cell Stem Cell3(6) :587_590，2008)和豬(Esteban et al. , J. Biol. Chem. Epub April 21,2009)的 iPS 細(xì)胞。移入將細(xì)胞或組織植入到動(dòng)物中。本文中使用的人肝細(xì)胞移入受體小鼠中，是指人肝細(xì)胞在注射后開始被植入到受體小鼠中的過程。移入的人肝細(xì)胞能夠在受體小鼠中擴(kuò)增。正如本文所述，“顯著的移植”是指在受體小鼠中，肝臟中至少大約的肝細(xì)胞是人的。 “高度移植的”小鼠，是其肝臟中至少大約60%的肝細(xì)胞是人的小鼠。但是，移植效率可以更高，例如所述小鼠肝臟中至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%或至少大約95% 的肝細(xì)胞是人肝細(xì)胞。擴(kuò)增增加數(shù)量。本文中使用的“擴(kuò)增”人肝細(xì)胞，是指允許細(xì)胞分裂發(fā)生，使得人肝細(xì)胞的數(shù)量增加的過程。正如本文所述，使人肝細(xì)胞在受體小鼠中擴(kuò)增至少大約4周、至少大約6周、至少大約8周、至少大約12周、至少大約16周、至少大約20周、至少大約24周或至少大約28周。在一個(gè)實(shí)施方案中，使人肝細(xì)胞擴(kuò)增最多達(dá)大約6個(gè)月。在其他實(shí)施方案中，允許所述人肝細(xì)胞擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)約8、約10或約12個(gè)月。通過擴(kuò)增產(chǎn)生的人肝細(xì)胞的數(shù)量可以是不同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，擴(kuò)增產(chǎn)生了至少1千萬、至少2千萬、至少3千萬、 至少4千萬或至少5千萬個(gè)肝細(xì)胞。假設(shè)最初注射了 1百萬個(gè)肝細(xì)胞，并且有大約10%移入，則肝細(xì)胞擴(kuò)增可以在大約10倍到大約500倍的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞在受體小鼠中的擴(kuò)增，導(dǎo)致增加了至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200 倍、至少250倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或至少1000倍。FK506 :FK506 也被稱為他克莫司(tacrolimus)或藤霉素(fujimycin)，是一種免疫抑制藥物。Π 506是一種23元大環(huán)內(nèi)酯，最初在包含筑波鏈霉菌(Sti^ptomyces tsukubaensis)的日本土樣的發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)。該化合物經(jīng)常用在同種異體器官移植后，以減少患者免疫系統(tǒng)的活性并降低器官排斥的風(fēng)險(xiǎn)。Π(506可降低T細(xì)胞和白細(xì)胞介素_2活性。它還被以局部用制劑形式用于治療骨髓移植后的嚴(yán)重特應(yīng)性皮炎(濕疹)、嚴(yán)重頑固性葡萄膜炎和皮膚病癥白癜風(fēng)。氟達(dá)拉濱(fludarabine)抑制DNA合成的嘌呤類似物。氟達(dá)拉濱經(jīng)常被用作化學(xué)治療藥，用于治療多種血液學(xué)惡性病。FRG小鼠在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、重組酶活化基因2 (Rag2)和白細(xì)胞介素受體的共同、鏈(I12rg)基因中具有純合缺失的突變小鼠。在本文中也被稱為Fah+/ Rag2+/I12rg+。本文中使用的Fah、Rag2和I12rg基因中的純合缺失，是指在含有所述突變的小鼠中不表達(dá)功能性FAH、RAG-2和IL-2R Y蛋白。FpmRG小鼠在重組酶活化基因2(Rag2)、和白細(xì)胞介素受體的共同Y鏈(I12rg) 基因中具有純合缺失，以及在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)中具有純合點(diǎn)突變的突變小鼠。在FpmRG小鼠的Fah基因中的點(diǎn)突變，導(dǎo)致了 mRNA中的錯(cuò)誤拼接和外顯子7的丟失 (Aponte et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :641_645，2001)。在本文中也稱為 Fahpm/ Rag2+/I12rg+。本文中使用的Rag2和I12rg基因中的純合缺失，是指在含有突變的小鼠中不表達(dá)功能性RAG-2和IL-2RY蛋白。此外，在Fah基因中具有純合點(diǎn)突變的小鼠，不表達(dá)功能性FAH蛋白。延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)催化酪氨酸分解代謝最后一步的代謝酶。具有 Fah基因的純合缺失的小鼠表現(xiàn)出改變的肝臟mRNA表達(dá)和嚴(yán)重的肝功能障礙(Grompe et al.，Genes Dev. 7 =2298-2307,1993) Fah基因中的點(diǎn)突變還已被證明可引起肝衰竭和產(chǎn)后致死(postnatal lethality) (Aponte et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 98 (2) 641-645,2001)。Fah缺陷的人會(huì)形成肝臟疾病1型遺傳性酪氨酸血癥(HTl)并形成肝衰竭。Fah缺陷可導(dǎo)致延胡索酰乙酰乙酸(強(qiáng)氧化劑)積累，這最終可導(dǎo)致Fah缺陷的肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡。因此，F(xiàn)ah缺陷動(dòng)物可以以來自包括人的其他物種的肝細(xì)胞再殖。逐漸降低本文中使用的“逐漸降低”NTBC的劑量，是指隨著時(shí)間、例如經(jīng)過幾天時(shí)間減少施用于Fah缺陷小鼠的NTBC劑量的過程。在一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC劑量在大約6 天的時(shí)間內(nèi)逐漸降低，其中劑量以大約1或2天的間隔降低，使得在大約1周后，不再給予 NTBC。NTBC的逐漸降低可以在更短或更長(zhǎng)的時(shí)間過程中進(jìn)行，劑量減少之間的時(shí)間間隔也可以更短或更長(zhǎng)。肝臟病原體是指可感染肝細(xì)胞的任何病原體，例如細(xì)菌、病毒或寄生病原體。在一些實(shí)施方案中，所述肝臟病原體是“嗜肝病毒”(靶向肝的病毒)，例如HBV或HCV。肝細(xì)胞癌(HCC) :HCC是肝臟的原發(fā)性惡性病，一般出現(xiàn)在具有由病毒性肝炎、肝毒素或肝硬化引起的炎性肝的患者中。肝細(xì)胞一種細(xì)胞類型，占肝臟細(xì)胞質(zhì)質(zhì)量的70-80%。肝細(xì)胞參與蛋白質(zhì)合成， 蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和碳水化合物轉(zhuǎn)化，膽固醇、膽汁鹽和磷脂的合成，以及外源和內(nèi)源物質(zhì)的解毒、修飾和排泄。肝細(xì)胞也引發(fā)膽汁的形成和分泌。肝細(xì)胞制造血清白蛋白、纖維蛋白原和凝血因子的凝血酶原組，并且是脂蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、補(bǔ)體和糖蛋白合成的主要位點(diǎn)。此外，肝細(xì)胞具有代謝、解毒和滅活外源化合物(例如藥物和殺蟲劑)以及內(nèi)源化合物(例如類固醇)的能力。1型遺傳性酪氨酸血癥(HTl)酪氨酸血癥是一種代謝錯(cuò)誤，通常是先天的，其中身體不能有效降解酪氨酸。HTl是該病癥的最嚴(yán)重形式，并且是由人15號(hào)染色體上Fah基因編碼的延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)的不足引起。FAH是在降解酪氨酸需要的5個(gè)酶系列中的最后一個(gè)。HTl的癥狀通常出現(xiàn)在生命最初幾個(gè)月，包括無法增加體重和無法以預(yù)期速度生長(zhǎng)(發(fā)育停滯)、腹瀉、嘔吐、皮膚泛黃和眼睛發(fā)白(黃疸)、元白菜樣氣味和出血傾向增加(特別是鼻出血)。HTl可以導(dǎo)致肝衰竭和腎衰竭、影響神經(jīng)系統(tǒng)的問題和肝癌風(fēng)險(xiǎn)增加。雜合的在相應(yīng)染色體基因座具有不同等位基因。例如，對(duì)于具體基因突變雜合的動(dòng)物在所述基因的一個(gè)等位基因有突變，但另一個(gè)沒有突變。純合的在一個(gè)或多個(gè)基因座處具有同樣的等位基因。本文中使用的“對(duì)于中斷純合”，是指生物體在基因的兩個(gè)等位基因具有同樣的中斷(例如插入、缺失或點(diǎn)突變)。免疫缺陷缺乏免疫系統(tǒng)的至少一種必需功能。本文中使用的“免疫缺陷”小鼠是缺乏免疫系統(tǒng)的特定組分或缺乏免疫系統(tǒng)的特定組分的功能的小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠缺乏功能性B細(xì)胞、T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠還缺乏巨噬細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，“免疫缺陷小鼠”包含一個(gè)或多個(gè)如下遺傳改變Ragl+、Rag2+、I12rg+、SCID、NOD和裸鼠。免疫缺陷小鼠株系是本領(lǐng)域中公知的， 并且可市購獲得，例如來自杰克遜實(shí)驗(yàn)室(The Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME)或 Taconic (Hudson, NY)。在一些實(shí)施方案中，免疫缺陷小鼠是已經(jīng)被給予一種或多種免疫抑制劑的小鼠。免疫抑制劑可降低免疫系統(tǒng)一個(gè)或多個(gè)方面的功能或活性的任何化合物，例如體液或細(xì)胞免疫系統(tǒng)或者補(bǔ)體系統(tǒng)的組分。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述免疫抑制劑為Π(506、環(huán)孢霉菌A、氟達(dá)拉濱、麥考酚酯(mycophenolate)、潑尼松(prednisone)、雷帕霉素(rapamycin)或硫唑嘌呤，或者它們的結(jié)合物。已知免疫抑制劑包括但不限于(1)抗代謝藥物，例如嘌呤合成抑制物(例如硫唑嘌呤和麥考酚酸)、嘧啶合成抑制劑(例如來氟米特(leflunomide)和特立氟胺 (terifIunomide))和抗葉酸素(如甲氨喋呤)；(2)大環(huán)內(nèi)酯類，例如Π(506、環(huán)孢菌素A和吡美莫司(Pimecrolimus) ； (3) TNF- α抑制劑，例如酞胺哌啶酮(thalidomide)和雷利度胺 (Ienalidomide) ； (4) IL-I受體拮抗劑例如阿那白滯素；(5)雷帕霉素哺乳動(dòng)物靶(mTOR) 抑制劑，例如雷帕霉素(西羅莫司(sirolimus))、deforolimus、依維莫司(everolimus)、 temsirolimus、佐他莫司(zotarolimus)和biolimus A9 ； (6)皮質(zhì)類固醇類，例如潑尼松； 和(7)針對(duì)許多細(xì)胞或血清靶中任一個(gè)的抗體。示例性細(xì)胞靶和它們各自的抑制化合物包括但不限于補(bǔ)體成分5 (例如依庫珠單抗(eculizumab))、腫瘤壞死因子(TNF)(例如英夫利昔單抗(infliximab)、阿達(dá)木單抗(adalimumab)、賽妥珠單抗(certolizumab pegol)、阿非莫單抗(afelimomab) 和戈利木單抗(golimumab)) ；IL-5 (例如美泊利單抗(m印olizumab)) ；IgE(例如奧馬珠單抗(omalizumab)) ；BAYX (例如奈瑞莫單抗(nerelimomab))；干擾素(例如法拉莫單抗(faral imomab)) ；IL-6 (例如艾西莫單抗(el si 1 imomab)) ；IL-12 和 IL_13(例如來金珠單抗(Iebrikizumab)和優(yōu)特克單抗(ustekinumab)) ；CD3 (例如莫羅單抗-CD3(muromonab-CD3)、奧昔珠單抗(otelixizumab)、替利珠單抗(teplizumab)、維西珠單抗(visilizumab)) ；CD4(例如克立昔單抗(clenoliximab)、凱利昔單抗(keliximab) 和扎木單抗(zanoIimumab))；⑶Ila(例如依法利珠單抗(efalizumab))；⑶18 (例如厄利珠單抗(erlizumab)) ；CD20 (例如阿托珠單抗(afutuzumab)、奧瑞珠單抗(ocrelizumab)、 帕利珠單抗(pasco Iizumab)) ；CD23(例如魯昔單抗(Iumiliximab)) ；CD40(例如替奈昔單抗(teneliximab)、托利珠單抗(toralizumab)) ；CD62L/L-選擇蛋白(例如阿塞珠單抗(aselizumab)) ；CD80 (例如加利昔單抗(galiximab)) ；CD147/basigin (例如加維莫單抗(gavi Iimomab)) ；CD154 (例如魯利單抗(ruplizumab)) ；BLyS(例如貝利單抗(Belimumab)) ；CTLA_4(例如伊匹單抗(ipilimumab)、曲美木單抗(tremelimumab))； CAT(例如柏替木單抗(bertilimumab)、樂地單抗(Ierdelimumab)、美替木單抗 (meteIimumab))；整聯(lián)蛋白(例如那他珠單抗(natalizumab)) ；IL-6受體(例如托珠單抗 (Tocilizumab)) ；LFA-1 (例如奧度莫單抗(odulimomab))；以及IL-2受體/CD25 (例如巴利昔單抗(basiliximab)、達(dá)克珠單抗(daclizumab)、伊諾莫單抗(inolimomab))。其他免疫抑制劑包括阿佐莫單抗(zolimomab aritox)、阿托木單抗 (atorolimumab)、西利珠單抗(cedelizumab)、達(dá)利珠單抗(dorlixizumab)、芳妥珠單抗(fontolizumab)、gantenerumab、gomiliximab> 馬司莫單抗(maslimomab)、莫羅木單抗(morolimumab)、培克珠單抗(pexelizumab)、瑞利珠單抗(reslizumab)、羅維珠單抗(rovel izumab)、希普利珠單抗(sipl izumab)、他利珠單抗(tal izumab)、阿替莫單抗(telimomab aritox)、伐禾lJ 昔單抗(vapaliximab)、維中白莫單抗(vepalimomab)、 抗胸腺細(xì)胞球蛋白、抗淋巴細(xì)胞球蛋白；CTLA-4抑制劑(例如阿貝西普(abatac印t)、 貝拉西普(belatacept))；阿柏西普(aflibercept)；來伐西普(alefacept)；列洛西普 (rilonacept)；以及TNF抑制劑(例如依那西普(etanerc印t))。免疫抑制是指降低免疫系統(tǒng)活性或功能的作用。免疫抑制可以通過給予免疫抑制劑化合物實(shí)現(xiàn)，或者可以是疾病或病癥的效應(yīng)(例如，由HIV感染引起或由于遺傳缺陷引起的免疫抑制)。白細(xì)胞介素-I(IL-I)術(shù)語“IL-1”包括IL-Ia和IL-1 β。IL-1 α是一種參與多種免疫反應(yīng)、炎癥性過程和血細(xì)胞生成的多效細(xì)胞因子。IL-Ia由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞以前蛋白形式產(chǎn)生，該前蛋白響應(yīng)于細(xì)胞損傷而經(jīng)蛋白水解加工并釋放，從而誘導(dǎo)凋亡。 IL-I β由活化巨噬細(xì)胞以前蛋白形式產(chǎn)生，該前蛋白被胱天蛋白酶1蛋白水解加工成其活性形式。IL-I β是炎癥應(yīng)答的重要介導(dǎo)物，參與多種細(xì)胞活性，包括細(xì)胞增殖、分化和凋亡。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(IPSC)通過誘導(dǎo)某些基因表達(dá)而從非多能細(xì)胞(通常是成體細(xì)胞)以人工方法獲得的多能干細(xì)胞類型。IPSC可以來自于任何生物，例如哺乳動(dòng)物。在一些實(shí)施方案中，IPSC產(chǎn)生自小鼠、大鼠、兔、豚鼠、山羊、豬、牛、非人靈長(zhǎng)類或人。例如，人源 IPSCoIPSC在許多方面類似于ES細(xì)胞，例如某些干細(xì)胞基因和蛋白質(zhì)的表達(dá)、染色質(zhì)甲基化模式、倍增時(shí)間、胚狀體形成、畸胎瘤形成、活嵌合體形成以及潛能和分化能力。用于產(chǎn)生IPSC的方法是本領(lǐng)域中已知的。例如，IPSC—般是通過將某些干細(xì)胞相關(guān)基因(例如 0ct-3/4(Pouf51)和Sox2)轉(zhuǎn)染至非多能細(xì)胞(例如成體成纖維細(xì)胞)中生成。轉(zhuǎn)染可以病毒載體(例如反轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒或腺病毒)實(shí)現(xiàn)。例如，細(xì)胞可以使用反轉(zhuǎn)錄病毒系統(tǒng)以0ct3/4、Sox2、Klf4和c_Myc轉(zhuǎn)染，或者使用慢病毒系統(tǒng)以0CT4、S0X2、NANOG和LIN28 轉(zhuǎn)染。在3-4周后，少量轉(zhuǎn)染的細(xì)胞開始在形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)上變得與多能干細(xì)胞相似，并且一般通過形態(tài)學(xué)選擇、倍增時(shí)間或者通過報(bào)道基因和抗生素選擇進(jìn)行分離。在一個(gè)實(shí)例中，通過 Yu et al. (Science 318(5854) 1224,2007)或 Takahashi et al. (Cell 131(5) 861-72,2007)的方法生成來自成體細(xì)胞的IPSC。IPSC也被稱為iPS細(xì)胞。感染負(fù)荷(infectious load):是指受試者中或來自所述受試者的樣品中具體病原體的量。感染負(fù)荷可以使用本領(lǐng)域中已知的多種方法的任一種測(cè)量。所選的方法將根據(jù)待檢測(cè)病原體的類型和可用于檢測(cè)所述病原體的試劑而變化。例如，感染負(fù)荷還可以通過確定所述病原體滴度進(jìn)行測(cè)量，用于確定所述病原體滴度的方法將根據(jù)待檢測(cè)的病原體而變化。例如，一些病毒的滴度可以通過進(jìn)行噬菌斑測(cè)定法進(jìn)行定量。在一些實(shí)例中，感染負(fù)荷是通過定量樣品中病原體特異性抗原的量進(jìn)行測(cè)量。在其他實(shí)例中，感染負(fù)荷是通過定量樣品中病原體特異性核酸分子的量進(jìn)行測(cè)量。定量包括確定數(shù)量值，或者可以是相對(duì)值。白細(xì)胞介素-1受體(IL-IR)屬于白細(xì)胞介素1受體家族的細(xì)胞因子受體。該蛋白是IL-Ia、IL_li3和白細(xì)胞介素_1受體拮抗劑(IL-IRA)的受體。它是參與多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答和炎癥應(yīng)答的重要介導(dǎo)物。術(shù)語“IL-1R” 一般包括I型IL-IR和II型 IL-IR0在本公開內(nèi)容的上下文中，“IL-1R”是指I型IL-1R。IL-IR拮抗劑(IL-IRA)可結(jié)合于IL-IR或IL-IR輔助蛋白并抑制IL-IR介導(dǎo)的活化的分子。IL-IR拮抗劑(IL-IRA)也是具體蛋白質(zhì)的名稱，所述具體蛋白質(zhì)是可與細(xì)胞表面上與IL-I的相同受體結(jié)合的IL-I細(xì)胞因子家族成員。所述IL-IRA蛋白可抑制IL-I α和 IL-I β活性，并調(diào)節(jié)多種IL-I相關(guān)的免疫應(yīng)答和炎癥應(yīng)答。IL-IRA也被稱為IRAP、IL1RA、 IL-lra3 和 IL1RN。白細(xì)胞介素-1受體輔助蛋白(IL-IRAP)該基因編碼一種IL-I受體輔助蛋白。 IL-I通過在細(xì)胞膜上與IL-IR和IL-IRAP形成復(fù)合體，可在感染、組織損傷或應(yīng)激過程中誘導(dǎo)急性期和促炎癥蛋白質(zhì)的合成。IL-IRAP的可變剪接可產(chǎn)生編碼兩種不同的同種型—— 一種是膜結(jié)合的，一種是可溶的——的兩種轉(zhuǎn)錄物變體。IL-IRAP也被稱為IL1R3、IL-IRAcP 禾口 IL1RAP。分離的“分離的”生物組分(例如核酸、蛋白質(zhì)(包括抗體)或細(xì)胞器)已經(jīng)基本上被與所述組分天然存在的環(huán)境(例如細(xì)胞)中的其他生物組分——即其他染色體的和染色體外的DNA和RNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器——分開或從中純化出來。已“分離”的核酸和蛋白質(zhì)包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸和蛋白質(zhì)。該術(shù)語還涵蓋在宿主細(xì)胞中通過重組表達(dá)制備的核酸和蛋白質(zhì)，以及化學(xué)合成的核酸。“分離的肝細(xì)胞”是指已經(jīng)從具體的來源(例如器官供體)獲得的肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，“分離的肝細(xì)胞”是已經(jīng)從供者體內(nèi)取出的肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，“分離的肝細(xì)胞”是懸浮液中的肝細(xì)胞，或組織塊中包含的肝細(xì)胞。在具體的實(shí)例中，分離的肝細(xì)胞是與其他細(xì)胞類型基本上分離或從中純化出來的肝細(xì)胞，或者從其他組織類型(例如脂肪組織或纖維組織)中純化出來的肝細(xì)胞。巨噬細(xì)胞組織中源自于被稱為單核細(xì)胞的特定白細(xì)胞的一種細(xì)胞。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都是吞噬細(xì)胞，在脊椎動(dòng)物的非特異性防御(或先天免疫)以及特異性防御(或細(xì)胞介導(dǎo)的免疫)中都發(fā)揮作用。它們的功能是作為靜止或運(yùn)動(dòng)細(xì)胞吞噬(吞沒然后消化)細(xì)胞碎片和病原體，并刺激淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞對(duì)病原體作出響應(yīng)。雷帕霉素的哺乳動(dòng)物靶(mTOR)抑制劑可抑制mTOR的表達(dá)或活性的分子。mTOR 抑制劑包括但不限于小分子、抗體、肽和核酸抑制劑。例如，mTOR抑制劑可以是可抑制mTOR的激酶活性或者可抑制mTOR與配體結(jié)合的分子。mTOR的抑制劑還包括可下調(diào)mTOR表達(dá)的分子。本領(lǐng)域中已知很多mTOR抑制劑，包括雷帕霉素(西羅莫司)。麥考酚酯通常用于防止同種異體移植物排斥的免疫抑制劑。該藥通常口服或靜脈內(nèi)給藥。麥考酚酯源自真菌匍匐莖青霉菌(Penicillium stoloniferum)。前藥形式—— 嗎替麥考酚酯(Mycophenolate mofetil)在肝臟中被代謝成活性部分麥考酚酸。它可抑制肌苷一磷酸脫氫酶，該酶可控制B和T淋巴細(xì)胞增殖中使用的嘌呤合成的從頭途徑中鳥嘌呤一磷酸的合成速率。麥考酚酸通常以商品名CellC印t (嗎替麥考酚酯；Roche)和 Myfortic (麥考酚鈉(mycophenolate sodium) ；Novartis)市售。自然殺傷(NK)細(xì)胞一種形式的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，構(gòu)成了先天免疫系統(tǒng)的主要成分。NK細(xì)胞在腫瘤和病毒感染細(xì)胞的宿主排斥中發(fā)揮了主要作用。非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是指遺傳上傾向于自發(fā)形成自身免疫性胰島素依賴型糖尿病(IDDM)的小鼠。對(duì)IDDM的易感性是多基因的，環(huán)境對(duì)基因外顯率有很強(qiáng)效應(yīng)° 所述 NOD 品系在 Shionogi Research Laboratories in Aburahi, Japan (Makino et al. ,"Establishment of the non-obese diabetic(NOD)mouse," In Current Topics in Clinical and Experimental Aspects of Diabetes Mellitus. Elsevier, Amsterdam, pages25-32,1985 ；Makino et al.，Exp. Anim. 29 :1_8，1980)開發(fā)。NTBC(2-(2_硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?-l，3環(huán)己二酮)4_羥基-苯基丙酮酸雙加氧酶(HPPD)的抑制劑。HPPD可催化4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)化成尿黑酸——酪氨酸分解代謝中的第二步。以NTBC進(jìn)行的處理可在該步驟處阻斷酪氨酸分解代謝通路，并阻止蓄積琥珀酰丙酮——在Fah缺陷人和動(dòng)物中蓄積的病癥特異性代謝物。裸鼠是指具有以下遺傳突變的小鼠品系所述遺傳突變可造成胸腺劣化或缺乏，導(dǎo)致由于T細(xì)胞數(shù)目大大減少而抑制免疫系統(tǒng)。所述小鼠的表型外觀是無體毛。裸鼠的叉頭框附(forkhead box Ni) (Foxnl)基因有自發(fā)缺失。潑尼松作為有效免疫抑制劑的合成皮質(zhì)類固醇。它經(jīng)常用于治療某些炎性疾病、 自身免疫病和癌癥，以及治療或預(yù)防器官移植排斥。潑尼松通?？诜?，但可以通過肌內(nèi)注射或靜脈注射送遞。它是可被肝臟轉(zhuǎn)化成潑尼松龍(prednisolone)的前藥，潑尼松龍是有活性的藥物并且也是類固醇。雷帕霉素已知具有免疫抑制和抗增殖性質(zhì)的化合物。雷帕霉素也稱為西羅莫司， 是最初作為細(xì)菌吸水鏈霉菌(Str印tomyces hygroscopicus)的產(chǎn)物而被發(fā)現(xiàn)的大環(huán)內(nèi)酯。 雷帕霉素可結(jié)合并抑制mTOR的活性。受體本文使用的“受體小鼠”是已用本文描述的分離的人肝細(xì)胞注射的小鼠。 一般而言，一部分(百分率可以不同)人肝細(xì)胞移入到受體小鼠中。在一個(gè)實(shí)施方案中， 受體小鼠是免疫缺陷小鼠，它還有Fah缺陷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受體小鼠是Rag2+/ I12rg+小鼠，它還有Fah缺陷。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受體小鼠是FRG小鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，受體小鼠是FpmRG小鼠。在其他實(shí)施方案中，受體小鼠是以IL-IR拮抗劑處理的 FRG小鼠，或者是還有IL-IR缺陷的FRG小鼠。重組酶活化基因1 (Ragl)參與活化免疫球蛋白V(D)J重組的基因。RAGl蛋白參與DNA底物識(shí)別，但穩(wěn)定的結(jié)合和切割活性還需要RAG2。重組酶活化基因2(Rag2)參與免疫球蛋白與T細(xì)胞受體位點(diǎn)重組的基因。Rag2基因缺陷的動(dòng)物不能進(jìn)行V(D) J重組，導(dǎo)致完全失去功能性T細(xì)胞和B細(xì)胞(Shinkai et al.，Cell 68 :855_867，1992)。連續(xù)移植用于體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的過程，其中收集在第一級(jí)小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞，并例如通過注射，移植到第二級(jí)小鼠中進(jìn)行進(jìn)一步擴(kuò)增。連續(xù)移植可以進(jìn)一步包括第三級(jí)、第四級(jí)或更多級(jí)的小鼠(Overturf et al.，Am. J. Pathol. 151 1078-9107，1997)。重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠是指不能進(jìn)行V(D) J重組并因此缺乏功能性T細(xì)胞和B細(xì)胞的小鼠品系。SCID小鼠活化補(bǔ)體系統(tǒng)的一些組分的能力也受損。SCID小鼠是 Prkdcscid突變純合的。干細(xì)胞具有產(chǎn)生未改變的子細(xì)胞(自身更新；細(xì)胞分裂產(chǎn)生了至少一個(gè)與親代細(xì)胞完全相同的子代細(xì)胞)和產(chǎn)生特化的細(xì)胞類型(潛能)的獨(dú)特能力的細(xì)胞。干細(xì)胞包括但不限于胚胎干(ES)細(xì)胞、胚胎生殖(EG)細(xì)胞、種系干(GS)細(xì)胞、人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)、脂肪組織來源的干細(xì)胞(ADSC)、多能成體祖細(xì)胞(MAPC)、多能成體種系干細(xì)胞 (maGSC)和不受限制的體干細(xì)胞(USSC)。干細(xì)胞在體內(nèi)的功能是替換在動(dòng)物的正常生命期間被破壞的細(xì)胞。一般來說，干細(xì)胞可以不受限制地分裂。在分裂后，干細(xì)胞可以保持為干細(xì)胞、變成前體細(xì)胞或進(jìn)入終末分化。前體細(xì)胞是可以產(chǎn)生至少一種給定細(xì)胞類型的完全分化的有功能細(xì)胞的細(xì)胞。一般來說，前體細(xì)胞可以分裂。分裂后，前體細(xì)胞可以保持為前體細(xì)胞，或可以進(jìn)入終末分化。在一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞。T細(xì)胞一種類型的白細(xì)胞、或淋巴細(xì)胞，在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫中發(fā)揮中心作用。T細(xì)胞與其他類型的淋巴細(xì)胞(例如B細(xì)胞和NK細(xì)胞)的差別在于，在它們的細(xì)胞表面上存在被稱為T細(xì)胞受體(TCR)的特異性受體。胸腺一般被認(rèn)為是T細(xì)胞發(fā)育的主要器官。治療劑當(dāng)被適當(dāng)?shù)亟o予受試者時(shí)能夠誘導(dǎo)所需治療或預(yù)防效果的化合物、小分子或其他組合物，例如反義化合物、抗體、蛋白酶抑制劑、激素、趨化因子或細(xì)胞因子。本文使用的“候選試劑”是選擇用于進(jìn)行篩查以確定它是否能夠作為具體疾病或病癥的治療劑而發(fā)揮功能的化合物。滴度在本公開內(nèi)容的上下文中，滴度是指樣品中具體病原體的量。毒素在本公開內(nèi)容的上下文中，“毒素”是指任何有毒物質(zhì)，包括任何化學(xué)毒素或
生物毒素。轉(zhuǎn)基因被導(dǎo)入到生物體的細(xì)胞或基因組中的外源核酸序列。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物非人動(dòng)物(通常為哺乳動(dòng)物)具有非內(nèi)源的(異源的)核酸序列作為染色體外元件存在于其一部分細(xì)胞中，或穩(wěn)定地整合在其種系DNA中(即在其大多數(shù)或所有細(xì)胞的基因組序列中)。通過例如按照本技術(shù)領(lǐng)域中公知的方法對(duì)宿主動(dòng)物的胚胎或胚胎干細(xì)胞進(jìn)行遺傳操作，將異源核酸導(dǎo)入到這樣的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的種系中?！稗D(zhuǎn)基因”意指這樣的異源核酸，例如表達(dá)構(gòu)建物形式的異源核酸(例如用于產(chǎn)生“敲入”轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)，或者在插入到靶基因中或附近后導(dǎo)致靶基因的表達(dá)降低的異源核酸(例如用于產(chǎn)生“敲除” 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物)?！扒贸被蛞馕吨淖兯龌虻男蛄校瑢?dǎo)致所述靶基因的功能降低，優(yōu)選地使得靶基因的表達(dá)是不可檢測(cè)到的或極少。轉(zhuǎn)基因敲除動(dòng)物可以包含對(duì)靶基因的雜合敲除或?qū)Π谢虻募兒锨贸??！扒贸币舶l件性敲除，其中所述靶基因的改變可以在以下情況下才發(fā)生，在例如將該動(dòng)物暴露于促進(jìn)靶基因改變的物質(zhì)后、導(dǎo)入促進(jìn)所述靶基因位點(diǎn)處的重組的酶(例如Cre-Iox系統(tǒng)中的Cre)后、或使用其他在出生后引導(dǎo)所述靶基因改
19變的方法后。移植或進(jìn)行移植是指將器官、組織或細(xì)胞從一個(gè)受試者移入至另一個(gè)受試者或至相同受試者的另一區(qū)域的過程。尿激酶也被稱為尿激酶型血纖維蛋白溶酶原激活劑(UPA)，尿激酶是一種絲氨酸蛋白酶。尿激酶最初從人尿液中分離，但是存在于幾種生理位置中，例如血流和細(xì)胞外基質(zhì)中。主要的生理學(xué)底物是血纖維蛋白溶酶原，它是絲氨酸蛋白酶血纖維蛋白溶酶的無活性酶原形式。血纖維蛋白溶酶的活化觸發(fā)了蛋白水解級(jí)聯(lián)，它根據(jù)生理環(huán)境參與血栓溶解或細(xì)胞外基質(zhì)降解。在本文提供的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射之前將尿激酶給予受體小鼠。在某些實(shí)施方案中，尿激酶是人尿激酶。在某些實(shí)施方案中，人尿激酶是分泌形式的尿激酶。在某些實(shí)施方案中，人尿激酶是經(jīng)修飾的、非分泌形式的尿激酶(參見美國(guó)專利 No. 5，980，886)。載體允許插入外源核酸而不破壞載體在宿主細(xì)胞中的復(fù)制和/或整合能力的核酸分子。載體可以包含允許其在宿主細(xì)胞中復(fù)制的核酸序列，例如復(fù)制起點(diǎn)。載體還可以包含一種或多種選擇性標(biāo)記基因或其他遺傳元件。整合載體能夠?qū)⑵渥陨碚系剿拗骱怂嶂?。表達(dá)載體是含有必要的調(diào)控序列以允許插入的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的載體。在本文描述的一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體含有編碼尿激酶(例如人尿激酶)的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中， 載體是質(zhì)粒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，載體是病毒載體，例如腺病毒載體或腺伴隨病毒 (AAV)載體。除非另有解釋，否則在本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語，都與具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域中的普通專業(yè)人員所通常理解的意義同樣的意義。除非上下文明確表明相反，單數(shù)形式的“一”、“一個(gè)”和“所述”包括復(fù)數(shù)的指稱物。同樣地，單詞“或”意在包括“和”，除非上下文明確表明相反。因此，“包含A或B”意味著包括A、或B、或者A和B。此外，應(yīng)該理解，對(duì)于核酸或多肽給出的所有堿基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子質(zhì)量值， 都是近似值且僅供描述。盡管與本文描述的相似的或等價(jià)的方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或試驗(yàn)，但下面描述了適合的方法和材料。所有在本文中提到的的出版物、專利申請(qǐng)、專利和其他參考文獻(xiàn)，在此以引用方式全文納入本文。在有沖突的情況下，以本發(fā)明的說明 (包括術(shù)語的解釋)為準(zhǔn)。此外，所述材料、方法和實(shí)例僅僅是說明性的，不打算進(jìn)行限制。III.幾個(gè)實(shí)施方案的概述本文提供了強(qiáng)有力的體內(nèi)擴(kuò)增肝細(xì)胞的方法。雖然本文中示例了人肝細(xì)胞，但也可以擴(kuò)增來自其他物種的肝細(xì)胞，包括來自大鼠、狗、貓、牛、馬、豬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物例如狒狒、黑猩猩和獼猴的肝細(xì)胞。所述方法包括將分離的人肝細(xì)胞移植到酪氨酸分解代謝酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)表達(dá)缺陷的免疫缺陷小鼠中，其中(i)所述小鼠還有IL-IR 表達(dá)缺陷，或者(ii)所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑(在本文中稱為“受體小鼠”)。使人肝細(xì)胞在受體小鼠中擴(kuò)增一段時(shí)間，該時(shí)間足以使人肝細(xì)胞擴(kuò)增。擴(kuò)增的準(zhǔn)確時(shí)間長(zhǎng)度可以通過常規(guī)實(shí)驗(yàn)憑經(jīng)驗(yàn)確定。在一些實(shí)施方案中，使人肝細(xì)胞擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)6 個(gè)月，最長(zhǎng)達(dá)8個(gè)月，最長(zhǎng)達(dá)10個(gè)月或最長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月。在其他實(shí)施方案中，使人肝細(xì)胞擴(kuò)增至少約2周，至少約4周，至少約6周，至少約8周，至少約12周，至少約16周，至少約20 周，至少約24周或至少約28周。肝細(xì)胞擴(kuò)增的程度可以變化。在某些實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞在受體小鼠中的擴(kuò)增，導(dǎo)致增加了至少約10倍、至少約50倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約250倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍或至少約1000倍。在一些實(shí)施方案中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠包含F(xiàn)ah基因的純合中斷 (homozygous disruption)，使得所述中斷導(dǎo)致功能性FAH蛋白表達(dá)的喪失。功能性FAH蛋白表達(dá)喪失不必是表達(dá)完全失去。在一些實(shí)例中，功能性FAH蛋白表達(dá)的喪失是表達(dá)失去約80 %、約90 %、約95 %或約99 %。Fah基因中斷包括例如Fah基因中的插入、缺失或點(diǎn)突變，或者它們的多種或組合。在具體實(shí)例中，所述中斷包含F(xiàn)ah基因中的缺失。在一些實(shí)施方案中，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠缺乏功能性T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK 細(xì)胞。所述小鼠的免疫缺陷可以是由于遺傳改變、免疫抑制或它們的組合引起的。由于遺傳改變而導(dǎo)致免疫缺陷的免疫缺陷小鼠可以包括任何遺傳改變或遺傳改變組合，其使得所述小鼠在體液免疫或細(xì)胞免疫性中的至少一個(gè)方面受損。例如，所述免疫缺陷小鼠可以具有選自例如以下的一種或多種遺傳改變=Ragl缺陷、Rag2缺陷、I12rg缺陷、SCID突變、NOD基因型或裸鼠突變。在一些實(shí)施方案中，所述免疫缺陷小鼠為Rag2+IL2rg+小鼠。在其他實(shí)施方案中，所述免疫缺陷小鼠為Ragl+/I12rg+小鼠。在一些實(shí)例中，所述免疫缺陷小鼠為 N0D/Rag2+/I12rg+小鼠或N0D/Ragl+/I12rg+小鼠。在一些實(shí)施方案中，所述Fah缺陷小鼠包含F(xiàn)ah的純合缺失。在其他實(shí)施方案中，所述Fah缺陷小鼠包含F(xiàn)ah中的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變，使得所述蛋白質(zhì)的功能和/或產(chǎn)生大大減少。因此，在一些實(shí)施方案中， 所述小鼠為 Fah"7Rag2+/I12rg+ 小鼠、Fah-^/Ragli/IUrg+ 小鼠、N0D/Fah"7Rag2"7 112rg+小鼠或N0D/Fah+/Ragl+/112rg+小鼠。在具體實(shí)例中，所述小鼠為Fah+/ Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。在其他實(shí)施方案中，所述小鼠為Fahpm/Rag2v7112rg+(FpmRG) 小鼠。所述小鼠的免疫缺陷還可以由于免疫抑制引起。通常，免疫抑制是通過將一種或多種免疫抑制劑給予所述小鼠，從而誘導(dǎo)免疫缺陷而實(shí)現(xiàn)。所述免疫抑制劑或免疫抑制劑結(jié)合物可以選自本領(lǐng)域中已知或本文公開的任何免疫抑制劑(例如參見術(shù)語和方法部分)。本文考慮使用的免疫抑制劑包括降低免疫系統(tǒng)(例如體液系統(tǒng)、細(xì)胞系統(tǒng)或補(bǔ)體系統(tǒng))的一個(gè)或多個(gè)方面的活性或功能的任何化合物。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種免疫抑制劑選自Π(506、環(huán)孢菌素A、氟達(dá)拉濱、麥考酚酯、潑尼松、雷帕霉素或硫唑嘌呤，或者它們的結(jié)合物。可以使用任何合適的送遞途徑(例如通過口服或腹膜內(nèi)注射)將所述免疫抑制劑給予所述小鼠。在具體實(shí)例中，所述免疫抑制劑為Π(506。在一些情況下，Π(506在飲用水中口服給予。合適的劑量是本領(lǐng)域中已知的，并且可以由受過訓(xùn)練的醫(yī)生確定。例如，Π(506 可以以7. 5mg/L的劑量在飲用水中連續(xù)給予，產(chǎn)生大約1 μ g/克/天的劑量。然而，其他合適劑量包括約2. 0至約15mg/L，例如約2. 0、約3. 0、約4. 0、約5. 0、約6. 0、約7. 0、約8. 0、 約 9. 0、約 10. 0、約 11. 0、約 12. 0、約 13. 0、約 14. 0 或約 15. Omg/L。在一些實(shí)例中，所述免疫抑制劑為環(huán)孢菌素Α。環(huán)孢菌素A可以在例如飲用水中給予，例如以約10至約100mg/kg/天的濃度給予。在一些情形中，環(huán)孢菌素A以約30至約 70mg/kg/天(例如約50mg/kg/天)的濃度在飲用水中給藥。在一些實(shí)例中，所述免疫抑制劑為氟達(dá)拉濱。通常，氟達(dá)拉濱通過每天腹膜內(nèi)注射給藥。然而，可以以更高或更低頻率給藥，例如一天兩次，隔天一次或每周一次。示例性氟達(dá)拉濱劑量包括100mg/kg/天至約500mg/kg/天。在具體實(shí)例中，所述劑量為約150至約 250mg/kg/ 天，例如約 200mg/kg/ 天。在其他實(shí)施方案中，對(duì)所述小鼠給予免疫抑制劑的結(jié)合物，例如，Π(506、環(huán)孢菌素 Α、氟達(dá)拉濱、硫唑嘌呤、麥考酚酯和潑尼松中的兩種或多種。在一些實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物包括Π(506、麥考酚酯和潑尼松。在其他實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物可包括環(huán)孢菌素Α、麥考酚酯和潑尼松。在其他實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物可包括雷帕霉素、麥考酚酯和潑尼松。在其他實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物可包括硫唑嘌呤、Π(506和潑尼松。在其他實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物可包括硫唑嘌呤、環(huán)孢菌素A和潑尼松。 在其他實(shí)例中，所述免疫抑制劑的結(jié)合物可包括雷帕霉素、硫唑嘌呤和潑尼松。為了提高移入效率，所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還有IL-IR缺陷，或者被給予 IL-IR拮抗劑。在其中所述小鼠為IL-IR表達(dá)缺陷的一些實(shí)施方案中，所述小鼠是Illrl基因中斷純合的，使得所述中斷導(dǎo)致功能性IL-IR蛋白表達(dá)的喪失。功能性IL-IR蛋白表達(dá)的喪失不必是表達(dá)完全喪失。在一些實(shí)例中，功能性IL-IR蛋白表達(dá)的喪失是表達(dá)喪失約 80 %、約90 %、約95 %或約99 %。在一些實(shí)施方案中，所述中斷包括11 Ir 1基因中的插入、缺失或者一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。在一些實(shí)例中，所述小鼠為Fahv7Rag2+/I12rg+/Illrl+小鼠、Fahi/Ragr^/IUrgi/Illrl+ 小鼠、而0^^“71^82+/112印+/1 Ilrl+ 小鼠或 NOD/ Fahi/Ragr^/IUrgi/I Ilrl+小鼠。在一些實(shí)施方案中，所述免疫缺陷和Fah缺陷小鼠被給予IL-IR拮抗劑。給予所述小鼠的IL-IR拮抗劑可以是可抑制IL-IR活性的任何化合物，例如核酸分子、多肽、抗體或小分子。在一些實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑為阿那白滯素。在其他實(shí)施方案中，所述 IL-IR拮抗劑為IL-1RA，例如具有本文以SEQ ID N0:18或SEQ ID NO :20形式列出的氨基酸序列的IL-IRA或者其變體或衍生物。在一些情形中，在肝細(xì)胞被移植至所述小鼠中的同時(shí)或近乎同時(shí)遞送所述IL-IR拮抗劑。另外的IL-IR拮抗劑劑量可以在注入肝細(xì)胞后給予。IL-IR拮抗劑可以以單個(gè)劑量或以多個(gè)劑量給藥。在使用多個(gè)劑量時(shí)，給藥方案可以變化。例如，可以每小時(shí)、每日兩次、每日一次、隔日或每周一次給予IL-IR拮抗劑。在具體實(shí)例中，每日給予所述IL-IR拮抗劑。每日給藥可以進(jìn)行兩天、三天、四天、五天、六天、 七天、八天、九天、十天或更長(zhǎng)時(shí)間。在一個(gè)實(shí)例中，每日送遞所述IL-IR拮抗劑，持續(xù)七天。 在另一個(gè)實(shí)例中，每日送遞所述IL-IR拮抗劑，持續(xù)三天。IL-IR拮抗劑的合適劑量將依賴于所使用化合物的類型和給藥途徑而變化。在一些實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑為阿那白滯素。在具體實(shí)例中，阿那白滯素的總劑量(不論作為單個(gè)劑量給藥或是分開多個(gè)劑量給藥)為約0. 2、約0. 4、約0. 6、約1、約2、約3、約 4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19 或約20mg。在一些實(shí)例中，阿那白滯素的總劑量為約10至約20mg，例如約12至約16mg。 在具體實(shí)例中，阿那白滯素的劑量為約14mg。在其他實(shí)例中，阿那白滯素的總劑量為約0.2 至約6mg,例如約0. 4至約2mg,或約1至約3mg?？梢允褂萌魏魏线m的給藥途徑將所述IL-IR拮抗劑給予所述小鼠。在一些實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑通過注射給藥。例如所述IL-IR拮抗劑是通過皮下注射、肌內(nèi)注射、 真皮內(nèi)注射、腹膜內(nèi)注射或靜脈注射給藥。
在本文描述的方法的一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射之前，向所述Fah缺陷小鼠給予抑制、延遲或阻止所述小鼠中肝臟疾病發(fā)生的試劑。試劑可以是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的抑制肝臟疾病的任何化合物或組合物。一種這樣的藥劑是2- (2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?_1，3環(huán)己二酮(NTBC)。給予NTBC以調(diào)控所述Fah缺陷小鼠中肝臟疾病的發(fā)生。劑量、用藥時(shí)間表以及給藥方法，可以根據(jù)需要進(jìn)行調(diào)整，以阻所述止Fah缺陷小鼠中的肝功能障礙。在一些實(shí)施方案中，NTBC給藥劑量為約0.01mg/kg/天至約2.0mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC給藥劑量為約1. Omg/kg/天至約2. Omg/kg/天，例如約1. 4mg/kg/天至約1. 8mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)例中，NTBC給藥劑量為約1. 6mg/kg/天。在一個(gè)實(shí)施方案中， NTBC給藥劑量為約0. 01mg/kg/天至約0. 50mg/kg/天。在另一個(gè)實(shí)施方案中，NTBC給藥劑量為約0. 05mg/kg/天至約0. 1 Omg/kg/天，例如約0. 05mg/kg/天、約0. 06mg/kg/天、約 0. 07mg/kg/ 天、約 0. 08mg/kg/ 天、約 0. 09mg/kg/ 天或約 0. 1 Omg/kg/ 天。NTBC 可以在注射人肝細(xì)胞之前和/或肝細(xì)胞注射后選定的時(shí)間段給予。根據(jù)需要，在肝細(xì)胞擴(kuò)增期間，NTBC 可以撤銷或重新給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前和肝細(xì)胞注射后至少約3天，向所述Fah缺陷小鼠給予NTBC。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前和肝細(xì)胞注射后至少約6天，向所述Fah缺陷小鼠給予NTBC。在一個(gè)方面，NTBC的劑量在肝細(xì)胞注射后的6天時(shí)間過程中逐漸降低。NTBC可以通過任何適合的手段施用，例如但不限于在飲用水中、在食物中或通過注射給藥。在一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前在飲用水中給予的NTBC濃度是約1至約 8mg/L，例如約 lmg/L，約 2mg/L，約 3mg/L，約 4mg/L，約 5mg/L，約 6mg/L，約 7mg/L 或約 8mg/ L。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在肝細(xì)胞注射前在飲用水中給予的NTBC濃度是約1至約2mg/L， 例如約 1. 0mg/L,約 1. 2mg/L,約 1. 4mg/L,約 1. 6mg/L,約 1. 8mg/L 或約 2. 0mg/L。本文公開了一種體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，包括將人肝細(xì)胞移植(例如通過注射)至免疫缺陷且Fah缺陷小鼠(也稱為受體小鼠)，將IL-IR拮抗劑給予所述小鼠并允許所述人肝細(xì)胞擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中，所述方法還包括從所述小鼠收集所述擴(kuò)增的人肝細(xì)胞?；蛘?，所述擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法包括將人肝細(xì)胞移植至免疫缺陷、Fah缺陷且IL-IR 缺陷小鼠(該類型小鼠也是“受體小鼠”)，并允許所述人肝細(xì)胞擴(kuò)增。在一些實(shí)施方案中， 所述方法還包括從所述小鼠收集所述擴(kuò)增的人肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，移植至所述受體小鼠中的人肝細(xì)胞為分離的人肝細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，所述人肝細(xì)胞作為肝組織的一部分被移植?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知的任何合適方法移植所述肝細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述人肝細(xì)胞被移植(例如通過注射)至所述受體小鼠的脾臟中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，從所述受體小鼠的肝臟收集所述擴(kuò)增的人肝細(xì)胞。還提供了體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，其中在注射人肝細(xì)胞之前，向受體小鼠施用編碼尿激酶基因的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶基因是人尿激酶。野生型的尿激酶是分泌的蛋白。因此，在某些實(shí)施方案中，人尿激酶是分泌形式的尿激酶(Nagai et al. ,Gene 36:183-188,1985)。人尿激酶(分泌形式)的序列在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的，例如但不限于GenBank登記號(hào)No. AH007073(1993年8月3日登記)、D11143 (1996年5月9日登記)、 A18397 (1994 年 7 月 21 日登記)、BC002788 (2003 年 8 月 19 日登記)、X02760 (1993 年 4 月21日登記)、BTOO739I (2003年5月I3日登記)、NM 002658 (2004年10月1日登記)和 X74039 (1994 年 2 月 20 日登記)。在某些實(shí)施方案中，人尿激酶是經(jīng)修飾的、非分泌形式的尿激酶。例如，Lieber 等(Proc. Natl. Acad. Sci. 92 =6210-6214,1995)描述了通過在尿激酶的羧基末端插入編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)的序列，或通過用氨基末端RR滯留信號(hào)(Strubin et al. , Cell 47 619-625,1986 ；Schutze 等，EMBO J. 13 1696-1705，1994)和通過間隔肽從膜 II 型蛋白 Iip33分離的跨膜錨蛋白(Strubin et al. ,Cell 47 :619_625，1986)代替pre-uPA信號(hào)肽， 產(chǎn)生了非分泌形式的尿激酶。非分泌形式的尿激酶也記載在美國(guó)專利No. 5，980，886中。所述編碼尿激酶的載體，可以是任何類型的適合于送遞到小鼠中并能夠表達(dá)尿激酶基因的載體。這樣的載體包括病毒載體或質(zhì)粒載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是腺病毒載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體是AAV載體。編碼尿激酶的載體可以通過本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何適合的手段給予。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體通過靜脈內(nèi)給予。在一個(gè)方面，所述載體通過眼球后注射給予。所述編碼尿激酶的載體可以在注射人肝細(xì)胞之前的任何時(shí)間給予。一般而言，所述載體被給予以使得有足夠的時(shí)間使尿激酶表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述載體在肝細(xì)胞注射前24至48小時(shí)給予。本文還提供了體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，其中在注射人肝細(xì)胞之前，對(duì)所述受體小鼠進(jìn)行了巨噬細(xì)胞消除。在一個(gè)實(shí)施方案中，在巨噬細(xì)胞消除之前，向所述受體小鼠給予編碼尿激酶的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在巨噬細(xì)胞消除后，向所述受體小鼠給予編碼尿激酶的載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，沒有向所述巨噬細(xì)胞消除的受體小鼠給予編碼尿激酶的載體。可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中公知的許多方法中的任何一種從所述受體小鼠消除巨噬細(xì)胞，例如通過使用化學(xué)物質(zhì)或抗體。例如，可以通過給予拮抗劑(例如有毒物質(zhì)、包括C12MDP)或改變巨噬細(xì)胞發(fā)育、功能和/或存活性的抗體，來除去巨噬細(xì)胞。拮抗劑的給藥是通過公知的技術(shù)來進(jìn)行，包括使用脂質(zhì)體，例如在歐洲專利No. 1552740中描述的。含有氯膦酸鹽(clodronate)的脂質(zhì)體也可以用于消除巨噬細(xì)胞，正如由van Ri jn等(Blood 102:2522-2531,2003)所描述的。在一些實(shí)施方案中，被移植至所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中的人肝細(xì)胞是分離的人肝細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，所述人肝細(xì)胞被作為肝組織移植物的一部分移植。所述分離的人肝細(xì)胞可以從許多不同來源中的任何一個(gè)中獲得。在一個(gè)實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞從器官供體的肝臟分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞從外科手術(shù)切除物分離。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞來源自干細(xì)胞，例如胚胎干細(xì)胞、iPS細(xì)胞、間充質(zhì)來源的干細(xì)胞、 脂肪組織來源的干細(xì)胞、多能成體祖細(xì)胞、不受限制的體干細(xì)胞或組織特異性肝臟干細(xì)胞， 其可存在于肝臟本身、膽囊、腸或胰臟中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞來源自單核細(xì)胞或羊水細(xì)胞，因此在體外獲得了干細(xì)胞或祖細(xì)胞以產(chǎn)生肝細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，人肝細(xì)胞在注射前冷凍保存。本文還提供了在Fah缺陷的受體小鼠中連續(xù)移植人肝細(xì)胞的方法。所述方法包括從第一級(jí)受體小鼠收集擴(kuò)增的人肝細(xì)胞，并進(jìn)一步在第二、第三、第四級(jí)或更多級(jí)的受體小鼠中擴(kuò)增所述肝細(xì)胞(Overturf et al.，Am. J. Pathol. 151 :1078_9107，1997)。可以使用許多技術(shù)中的任何一種從小鼠收集人肝細(xì)胞。例如，可以按照下面實(shí)施例中的描述，通過灌注小鼠肝臟，然后溫和切碎，來收集肝細(xì)胞。此外，可以使用眾所周知的方法將肝細(xì)胞與其他細(xì)胞類型、組織和/或碎片分離開，例如通過使用特異性地識(shí)別人細(xì)胞或人肝細(xì)胞的抗體。 這樣的抗體包括但不限于與I類主要組織相容性抗原特異性結(jié)合的抗體，例如抗人HLA-A、 B、C 抗體(Markus et al. ,Cell Transplantation 6:455-462,1997)。然后可以通過盤選 (利用了連接至固體基質(zhì)的單克隆抗體)、熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、磁珠分離等，來分離抗體結(jié)合的肝細(xì)胞?？蛇x的收集肝細(xì)胞的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的。在一些實(shí)施方案中，本文提供的方法還包括從所述小鼠收集生物樣品。例如，生物樣品可以是生物流體、細(xì)胞或組織樣品。在一些實(shí)例中，所述生物樣品是流體樣品，例如血液或尿樣。在一些情形中，所述方法包括從所述受體小鼠收集擴(kuò)增的人肝細(xì)胞，并且進(jìn)一步從所述小鼠收集生物樣品，例如血液或尿樣。還提供了一種選擇可有效治療人肝臟疾病的試劑的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑；并且(ii)評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟疾病的效果。所述肝臟疾病的一種或多種體征或癥狀的改善表示所述候選試劑可有效治療所述肝臟疾病。在一些實(shí)施方案中，所述肝臟疾病為肝臟感染、纖維化、肝硬化或肝癌，例如HCC。還提供了一種選擇可有效治療人肝臟病原體感染的試劑的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠的移植的人肝細(xì)胞被所述肝臟病原體感染；并且(ii)評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟感染的效果。與給予所述候選試劑之前所述Fah缺陷小鼠的感染負(fù)荷相比，所述肝臟病原體的感染負(fù)荷的降低表示所述候選試劑可有效治療所述肝臟病原體感染。在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)量獲自所述小鼠的樣品中的病原體滴度來確定所述感染負(fù)荷。在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)量獲自所述小鼠的樣品中的病原體特異性抗原來確定所述感染負(fù)荷。在一些實(shí)施方案中，通過測(cè)量獲自所述小鼠的樣品中的病原體特異性核酸分子來確定所述感染負(fù)荷。在一些實(shí)施方案中，所述肝臟病原體為嗜肝病毒，例如HBV或 HCV。還提供了一種選擇可有效治療肝硬化的試劑的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷和Fah 缺陷小鼠還已被給予可誘導(dǎo)所述小鼠中發(fā)生肝硬化的化合物；并且(ii)評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠肝硬化的至少一種診斷標(biāo)記物的效果，其中所述肝硬化的至少一種診斷標(biāo)記物選自AST、ALT、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白。與給予所述候選試劑之前的所述Fah缺陷小鼠相比，在所述Fah缺陷小鼠中AST、ALT、膽紅素或堿性磷酸酶減少或白蛋白增加表示所述候選試劑可有效治療肝硬化。還提供了一種選擇可有效治療肝細(xì)胞癌(HCC)的試劑的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠還已被給予可誘導(dǎo)所述小鼠中發(fā)生HCC的化合物或者已經(jīng)被移植惡性肝細(xì)胞；并且(ii)評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中HCC的效果。與給予所述候選試劑之前的所述小鼠相比，所述小鼠腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤體積降低表示所述候選試劑可有效治療HCC。還提供了一種評(píng)估外源性試劑在體內(nèi)對(duì)人肝細(xì)胞效果的方法。在一些實(shí)施方案中，所述方法包括(i)將所述外源性試劑給予移植有人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠， 其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑；并且(ii)測(cè)量所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中肝功能的至少一種標(biāo)記物，其中所述肝功能的至少一種標(biāo)記物選自AST、ALT、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白。與給予所述外源性試劑之前的所述小鼠相比，在所述小鼠中AST、ALT、膽紅素或堿性磷酸酶增加或白蛋白減少表示所述外源性試劑有毒性。在一些實(shí)施方案中，所述外源性試劑為已知毒素或疑似的毒素。IV.白細(xì)胞介素-1受體(IL-IR)拮抗劑本文公開了給予IL-IR拮抗劑可顯著增強(qiáng)具有Fah功能性缺失的免疫缺陷小鼠中的人肝細(xì)胞移入。因此，本文提供了用于在免疫缺陷/Fah缺陷小鼠中移入并擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，其中在一些實(shí)施方案中，所述方法包括對(duì)所述小鼠給予IL-IR拮抗劑。本文考慮使用可作為IL-IR拮抗劑發(fā)揮功能的任何化合物，例如核酸分子、多肽、抗體或小分子。還考慮使用還有IL-IR缺陷的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠。本文使用的術(shù)語“IL-1受體拮抗劑”是指任何這樣的分子，即它們可結(jié)合于IL-IR 或IL-IR輔助蛋白(IL-IRAP)并干擾IL-IR介導(dǎo)的活化，例如通過抑制或阻斷IL-IR和 IL-IRAP的相互作用或IL-I和IL-IR的相互作用。在一些實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑為阿那白滯素。在其他實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑可為IL-IRA(例如本文分別以SEQ ID NO 18和20形式列出的人或小鼠IL-1RA)或其功能性變體，例如IL-IRA的保守變體。 在其他實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑為特異性針對(duì)IL-IR的抗體(例如特異性針對(duì)I型 IL-IR的抗體)、特異性針對(duì)IL-IRAP的抗體、可結(jié)合于I型IL-IR的肽或可結(jié)合于IL-IRAP 的肽。IL-IR拮抗劑——包括IL-IRA以及其變體或衍生物——以前已有記載(參見，例如 PCT 公開文本 No. WO 91/08285 ；WO 91/17184 ；W092/16221 ；WO 93/21946 ；WO 94/06457 ； WO 94/21275 ；WO 94/21235 ；WO 94/20517 ；WO 96/22793 ；WO 97/28828 ；和 WO 99/36541 ； 美國(guó)專禾Ij No. 5，075，222 和 6，599，873 ；6，268，142 ；6，168，791 ；6，159，460 ；6，090，775 ； 6，063，600 ；6，036，978 ；6，054，559 ；5，922，573 ；5，863，769 ；5，858，355 ；5，863，769 ； 5，508，262 ；6, 013, 253 ；和 6，399，573 ；以及美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本 No. 2004/0076991 和 2005/0282752)。對(duì)本發(fā)明，術(shù)語“IL-1RA”包括其中IL-IRA的氨基酸已被缺失、插入或置換的 IL-IRA的修飾形式。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解，可以在IL-IRA的氨基酸序列(例如本文列出為SEQ ID NO 18和SEQ ID NO 20的氨基酸序列)中制造許多缺失、插入和置換的組合，條件是所產(chǎn)生的分子有生物活性(例如具有抑制IL-IR的能力)。術(shù)語“IL-1受體拮抗劑”還包括包含IL-IRA的融合蛋白。示例性融合蛋白包括Fc-IL-IRA和本領(lǐng)域中描述的其他融合分子(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本 No. 2007/0248597 和美國(guó)專利 No. 6，294，170)。在一些實(shí)施方案中，所述IL-IR拮抗劑為特異性針對(duì)I型IL-IR (IL-IRI) 的抗體。IL-IRI抗體的實(shí)例在本領(lǐng)域中有記載(參見例如美國(guó)專利申請(qǐng)公開文本No. 2004/0097712)并可從多個(gè)來源購買。其他的IL-IRI抗體可依照公知的方法產(chǎn)生。本文使用的“抗體”是指完整的免疫球蛋白分子或抗體片段，例如Fab片段、Fab'片段、F(ab) ‘ 2 片段、單鏈Fv蛋白(scFv)和二硫鍵穩(wěn)定的Fv蛋白(dsFv)?？贵w可以是例如嵌合抗體、鼠抗體或人源化抗體。多克隆抗體和單克隆抗體均被考慮用于本發(fā)明的方法。在一些實(shí)施方案中，將編碼IL-IR拮抗劑的核酸分子送遞至受體小鼠中。在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼阿那白滯素。在其他實(shí)施方案中，所述核酸分子編碼IL-IRA 或者IL-IRA的變體或衍生物。在具體實(shí)例中，所述核酸分子包含SEQ ID NO: 17或SEQ ID N0:19。在一些情形中，所述核酸分子包含載體，例如質(zhì)?；虿《据d體。用于送遞異源核酸序列的合適質(zhì)?；虿《据d體在本領(lǐng)域中是已知的并在本文下文有描述(例如下文描述用于送遞尿激酶的那些載體)。V.用于擴(kuò)增人肝細(xì)胞的遺傳修飾的小鼠幾個(gè)團(tuán)隊(duì)已經(jīng)嘗試了在嚙齒動(dòng)物中移入和擴(kuò)增原代人肝細(xì)胞(美國(guó)專利 No. 6，509, 514 ；PCT 公布 No. WO 01/07338 ；美國(guó)公布 No. 2005-0255591)。Dandri 等 (Hepatology 33 =981-988,2001)首先報(bào)道了成功地用人肝細(xì)胞再殖小鼠肝臟。從那以后， 其他團(tuán)隊(duì)報(bào)道了將人肝細(xì)胞成功地移入小鼠。在所有這些研究中，使用的動(dòng)物是在白蛋白啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下表達(dá)尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Sandgren et al. , Cell 66:245-256,1991)。uPA的過表達(dá)引起了代謝中斷，導(dǎo)致了小鼠肝細(xì)胞的細(xì)胞死亡，而不影響不表達(dá)所述轉(zhuǎn)基因的移植的人肝細(xì)胞。將alb-uPA轉(zhuǎn)基因在各種不同免疫缺陷背景上雜交以防止對(duì)人細(xì)胞的排斥(Tateno et al.，Am. J. Pathol. 165 =901-912, 2004 ；Katoh et al. ， J. Pharm. Sci. 96 428-437,2007 ；Turrini et al. ， Transplant. Proc. 38 1181-1184,2006)。盡管在這些模型中已經(jīng)報(bào)道了高達(dá)90%的移入水平，但所述系統(tǒng)有幾個(gè)主要的缺點(diǎn)，阻止了其廣泛使用。首先，所述alb-uPA轉(zhuǎn)基因在生命的早期階段會(huì)變得失活或丟失。 因此，必需在非常早(14日齡)移植人細(xì)胞并使用對(duì)所述轉(zhuǎn)基因純合的小鼠。這種狹窄的移植時(shí)間窗口嚴(yán)重限制了該模型的靈活性。其次，所述轉(zhuǎn)基因的自發(fā)失活產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因陰性的、健康的小鼠肝細(xì)胞庫。這些回復(fù)體鼠類肝細(xì)胞，在再殖過程中與人細(xì)胞有效地競(jìng)爭(zhēng)。 因此，不可能在人細(xì)胞連續(xù)移植后再殖次級(jí)受體。第三，在該模型中，肝臟疾病發(fā)作非常早， 從而降低了所述轉(zhuǎn)基因小鼠的生存力。因此，難以培育出足夠數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。此外，所述轉(zhuǎn)基因小鼠具有出血的傾向，增加了手術(shù)中的死亡率。最后，alb-uPA轉(zhuǎn)基因動(dòng)物一旦再殖人細(xì)胞超過50%后，將發(fā)生腎臟疾病。據(jù)認(rèn)為，這是由于人補(bǔ)體對(duì)腎上皮的作用而引起的。 為了獲得非常高的人移入水平，必需用抗補(bǔ)體蛋白酶抑制劑處理所述移植的小鼠(Tateno et al. , Am. J. Pathol. 165 =901-912, 2004) 0因?yàn)檫@許多限制，非常需要更強(qiáng)有力的用于擴(kuò)增人肝細(xì)胞的系統(tǒng)。本文描述了高度有效的體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，其使用了具有獨(dú)特的基因缺失組合的遺傳修飾小鼠。人肝細(xì)胞在小鼠肝中的成功移入和擴(kuò)增，需要具有某種程度的肝功能障礙的免疫缺陷小鼠。已經(jīng)在多種不同類型的免疫缺陷小鼠(包括RAG-2敲除或SCID 小鼠)中，用人肝細(xì)胞再殖了小鼠肝臟，這兩種小鼠都缺乏B細(xì)胞和T細(xì)胞(美國(guó)專利 No. 6, 509, 514 ；PCT 公布 No. WO 01/07338 ；美國(guó)公布 No. 2005-0255591)。為了實(shí)現(xiàn)肝功能障礙，將免疫缺陷小鼠與尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA)轉(zhuǎn)基因小鼠雜交。uPA在小
27鼠肝臟中的表達(dá)，使得小鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生了生長(zhǎng)劣勢(shì)，促進(jìn)了移植的人肝細(xì)胞的擴(kuò)增(PCT公布No. WO 01/07338)。為了避免對(duì)uPA轉(zhuǎn)基因的限制，對(duì)Fah缺陷小鼠分析了它們?cè)试S人肝細(xì)胞擴(kuò)增的能力。FAH是催化酪氨酸分解代謝的最后一步的代謝酶。具有Fah基因的純合缺失的小鼠，表現(xiàn)出改變的肝臟mRNA表達(dá)和嚴(yán)重的肝功能障礙(Grompe et al.，Genes Dev. 7 :2298-2307，1993)。本文公開了缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的Fahv7Rag2〃7ll2rg+(FRG)三重突變小鼠。Rag2+/I12rg+小鼠在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(Traggiai et al. ,Science 304 104-107,2004 ；Gorantla et al.，J. Virol. 57 :2700_2712，2007)。正如在下面的實(shí)施例中描述的，人肝細(xì)胞在FRG小鼠中的移入和擴(kuò)增令人吃驚地高效。例如，可以用1百萬個(gè)分離的人肝細(xì)胞注射FRG小鼠。假設(shè)效率為10%，十萬個(gè)人肝細(xì)胞移入到所述受體小鼠中。那么，擴(kuò)增后從FRG小鼠的平均產(chǎn)量是大約8千萬到大約 1億2千萬個(gè)人肝細(xì)胞，這相當(dāng)于人肝細(xì)胞增加800至1200倍。FRG小鼠也可以用于人肝細(xì)胞的連續(xù)移植。連續(xù)移植可以包括多級(jí)小鼠，可以使得每級(jí)小鼠中人肝細(xì)胞擴(kuò)增至少大約1000倍。含有Fah缺陷的任何免疫缺陷小鼠都適合于本文描述的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，小鼠是在Fah中也有缺陷的Rag2+/I12rg+小鼠。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述小鼠為 Ragl+/I12rg+小鼠。在其他實(shí)施方案中，所述小鼠為N0D/Rag2+/I12rg+小鼠或NOD/ Ragl+/I12rg+小鼠。雖然本文中描述了一些具體的遺傳改變組合，本文還考慮可導(dǎo)致免疫缺陷的其他遺傳改變組合。例如，其他遺傳改變包括SCID突變、裸鼠突變和NOD基因型。所述Fah缺陷小鼠可以含有例如Fah的純合缺失，或Fah的一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。 Fah缺陷(例如通過點(diǎn)突變或純合缺失)導(dǎo)致了 FahmRNA表達(dá)和/或功能性FAH蛋白的顯著減少，或不存在。除了 FRG小鼠之外，本文描述了對(duì)Fah基因中的點(diǎn)突變純合的免疫缺陷小鼠(Rag2+/I12rg+)(在本文中稱為FpmRG小鼠)，也是用于人肝細(xì)胞體內(nèi)移入和擴(kuò)增的適合小鼠。本文還考慮免疫缺陷、Fah缺陷且IL-IR缺陷小鼠的使用。IL-IR缺陷小鼠以前已有記載(參見例如 Norman et al.，Ann. Surg. 223(2) 163-169，1996 ；Glaccum et al.， J. Immunol. 159 =3364-3371,1997)并可從杰克遜實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME)市購(例如品系 B6 ；129Sl-IllrltmlEoml/J 和 B6. 129S7-IIlrItmllmx/J)。VI.人肝細(xì)胞的分離和送遞使用Fah缺陷小鼠進(jìn)行人肝細(xì)胞體內(nèi)擴(kuò)增的顯著優(yōu)點(diǎn)，是使用源自于各種不同來源的人肝細(xì)胞移入小鼠的能力。任何合適的人肝細(xì)胞或肝細(xì)胞前體/祖細(xì)胞的來源都可在本發(fā)明的方法中用于移植至Fah缺陷小鼠中。正如在下面的實(shí)施例中描述的，人肝細(xì)胞可以源自于遺體捐獻(xiàn)者或肝切除物，或者可以從商業(yè)來源獲得。此外，正如本文顯示，F(xiàn)RG小鼠可以使用來自于所有年齡的供體的人肝細(xì)胞或使用冷凍保存的肝細(xì)胞成功地移植。在人肝細(xì)胞的分離和移植之間通常存在延遲(一般為1到2天)，這可能導(dǎo)致肝細(xì)胞的存活力較差。但是，即使當(dāng)用存活力有限的肝細(xì)胞移入時(shí)，F(xiàn)RG小鼠系統(tǒng)也能夠擴(kuò)增人肝細(xì)胞。分離人肝細(xì)胞的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，從器官供體或肝切除物分離人肝細(xì)胞的方法，記載在PCT公布No. W02004/009766和WO 2005/028640,以及美國(guó)專利No. 6，995，299和6，509，514中。肝細(xì)胞可以從經(jīng)皮獲取的或通過腹部外科手術(shù)獲取的肝臟活檢切片(biopsy)獲得。用于移植到受體小鼠(例如FRG小鼠)中的人肝細(xì)胞，通
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鼠肝臟中的表達(dá)，使得小鼠肝細(xì)胞產(chǎn)生了生過本技術(shù)領(lǐng)域中任何已知的便利方法從人肝組織分離。可以將肝臟組織以機(jī)械或酶法分散，以提供單細(xì)胞懸液，或可以使用完整人肝臟組織的碎片。例如，通過常規(guī)的膠原酶灌注 (Ryan et al. , Meth. Cell Biol. 13 :29，1976)，然后進(jìn)行低速離心，將肝細(xì)胞從供體組織分離。然后可以通過不銹鋼篩網(wǎng)過濾，隨后進(jìn)行密度梯度離心，來純化肝細(xì)胞?？蛇x地，其他的用于富集肝細(xì)胞的方法也可以使用，例如熒光激活的細(xì)胞分選術(shù)、盤選、磁珠分離、在離心力場(chǎng)中淘洗，或本技術(shù)領(lǐng)域中公知的任何其他方法。可以使用類似的肝細(xì)胞分離方法，從受體小鼠肝臟收集被擴(kuò)增的人肝細(xì)胞?；蛘撸梢允褂肎uguen-Guillouzo 等(Cell Biol. Int. Rep. 6 :625_628，1982)描述的技術(shù)來制備人肝細(xì)胞。簡(jiǎn)單來說，分離肝或其一部分，并將套管導(dǎo)入門靜脈或門脈分支。然后經(jīng)套管對(duì)肝臟組織進(jìn)行灌注使用無鈣緩沖液，然后使用在溶于HEPES緩沖液中的氯化鈣溶液(例如大約0.075%氯化鈣)中含有膠原酶(例如大約0.025%膠原酶)的酶溶液，以每分鐘30到70毫升的流速在37°C下進(jìn)行灌注。將灌注過的肝臟組織切碎成小塊 (例如大約1立方毫米)。在與上述相同的緩沖液中在37°C下酶法消化大約10-20分鐘，同時(shí)輕輕攪拌，以產(chǎn)生細(xì)胞懸液。通過將所述細(xì)胞懸液通過60-80微米的尼龍篩網(wǎng)進(jìn)行過濾， 收集釋放的肝細(xì)胞。然后將收集到的肝細(xì)胞在PH7. 0的冷HEPES緩沖液中使用緩慢離心法洗滌，以除去膠原酶和細(xì)胞碎片。非實(shí)質(zhì)細(xì)胞可以通過甲泛葡胺(metrizamide)梯度離心 (參見美國(guó)專利No. 6，995，299)來除去。人肝細(xì)胞可以從新鮮組織(例如在死亡后數(shù)小時(shí)內(nèi)獲得的組織)或新鮮冷凍的組織(例如冷凍和維持在或低于o°c下的新鮮組織)獲得。所述人組織優(yōu)選地沒有可檢測(cè)的病原體，在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)方面正常，并且基本無疾病。用于移入的肝細(xì)胞可以是最近分離的，例如在幾小時(shí)內(nèi)，或者如果所述細(xì)胞維持在適合的儲(chǔ)存介質(zhì)中，可以在較長(zhǎng)的時(shí)期后進(jìn)行移植。在下面實(shí)施例中描述的一種這樣的介質(zhì)是VIASPAN (用于保存腹內(nèi)器官的通用主動(dòng)脈沖洗液和冷藏溶液；也被稱為威斯康辛大學(xué)溶液(University of Wisconsin solution)或UW)。在移植之前，肝細(xì)胞也可以被冷凍保存。冷凍保存肝細(xì)胞的方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的，記載在美國(guó)專利No. 6，136，525中。除了從器官供體或肝切除物獲得人肝細(xì)胞之外，用于移入的細(xì)胞也可以是在移植到受體動(dòng)物中后，發(fā)育或分化成能夠擴(kuò)增的人肝細(xì)胞的人干細(xì)胞或肝細(xì)胞前體細(xì)胞。已經(jīng)從內(nèi)胚泡細(xì)胞團(tuán)(Thomson et al.，Science 282:1145-1147,1998)和發(fā)育中的生殖細(xì)胞 (Shamblott et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726-13731,1998)中分離了具有 ES 細(xì)胞性質(zhì)的人細(xì)胞，并且已經(jīng)產(chǎn)生了人胚胎干細(xì)胞(參見美國(guó)專利No. 6，200，806)。正如在美國(guó)專利No. 6，200, 806中公開的，ES細(xì)胞可以從人或非人靈長(zhǎng)類產(chǎn)生。還可以獲得從人或非人靈長(zhǎng)類細(xì)胞誘導(dǎo)的 iPS (參見例如 Yu er al.，Science 318(5858) 1917-1920, 2007 ； Takahashi et al.，Cell 131(5) 861-872,2007 ；Liu et al.，Cell Stem Cell 3(6) 587-590，2008)。一般來說，靈長(zhǎng)類ES細(xì)胞是在存在ES細(xì)胞培養(yǎng)基的情況下，在鼠類胚胎成纖維細(xì)胞的匯合層上分離。ES培養(yǎng)基一般由80%的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM ； 無丙酮酸，高葡萄糖配方，Gibco BRL)，以及20%的胎牛血清(FBS;Hyclone)，0. ImM β-巰基乙醇(Sigma)，1%非必需氨基酸儲(chǔ)液(Gibco BRL)構(gòu)成。ES細(xì)胞與成年人中存在的定向“多能”干細(xì)胞相比，區(qū)別特點(diǎn)包括ES細(xì)胞能夠在培養(yǎng)中無限期地維持未分化狀態(tài)的能力，以及ES具有發(fā)育成每種不同細(xì)胞類型的潛力。人ES(hES)表達(dá)SSEA-4，這是被特異性單克隆抗體識(shí)別的糖脂細(xì)胞表面抗原(參見例如Amit et al. , Devel. Biol. 227 =271-278, 2000)。源自于人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)的人肝細(xì)胞也可用于本文描述的方法中。將骨髓來源的hMSC連續(xù)暴露于肝原性因子，導(dǎo)致干細(xì)胞分化成具有肝細(xì)胞性質(zhì)的細(xì)胞(參見 Snykers et al. ,BMC Dev Biol. 7 24,2007 ；Aurich et al.，Gut. 56(3)405—15，2007)。骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞和脂肪組織來源的干細(xì)胞(ADSC)的肝原性分化也已被描述(參見 Talens-Visconti et al. , World J Gastroenterol. 12(36) :5834_45，2006)。人肝細(xì)胞也可以從單核細(xì)胞產(chǎn)生。Ruhnke 等(Transplantation 79(9) 1097-103，2005)描述了從終末分化的外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生肝細(xì)胞樣(NeoH印)細(xì)胞。NeoH印細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)、各種分泌和代謝功能，以及藥物解毒活性方面，與原代人肝細(xì)胞類似。此外，源自于羊水細(xì)胞的人肝細(xì)胞，也可以用在本文描述的方法中。人ES細(xì)胞系已有，并可用于本文公開的方法中。人ES細(xì)胞也可以源自于體外受精(IVF)胚胎的植入前胚胎。對(duì)未使用過的人IVF產(chǎn)生的胚胎進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在許多國(guó)家(例如新加坡和英國(guó))是允許的，條件是所述胚胎小于14日齡。只有高質(zhì)量的胚胎適合于ES 分離。用于將單細(xì)胞人胚胎培養(yǎng)成擴(kuò)增的囊胚泡的現(xiàn)有的確定培養(yǎng)條件，已經(jīng)被描述(參見Bongso et al. ,Hum R印rod. 4 :706_713，1989)。人胚胎與人輸卵管細(xì)胞的共培養(yǎng)，導(dǎo)致產(chǎn)生了高的胚泡質(zhì)量。在細(xì)胞共培養(yǎng)或在改進(jìn)的確定成分培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的源自于IVF的擴(kuò)增人胚泡，允許分離人ES細(xì)胞(參見美國(guó)專利No. 6，200, 806)。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過移植(例如通過注射)到脾臟中，將人肝細(xì)胞送遞到受體小鼠。肝細(xì)胞可以通過其他手段送遞，例如通過注射到肝實(shí)質(zhì)或門靜脈中。注射到受體小鼠中的人肝細(xì)胞的數(shù)量可以是不同的。在一個(gè)實(shí)施方案中，注射了約IO5到約IO7個(gè)人肝細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，注射了約5X105到約5X106個(gè)人肝細(xì)胞。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，注射了約IO6個(gè)人肝細(xì)胞。VII. Fah缺陷小鼠及其用途本文公開的Fah缺陷小鼠可以用于多種研究和治療目的。例如，免疫缺陷且Fah 缺陷小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞(例如人肝細(xì)胞)可以用于研究藥物代謝和毒性，以及肝臟病原體感染。雖然本文中示例了人肝細(xì)胞，但也可以在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增來自其他物種的肝細(xì)胞，包括來自大鼠、狗、貓、牛、豬、馬和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物(例如狒狒、黑猩猩和獼猴)的肝細(xì)胞。Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的人肝細(xì)胞可以在需要重建肝臟療法的受試者中用于重建人肝臟。另外，以人肝細(xì)胞重建的Fah缺陷小鼠可作為肝臟疾病(例如HCC、肝硬化和肝感染) 的動(dòng)物模型。Fah缺陷小鼠以及在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞的示例性用途在下文進(jìn)一步討論。A.人肝細(xì)胞的擴(kuò)增及其醫(yī)學(xué)用途本公開內(nèi)容考慮到了在受體小鼠中擴(kuò)增并從其中收集的人肝細(xì)胞，作為人肝細(xì)胞的來源，用于在需要肝臟重建療法的受試者中進(jìn)行肝臟重建的用途。通過導(dǎo)入肝細(xì)胞在患者中重建肝組織，是患有急性肝衰竭患者的潛在的治療性選擇，也可以作為在肝移植前的暫時(shí)處理，或作為對(duì)患有單一性代謝缺陷(isolated metabolic deficiencies)的患者的確定性治療(Bumgardner et al. ,Transplantation 65 :53_61，1998)。肝細(xì)胞重建可以用于例如導(dǎo)入遺傳修飾的肝細(xì)胞以進(jìn)行基因療法，或用于替換由于疾病、物理或化學(xué)損傷或腫瘤而引起的肝細(xì)胞損失(美國(guó)專利No. 6，995，299)。此外，擴(kuò)增的人肝細(xì)胞可用于放置在人造肝臟輔助裝置中。從Fah缺陷小鼠收集人肝細(xì)胞的方法以及所擴(kuò)增人肝細(xì)胞的醫(yī)學(xué)用途會(huì)在下文更詳細(xì)地描述。1.從Fah缺陷小鼠收集人肝細(xì)胞可以使用本技術(shù)領(lǐng)域在已知的許多技術(shù)中的任何一種，從受體小鼠收集人肝細(xì)胞。例如，可以將小鼠麻醉，將導(dǎo)管插入門靜脈或下腔靜脈。然后可以用適合的緩沖液(例如無鈣且無鎂，添加有0. 5mM EGTA和IOmM HEPES的EBSS)對(duì)肝進(jìn)行灌注，然后進(jìn)行膠原酶處理(例如使用添加有0. lmg/ml膠原酶XI和0. 05mg/ml DNase I的EBSS溶液)。可以將所述肝臟輕緩地切碎，通過尼龍篩網(wǎng)(例如順續(xù)通過70μπι和40μπι的尼龍篩網(wǎng))進(jìn)行過濾，然后離心并清洗細(xì)胞。可以使用本技術(shù)領(lǐng)域中任何公知的技術(shù)，將從受體小鼠收集的人肝細(xì)胞與非人細(xì)胞或其他污染物(例如組織或細(xì)胞碎片)分離開。例如，這樣的方法包括使用與人肝細(xì)胞選擇性結(jié)合的抗體。這樣的抗體包括但不限于特異性地結(jié)合I類主要組織相容性抗原的抗體，例如抗人 HLA-A、B、C 抗體(Markus et al. , Cell Transplantation 6 :455_462，1997) 或CD46。特異性針對(duì)人細(xì)胞或人肝細(xì)胞的抗體，可以用于各種不同的技術(shù)中，包括FACS、盤選或磁珠分離?；蛘撸蛇x擇性地結(jié)合小鼠細(xì)胞的抗體可以用于除去污染小鼠細(xì)胞，從而富集人肝細(xì)胞。FACS使用了多種顏色通道、低角度和鈍角光散射檢測(cè)通道和阻抗通道，以及其他更復(fù)雜水平的檢測(cè)，來分離或分選抗體結(jié)合的細(xì)胞(參見美國(guó)專利No. 5，061，620)。磁性分離涉及了使用順磁性顆粒，它們1)與人特異性抗體綴合；2)與能夠結(jié)合人特異性抗體的檢測(cè)抗體綴合；或3)與能夠與生物素化抗體結(jié)合的親和素結(jié)合。盤選涉及與固相基質(zhì) (例如瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纖維膜或塑料培養(yǎng)皿結(jié)合)的單克隆抗體。被所述抗體結(jié)合的細(xì)胞，可以通過簡(jiǎn)單地將所述固相載體與所述樣品物理分離，而從所述樣品中分離出來。從Fah缺陷小鼠收集的肝細(xì)胞可以例如冷凍保存?zhèn)溆?，或者鋪板于組織培養(yǎng)物中用于運(yùn)輸和以后使用。2.人肝重建Fah缺陷小鼠提供了一種增殖人肝細(xì)胞的系統(tǒng)，所述人肝細(xì)胞可以用于重建人肝臟，替代或輔助肝臟移植。如今，患有肝臟疾病的患者可能必須等待很長(zhǎng)時(shí)間，才能獲得適合移植的器官。在移植后，患者終生需要以免疫抑制劑進(jìn)行治療，目的是避免對(duì)所述供體肝臟的排斥。用于增殖患者自身細(xì)胞的方法可以提供功能性肝臟組織的來源，這不需要免疫抑制來維持存活。因此，本文公開的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠可以用于重建患肝臟疾病和/ 或肝衰竭的受試者的肝臟，使用的是已經(jīng)在所述Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的其自身肝細(xì)胞—— 包括從患者特定干細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞，或者來自供體的肝細(xì)胞。通過導(dǎo)入肝細(xì)胞(也稱為“肝細(xì)胞移植”)在患者中重建肝臟組織，是患急性肝衰竭患者的潛在的治療性選擇，也可以作為肝臟移植前的暫時(shí)處理，或作為對(duì)患有單一性代謝缺陷的患者的確定性治療(Bumgardner et al. ,Transplantation 65:53-61,1998)。實(shí)現(xiàn)治療性肝臟重建的一個(gè)主要障礙是宿主對(duì)移植肝細(xì)胞的免疫排斥，該現(xiàn)象(其中宿主和供體細(xì)胞的遺傳和表型不同)稱為“同種異體移植物排斥”。免疫抑制劑在防止同種異體移植物排斥中僅部分地取得成功(Javregui et al.，Cell Transplantation 5 =353-367,1996 ；Makowka et al. , Transplantation 42:537-541,1986)。在 Fah 缺陷小鼠中擴(kuò)增的人肝細(xì)胞還可用于基因治療應(yīng)用。在最廣意義上，將這類肝細(xì)胞移植至人宿主中以改正遺傳缺陷。所述傳代的肝細(xì)胞不必，但可以源自于將作為所述移植物受體的同一個(gè)體。在一些實(shí)施方案中，在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的人肝細(xì)胞可用于在受試者中重建肝臟組織，作為肝移植的前奏或替代方案。作為非限制性實(shí)例，患有進(jìn)行性肝臟變性的受試者 (例如由酒精中毒引起)可以作為隨后在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞的供體。肝細(xì)胞的數(shù)目相對(duì)于最初獲自所述受試者并且被移植至所述Fah缺陷小鼠中的數(shù)目被擴(kuò)增。在擴(kuò)增后，所述人肝細(xì)胞可以從所述Fah缺陷小鼠分離，并且可以用于重建所述受試者的肝臟功能。在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增肝細(xì)胞不僅可用于增加肝細(xì)胞數(shù)目，而且可用于選擇性地除去患有傳染性或惡性疾病的肝細(xì)胞。具體而言，受試者可以患有病毒性肝炎，其中一些但非全部肝細(xì)胞被感染，并且感染的肝細(xì)胞可以通過所述細(xì)胞表面中或上的病毒抗原的存在情況鑒定。在這類實(shí)例中，可以從所述受試者收集肝細(xì)胞，并且可以選出非感染細(xì)胞在一只或多只Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增，例如通過FACS。同時(shí)，可以進(jìn)行攻擊步驟以清除患者中的感染。在治療后，可以用在所述一只或多只Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的肝細(xì)胞重建所述受試者的肝臟組織。類似的方法可以用于從患有肝惡性腫瘤(例如HCC)的患者選擇性地傳代非惡性細(xì)胞。B. Fah缺陷小鼠作為肝臟疾病模型動(dòng)物中的Fah缺陷可導(dǎo)致類似于人疾病1型遺傳性酪氨酸血癥(HTl)的疾病表型。為了防止致死，用NTBC維持Fah缺陷動(dòng)物以防止肝機(jī)能障礙(當(dāng)動(dòng)物未以表達(dá)FAH的人肝細(xì)胞再殖時(shí))，然而對(duì)NTBC劑量的滴定可用于促進(jìn)HTl型表型(包括HCC、纖維化和肝硬化)發(fā)生。另外，以人肝細(xì)胞再殖的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠可以使用例如轉(zhuǎn)化劑、毒劑或通過引入惡性人肝細(xì)胞而被誘導(dǎo)形成肝臟疾病。因此，本文公開的Fah缺陷小鼠可用于研究多種肝臟疾病，包括HCC和肝硬化。在一些實(shí)施方案中，本文公開的Fah缺陷小鼠可用作人肝臟疾病的動(dòng)物模型。Fah 缺陷小鼠可用作由例如暴露于毒素、感染性疾病或惡性腫瘤或者由遺傳缺陷(即導(dǎo)致HTl 的Fah缺陷)引起的肝臟疾病的模型。Fah缺陷小鼠可作為模型的人遺傳性肝臟疾病的實(shí)例包括但不限于高膽固醇血癥、高甘油三酸酯血癥、高草酸鹽尿、苯丙酮尿癥、楓糖尿癥、糖原貯積病、溶酶體貯積病(例如高歇氏病(Gaucher' s disease))和任何先天代謝缺陷。 所公開的模型系統(tǒng)可以用于更好地理解具體肝臟疾病，以及用于鑒定可以阻止、延緩或逆轉(zhuǎn)疾病過程的試劑。在一些情形中，如果所述Fah缺陷小鼠被用作因毒素引起的肝臟疾病的模型，用 NTBC維持所述Fah缺陷小鼠，以在人肝細(xì)胞在肝臟中充分再殖之前防止肝機(jī)能障礙。產(chǎn)生最接近地模擬相應(yīng)人病癥所需的毒劑量可以通過使用暴露于增量所述毒劑的大量Fah 缺陷小鼠確定。毒劑的實(shí)例包括但不限于乙醇、對(duì)乙酰氨基酚、苯妥英、甲基多巴、異煙胼 (isoniazid)、四氯化碳、黃磷和鬼筆環(huán)肽。在一些情形中，所述Fah缺陷小鼠在不存在人肝細(xì)胞的情況下(但存在NTBC或其他類似化合物的情況下)被用作評(píng)估毒素作用的模型。在其他實(shí)例中，所述Fah缺陷小鼠被以人肝細(xì)胞移植，以評(píng)估所述毒素對(duì)人肝細(xì)胞的效應(yīng)。在這些實(shí)例中，不必用NTBC維持所述Fah缺陷小鼠。一般而言，允許人肝細(xì)胞擴(kuò)增至所述人肝細(xì)胞群規(guī)模達(dá)到大量(例如已接近最大值)的程度，然后將所述Fah缺陷小鼠暴露于所述毒劑。
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在一些其中Fah缺陷小鼠在不存在人肝細(xì)胞的情況下用作惡性肝臟疾病(例如 HCC或肝癌)的模型的實(shí)施方案中，所述Fah缺陷小鼠被給予足夠高劑量的NTBC以防止由于肝功能障礙引起死亡，同時(shí)足夠低以允許HCC或其他肝惡性腫瘤形成?；蛘?，可用可防止任何肝臟機(jī)能障礙的NTBC劑量維持所述Fah缺陷小鼠，所述惡性腫瘤可以通過暴露于轉(zhuǎn)化劑或者通過引入惡性細(xì)胞產(chǎn)生。另一種選擇是移植人肝細(xì)胞并誘導(dǎo)HCC，例如通過使用轉(zhuǎn)化齊U，或者以惡性人肝細(xì)胞移植所述小鼠。因此，在一些實(shí)例中，所述Fah缺陷小鼠在不存在人肝細(xì)胞的情況下被用作惡性肝臟疾病模型。在其他實(shí)例中，所述Fah缺陷小鼠被以人肝細(xì)胞移植，以評(píng)估所述人細(xì)胞的惡性肝臟疾病。在這些實(shí)例中，不必用NTBC維持所述Fah 缺陷小鼠。所述轉(zhuǎn)化劑或惡性細(xì)胞可以隨初始人肝細(xì)胞植入而引入，或者在所述人肝細(xì)胞已經(jīng)開始在宿主動(dòng)物中增殖后引入。在轉(zhuǎn)化劑的情形中，可以優(yōu)選地在人肝細(xì)胞活躍地增殖時(shí)給予所述試劑。轉(zhuǎn)化劑的實(shí)例包括黃曲霉毒素、二甲基亞硝胺，以及包含0.05-0.DL-乙 ^WiMlM II M Χ ^ (Farber and Sarma, 1987, in Concepts and Theories in Carcinogenesis, Maskens et al.，eds, Elsevier, Amsterdam, pp. 185-220)。這類轉(zhuǎn)化齊[J 可全身給予動(dòng)物或者局部給予肝臟自身?？梢詫盒约?xì)胞直接接種于肝臟中。C. Fah缺陷小鼠作為肝臟感染模型在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的并從其中收集的人肝細(xì)胞，也可用于各種不同的微生物學(xué)研究。許多病原體(例如細(xì)菌、病毒和寄生物)只能夠在人宿主或原代人肝細(xì)胞中復(fù)制。因此，具有足夠的原代人肝細(xì)胞來源，對(duì)于這些病原體的研究來說是關(guān)鍵的。擴(kuò)增的人肝細(xì)胞可用于病毒感染或復(fù)制的研究，或用于鑒定調(diào)節(jié)肝臟疾病毒感染的化合物的研究。使用原代人肝細(xì)胞研究肝臟病毒的方法，描述在例如歐洲專利No. 1552740、美國(guó)專利No. 6，509，514和PCT公布No. WO 00/17338中。肝臟病毒實(shí)例包括甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和巨細(xì)胞病毒(CMV)?？筛腥靖闻K的寄生物的實(shí)例例如瘧疾致病因子(瘧原蟲(Plasmodium)種，包括鐮狀瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日皰原蟲(Plasmodium vivax)、卵形皰原蟲(Plasmodium ovale)、三日皰原蟲(Plasmodium malariae)和諾爾斯皰原蟲(Plasmodium knowlesi))和利什曼病致病因子(利什曼原蟲屬(Leishmania)種，包括杜利什曼原蟲(L. donovani)、嬰兒利什曼原蟲 (L. infantum)、恰加斯利什曼原蟲(L. chagasi)、墨西哥利什曼原蟲(L. mexicana)、亞馬遜利什曼原蟲(L. amazonensis)、委內(nèi)瑞拉利什曼原蟲(L. venezuelensis)、熱帶利什曼原蟲 (L. tropica)、碩大利什曼原蟲(L. major)、埃塞俄比亞利什曼原蟲(L. aethiopica)、巴西利什曼原蟲(L. (V. )braziliensis)、圭亞那利什曼原蟲(L. (V.) guyanensis)、巴拿馬利什曼原蟲(L. (V. )panamensis)和秘魯利什曼原蟲(L. (V.) peruviana))。除了使用在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增的人肝細(xì)胞進(jìn)行微生物研究之外，所述Fah缺陷小鼠本身還可以作為肝臟病原體感染的動(dòng)物模型。例如，以人肝細(xì)胞再殖的Fah缺陷小鼠可被用肝臟病原體感染，并且可用于篩查用于治療所述感染的候選試劑。候選試劑包括來自許多化學(xué)物類別中任一類別的任何化合物，例如小有機(jī)化合物。候選試劑還包括生物分子，例如核酸分子(包括反義寡核苷酸、小干擾RNA、微小RNA、核酶、短發(fā)夾RNA、表達(dá)載體等)、肽和抗體、糖、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、它們的衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或結(jié)合物。候選試劑可以獲自多種來源，包括合成或天然化合物庫。例如，有多種方式用于隨機(jī)和定向合成多種有機(jī)化合物和生物分子，包括表達(dá)隨機(jī)寡核苷酸和寡肽。或者，可獲得或容易地產(chǎn)生細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物形式的天然化合物庫。另外，天然或合成方法產(chǎn)生的庫和化合物可容易地通過常規(guī)化學(xué)、物理和生物化學(xué)方法修飾，并且可用于產(chǎn)生組合庫?？梢詫?duì)已知藥理學(xué)試劑進(jìn)行定向或隨機(jī)化學(xué)修飾(例如?；?、烷化、酯化、酰胺化 (amidification)等)以產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類似物。下文討論了使用Fah缺陷小鼠來研究HCV和HBV感染，以及評(píng)估用于治療這些感染的候選試劑。然而，所述方法可以應(yīng)用于任何目的肝臟病原體。在一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ah 缺陷小鼠被用于鑒定可抑制病毒感染、減少病毒復(fù)制并且/或者改善HBV或HCV感染引起的一種或多種癥狀的試劑。通常，將所述候選試劑給予所述Fah缺陷小鼠，并且相對(duì)于對(duì)照評(píng)估所述候選試劑的效果。例如，可以將所述候選試劑給予HCV感染的Fah缺陷小鼠，并且可以將所治療動(dòng)物的病毒滴度(例如通過對(duì)血清樣品的RT-PCR測(cè)量)與治療之前的所述動(dòng)物和/或未治療的HCV感染動(dòng)物的病毒滴度比較。以候選試劑治療后的感染動(dòng)物病毒滴度的可檢測(cè)降低表示所述試劑有抗病毒活性。可以以適合用于送遞所述候選試劑的任何方式給予所述試劑。例如，可以通過注射(例如通過靜脈內(nèi)注射、肌內(nèi)注射、皮下注射或直接注射至靶組織)、口服或者通過任何其他合適方式給予所述候選試劑。在一些情形中，所述體內(nèi)篩查將涉及接受不同量和濃度的所述候選試劑的多個(gè)Fah缺陷小鼠(從無試劑至接近可安全送遞至所述動(dòng)物的量的上限的試劑量)，并且可以包括以不同的制劑和路徑送遞所述試劑。候選試劑可以單獨(dú)地或者以兩種或多種的組合的形式給藥，特別是在給予試劑組合可產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)的情況下?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中已知多種方法的任一種評(píng)估所述候選試劑的活性。例如，如果所述Fah缺陷小鼠被嗜肝病原體(例如HBV或HCV)感染，可以通過對(duì)血清樣品檢查病原體(例如測(cè)量病毒滴度)或者與所述病原體存在有關(guān)的標(biāo)記物(例如病原體特異性蛋白質(zhì)或編碼核酸)的存在情況評(píng)估所述試劑的效果。用于檢測(cè)和評(píng)估病毒感染存在情況和嚴(yán)重性的定性和定量方法是本領(lǐng)域中公知的。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過對(duì)血清樣品和/ 或組織切片檢查病毒抗原(例如HBV表面抗原(HBsAg)或HBV核心抗原(HbcAg))的存在情況評(píng)估試劑抗HBV感染的活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過對(duì)血清樣品檢查病毒核酸(例如HCV RNA)的存在情況評(píng)估試劑抗病毒感染的活性。例如，可以通過以下方法檢測(cè) HCV RNA 例如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)、競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR或分支DNA (bDNA)測(cè)定法； 通過RT-PCR檢測(cè)負(fù)鏈RNA (HCV的復(fù)制中間體)；或者測(cè)序病毒RNA以隨治療進(jìn)行檢測(cè)病毒基因組的突變/移位(“準(zhǔn)種進(jìn)化”)?？蛇x地，或者另外地，可對(duì)宿主肝臟進(jìn)行或組織活檢并進(jìn)行原位RT-PCR雜交，以直接顯示組織切片中病毒顆粒量的任何定性或定量變化。可選地，或者另外地，可以安樂處死所述宿主，對(duì)肝臟組織學(xué)檢查所述試劑造成的感染和/或毒性體征。Fah缺陷小鼠還可以被用于對(duì)候選疫苗篩查其防止或減輕嗜肝病原體引起的感染的能力。通常，疫苗是在給藥后，可幫助所述宿主啟動(dòng)抗所述靶病原體的免疫反應(yīng)的試劑。 所引發(fā)的體液、細(xì)胞或體液/細(xì)胞免疫反應(yīng)可以有利于抑制病原體(所述疫苗是針對(duì)其開發(fā)的)的感染。本公開內(nèi)容中特別關(guān)注這樣的疫苗，即其可誘發(fā)抑制嗜肝病原體(例如微生物、病毒或寄生病原體)——特別是病毒病原體例如HBV和/或HCV——感染和/或肝內(nèi)復(fù)制的免疫反應(yīng)。
為了評(píng)估候選疫苗，將所述Fah缺陷小鼠以人肝細(xì)胞移植，以用人肝細(xì)胞再殖所述小鼠肝臟。對(duì)有效疫苗的篩查類似于上文描述的篩查方法。在一些實(shí)施方案中，將所述候選疫苗給予所述Fah缺陷小鼠，然后以所述嗜肝臟病原體接種。在一些情形中，通過以下方式給予所述候選疫苗提供單次推注(例如腹膜內(nèi)或肌肉注射、外用或口服)，任選地隨后進(jìn)行一次或多次加強(qiáng)免疫。免疫反應(yīng)的誘導(dǎo)可以通過本領(lǐng)域中公知方法檢測(cè)抗原/疫苗特異性的B和T細(xì)胞應(yīng)答來進(jìn)行評(píng)估。然后用所述嗜肝病原體攻擊所述免疫的Fah缺陷小鼠。一般而言，用滴度遞增的病原體攻擊多個(gè)免疫的動(dòng)物。然后對(duì)所述動(dòng)物觀察感染的形成，并評(píng)估感染的嚴(yán)重性(例如通過評(píng)估存在的病原體的滴度，或者檢查人肝細(xì)胞功能參數(shù))。可顯著降低所述病原體感染并且/或者顯著降低攻擊后產(chǎn)生的疾病的嚴(yán)重性的候選疫苗被鑒定為有活力的疫苗。D.藥理學(xué)、毒性和基因治療研究在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增并從其收集的Fah缺陷小鼠和/或人肝細(xì)胞可用于評(píng)估任何藥物化合物(例如小分子、生物制品、環(huán)境和生物毒素或基因送遞系統(tǒng))對(duì)人肝細(xì)胞基因表達(dá)的改變。正如在下面的實(shí)施例中描述的，在從受體小鼠收集的擴(kuò)增的人肝細(xì)胞中，檢測(cè)了參與藥物綴合和解毒的基因(包括幾種肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因)的表達(dá)。最近的研究顯示了這些綴合途徑(Kostrubsky et al.，Drug. Metab. Dispos. 28 1192-1197，2000)和肝細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Kostrubsky et al.，Toxicol. Sci. 90 :451_459，2006)在預(yù)測(cè)藥物毒性中發(fā)揮的關(guān)鍵作用。除了對(duì)外源藥物(例如利福平、PB或BNF)引起的CYP誘導(dǎo)的正常人應(yīng)答，在 FRG小鼠中擴(kuò)增的人肝細(xì)胞對(duì)核激素受體轉(zhuǎn)錄因子、綴合途徑和主要轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，也允許對(duì)這些基因產(chǎn)物在人藥物代謝和毒性中的作用進(jìn)行體內(nèi)評(píng)估。人源化FRG小鼠顯示人典型的血脂譜，具有顯著較高的LDL膽固醇含量(參見表 4)，而對(duì)照小鼠顯示小鼠血的典型高HDL含量。人源化FRG小鼠因此可用于測(cè)試抗高脂血癥藥物和抗動(dòng)脈粥樣硬化醫(yī)藥。人源化FRG小鼠的膽囊中顯示人膽汁酸組成(參見表3)。 這表示這些小鼠可用于測(cè)定正常和生物異源性代謝物的膽汁分泌。例如，在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增并從其收集的人肝細(xì)胞可用于評(píng)估人細(xì)胞中具體化合物的毒性。測(cè)試分離的肝細(xì)胞中化合物毒性的方法是本領(lǐng)域中公知的，記載于例如PCT 公開文本No. W02007/022419中。類似地，移植有人肝細(xì)胞的Fah缺陷小鼠可以用于評(píng)估外源性試劑的毒性。在一些實(shí)施方案中，所述外源性試劑是已知毒素或疑似的毒素。在一些實(shí)施方案中，移植有人肝細(xì)胞(或在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增并從其收集的人肝細(xì)胞)的Fah缺陷小鼠被用于評(píng)估藥物代謝和藥物動(dòng)力學(xué)的多個(gè)參數(shù)中的任一個(gè)。例如， 可以進(jìn)行研究來評(píng)估藥物代謝；體內(nèi)藥物/藥物相互作用；藥物半衰期；排泄/清除途徑； 尿、糞便、膽汁、血液或其他體液中的代謝產(chǎn)物；細(xì)胞色素P450誘導(dǎo)；腸肝再循環(huán)；以及酶/ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白誘導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，移植有人肝細(xì)胞(或在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增并從其收集的人肝細(xì)胞)的Fah缺陷小鼠可用于評(píng)估化合物——包括治療劑或候選試劑(例如小分子或生物制品)、環(huán)境或生物毒素或者基因送遞系統(tǒng)——的毒理學(xué)和安全性。例如，可以評(píng)估人肝細(xì)胞的細(xì)胞周期增殖，例如以確定暴露于所述化合物后患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。還可以評(píng)估對(duì)肝細(xì)胞的毒性，例如通過組織學(xué)、凋亡指數(shù)、肝功能試驗(yàn)等。還可以進(jìn)行肝細(xì)胞代謝的分析，例如在感染穩(wěn)定的同位素前體后分析代謝產(chǎn)物。還可以在移植有人肝細(xì)胞的Fah缺陷小鼠中評(píng)估具體藥物的效力。這類藥物包括例如治療高脂血癥/動(dòng)脈粥樣硬化、肝炎和瘧疾的藥物。在一些實(shí)施方案中，移植有人肝細(xì)胞(或在Fah缺陷小鼠中擴(kuò)增并從其收集的人肝細(xì)胞)的Fah缺陷小鼠被用于研究基因治療方案和載體。例如，可以評(píng)估以下的參數(shù)基因送遞載體(包括病毒和非病毒載體)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；遺傳物質(zhì)(genetic payload)的整合頻率和定位(整合部位分析)；遺傳物質(zhì)的功能性(基因表達(dá)水平、基因敲除效率)；以及遺傳物質(zhì)的副作用(體內(nèi)人肝細(xì)胞基因表達(dá)或蛋白組學(xué)的分析)。例如，已有報(bào)道稱在對(duì)患有家族性高膽固醇血癥的患者的基因治療中使用轉(zhuǎn)染的肝細(xì)胞(Grossman et al. Nat. Genet. 6 :335，1994)。VIII.編碼尿激酶的載體在本文描述的方法的一些實(shí)施方案中，在人肝細(xì)胞移植之前，向Fah缺陷小鼠給予編碼尿激酶的載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶(也被稱為尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑(uPA))是分泌形式的人尿激酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，尿激酶是經(jīng)修飾的、非分泌形式的尿激酶(參見美國(guó)專利No. 5，980，886)。任何類型的適合于在小鼠中表達(dá)尿激酶的載體都可以考慮。這樣的載體包括質(zhì)粒載體或病毒載體。適合的載體包括但不限于DNA載體、腺病毒載體、反轉(zhuǎn)錄病毒載體、假型反轉(zhuǎn)錄病毒載體、AAV載體、長(zhǎng)臂猿白血病病毒載體、 VSV-G、VL30載體、脂質(zhì)體介導(dǎo)的載體，等等。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體是腺病毒載體。 腺病毒載體可以源自于任何適合的腺病毒，包括任何腺病毒血清型(例如但不限于Ad2和 Ad5)。腺病毒載體可以是第一、第二、第三和/或第四代腺病毒載體或無內(nèi)容(gutless)腺病毒載體。非病毒載體可以由不同結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒、磷脂、脂質(zhì)體(陽離子或陰離子)構(gòu)成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒載體是AAV載體。AAV載體可以是本技術(shù)領(lǐng)域中已知的任何適合的 AAV載體。編碼尿激酶的病毒和非病毒載體在本技術(shù)領(lǐng)域中是眾所周知的。例如，編碼人尿激酶的腺病毒載體記載于美國(guó)專利No. 5，980，886以及Lieber et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92(13) :6210_4，1995)中。美國(guó)專利申請(qǐng)公布 No. 2005-176129 和美國(guó)專利 No. 5，585，362描述了重組腺病毒載體，美國(guó)專利No. 6，025，195公開了用于肝臟特異性表達(dá)的腺病毒載體。美國(guó)專利申請(qǐng)公布No. 2003-0166284描述了用于目標(biāo)基因(包括尿激酶基因)的肝臟特異性表達(dá)的腺伴隨病毒(AAV)載體。美國(guó)專利Nos. 6，521，225和5，589，377 描述了重組AAV載體。PCT公布No. W00244393描述了含有人尿激酶血纖維蛋白溶酶原激活劑基因的病毒和非病毒載體。能夠高水平表達(dá)人尿激酶基因的表達(dá)載體公開在PCT公布 No. WO 03087393 中。編碼尿激酶的載體可以任選包含表達(dá)控制序列，包括適合的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、轉(zhuǎn)錄終止子、蛋白編碼基因前的起始密碼子(即ATG)、用于內(nèi)含子以及維持該基因的正確閱讀框以允許mRNA正確翻譯的剪接信號(hào)，以及終止密碼子。一般來說，表達(dá)控制序列包括啟動(dòng)子——足以指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的最小序列。表達(dá)載體可以包含復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子，以及允許對(duì)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞進(jìn)行表型篩選的特定基因(例如抗生素抗性盒式元件)。一般來說，表達(dá)載體將包含啟動(dòng)子。啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的或組成型的。啟動(dòng)子可以是組織特異性的。適合的啟動(dòng)子包括胸苷激酶啟動(dòng)子(TK)、金屬硫蛋白I、多角體蛋白、神經(jīng)元特異性烯醇化酶、酪氨酸羥化酶、肌動(dòng)蛋白或其他啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施方案中，啟動(dòng)子是異源啟動(dòng)子。在一個(gè)實(shí)施例中，編碼尿激酶的序列位于所需啟動(dòng)子的下游。任選地還包含增強(qiáng)子元件，它一般可以位于載體上任何位置而仍然具有增強(qiáng)效應(yīng)。但是，活性增加的量，一般將隨著距離而減小。編碼尿激酶的載體可以通過各種不同的途徑給予，包括但不限于靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或經(jīng)門靜脈進(jìn)行血管內(nèi)輸注。所給予的載體的量可以改變，并且可以使用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來確定。在一個(gè)實(shí)施方案中，以約IX IO8至約IX IOki噬斑形成單位的劑量向FRG小鼠給予編碼尿激酶的腺病毒載體。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述劑量是約5Χ IO9噬斑形成單位。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，向FRG小鼠給予編碼人尿激酶的腺病毒載體。與其他類型的病毒載體相比，腺病毒載體具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，例如它們可以被生產(chǎn)為具有非常高滴度的感染性顆粒；它們可感染很多種類的細(xì)胞；它們將可基因有效地轉(zhuǎn)移到?jīng)]有在分裂的細(xì)胞中；以及它們很少整合到客體基因組中，這避免了由于插入性誘變導(dǎo)致的細(xì)胞轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)(Douglas and Curiel, Science and Medicine, March/April 1997, pages 44-53 ； Zern and Kresinam，H印atology :25 (2)，484-491，1997)?？捎糜诰幋a尿激酶的代表性的腺病毒載體由 Stratford-Perricaudet 等(J. Clin. Invest. 90 :626_630，1992)，Graham 禾口 Prevec (In Methods in Molecular Biology :Gene Transfer and Expression Protocols 7 :109-128，1991)，以及 Barr 等(Gene Therapy, 2 151-155,1995)進(jìn)行了描述。提供了下面的實(shí)施例以說明某些具體特點(diǎn)和/或?qū)嵤┓桨?。這些實(shí)施例不應(yīng)該被解釋為將本發(fā)明局限于所描述的具體特點(diǎn)或?qū)嵤┓桨浮?shí)施例實(shí)施例1 :Fah"7Rag2+/112rg+ (FRG)小鼠的產(chǎn)生許多不同策略可以應(yīng)用于產(chǎn)生免疫缺陷小鼠，包括例如通過給予免疫抑制藥物或者通過引入一種或多種遺傳改變。該實(shí)施例描述遺傳改變的免疫缺陷小鼠的產(chǎn)生。為了產(chǎn)生完全缺乏T細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞、但是沒有DNA修復(fù)缺陷的免疫缺陷 Fah+小鼠品系，產(chǎn)生了 Fah"7Rag2+/I12rg+(FRG)小鼠。將雄性Fah+129S4小鼠(Grompe et al.，Genes Dev. 7 :2298_2307，1993)與雌性 Rag2+/I12rg+小鼠(Taconic)進(jìn)行雜交。 所有動(dòng)物都用含有濃度為1. 6mg/L的2- (2-硝基-4-三氟甲基-苯甲?；?_1，3環(huán)己二酮 (NTBC)的飲用水維持(Grompe et al. ,Nat. Genet. 70 =453-460,1995)。為了證實(shí)每只動(dòng)物的基因型，對(duì)從腳趾組織分離的200ng基因組DNA進(jìn)行了基于PCR的基因分型(Grompe et al.，Genes Dev. 7 :2298_2307，1993 ；Traggiai et al.，Science 304 104—107，2004)。FRG小鼠，如果在它們的飲用水中持續(xù)提供NTBC，能夠生長(zhǎng)良好并完全可育。肉眼觀察FRG小鼠的肝臟在尺寸和形狀上是正常的，組織學(xué)檢查顯示出常規(guī)Fah+小鼠與FRG小鼠之間沒有差異。與常規(guī)Fah+小鼠相同，NTBC撤銷在FRG小鼠中導(dǎo)致了逐漸的肝細(xì)胞損傷，并最終在 4-8 周后死亡(Overturf et al.，Nat. Genet. 12 :266_273，1996)。實(shí)施例2 組織學(xué)和移入檢測(cè)分析組織學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)FAH免疫組織化學(xué)按照以前的描述進(jìn)行(Wang et al.，Am. J. Pathol. 161 565-574,2002)。簡(jiǎn)單來說，將固定在pH 7. 4的10%磷酸鹽緩沖的福爾馬林中的肝臟和腎臟組織，在100%乙醇中脫水，并在58°C下包埋在石蠟中。將去石蠟的4μπι切片用蘇木精和曙紅染色。對(duì)于免疫組織化學(xué)來說，將切片用3% H2O2的甲醇溶液進(jìn)行處理，用于阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。在用第一抗體孵育之前，也進(jìn)行了親和素和生物素阻斷。將切片用抗FAH 兔抗體或IfepPar抗體(DAKO)在室溫孵育2小時(shí)。然后用HRP綴合的第二抗體孵育。信號(hào)通過二氨基聯(lián)苯胺(DAB)檢測(cè)。FAH酶測(cè)定法將延胡索酰乙酰乙酸用來自受體肝臟的胞質(zhì)肝級(jí)分孵育，消失速度 (disappearance speed)是在330nm處通過分光光度法測(cè)量。野生型和Fah+肝臟被分別用作陽性和陰性對(duì)照。延胡索酰乙酰乙酸是通過酶法從尿黑酸制備(Knox et al. ,Methods Enzymo1. 2 :287_300，1955)。Alu序列的基因組PCR基因組DNA使用DNeasy組織試劑盒(Qiagen)從肝分離。人Alu序列按照標(biāo)準(zhǔn)程序，使用下列引物通過PCR擴(kuò)增5' -GGCGCGGTGGCTCACG-3‘ (SEQ ID NO 1)和 5‘ -TTTT TTGAGACGGAGTCTCGCTC-3‘ (SEQ ID NO :2)。肝細(xì)胞特異性基因表達(dá)的RT-PCR總RNA是使用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)從肝分離?；パa(bǔ)DNA是通過反轉(zhuǎn)錄酶， 使用oligo-dT引物合成。表1中顯示的引物用于人或小鼠特異性cDNA擴(kuò)增。表1用于擴(kuò)增肝細(xì)胞特異性基因的RT-PCR引物
權(quán)利要求
1.一種體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法，包括將人肝細(xì)胞移植至免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，其中(i)所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者(ii)所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑；并且允許所述人肝細(xì)胞擴(kuò)增，從而擴(kuò)增所述人肝細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1的方法，其中允許所述人肝細(xì)胞擴(kuò)增至少約2周、至少約4周、至少約8 周、至少約12周、至少約16周、至少約20周、至少約M周或至少約28周。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠在所述Fah基因中包含純合中斷，使得所述中斷導(dǎo)致功能性FAH蛋白表達(dá)的喪失。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述中斷包括在所述Fah基因中的插入、缺失或者一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述中斷包括所述Fah基因中的缺失。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠缺乏功能性T 細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)的方法，其中所述小鼠的免疫缺陷是由遺傳改變、免疫抑制或者它們的組合引起的。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述小鼠的免疫缺陷是由于遺傳改變引起的，并且其中所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠包含選自如下的遺傳改變重組酶活化基因I(Ragl)缺陷、重組酶活化基因2(Rag2)缺陷、白細(xì)胞介素-2受體、鏈(I12rg)缺陷、SCID突變、非肥胖性糖尿病(NOD)基因型、裸小鼠突變和它們的組合。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述小鼠為Fah+/Rag2+/I12rg+小鼠、Fah+/Raglv7 I12rg+ 小鼠、^0/1^1^71^^2+/112^+ 小鼠或 NOD/Fah+ZRagr^/IUrg+ 小鼠。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述小鼠為Fah+/Rag2+/I12rg+小鼠。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述免疫缺陷是由于免疫抑制引起的，所述小鼠被給予一種或多種免疫抑制劑以誘導(dǎo)所述免疫缺陷。
12.權(quán)利要求11的方法，其中所述一種或多種免疫抑制劑選自Π(506、環(huán)孢菌素A、氟達(dá)拉濱、麥考酚酯、潑尼松、雷帕霉素和硫唑嘌呤以及它們的結(jié)合物。
13.權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)的方法，其中所述小鼠有IL-IR表達(dá)缺陷。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述小鼠是對(duì)Illrl基因中斷純合的，使得所述中斷導(dǎo)致功能性IL-IR蛋白表達(dá)的喪失。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述中斷包括所述Illrl基因中的插入、缺失或者一個(gè)或多個(gè)點(diǎn)突變。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述小鼠為Fah"7Rag2"7ll2rg+/Illrl+小鼠、Fah+/ Ragr7VI^rgvVll Ir小鼠、NOD/Fahi/RagZ^/IUrg^/IllrrA 小鼠或 NOD/Fah+/ Ragr7VI^rgvVIlIr小鼠。
17.權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的方法，其中所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述IL-IR拮抗劑為阿那白滯素。
19.權(quán)利要求18的方法，其中阿那白滯素以每天約0.2至約6mg的劑量給藥。
20.權(quán)利要求18或19的方法，其中阿那白滯素被給藥約5至約10天。
21.權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述小鼠在進(jìn)行肝細(xì)胞移植前被給予2- (2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3環(huán)己二酮(NTBC)。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述NTBC以約0.05mg/kg/天至約2. Omg/kg/天的劑量給藥。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述NTBC在飲用水中給藥。
24.權(quán)利要求23的方法，其中在進(jìn)行肝細(xì)胞移植前在飲用水中給藥的NTBC濃度是約1 至約8mg/L。
25.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述NTBC在食物中給藥。
26.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述NTBC通過注射給藥。
27.權(quán)利要求116中任一項(xiàng)的方法，其中在移植所述人肝細(xì)胞前向所述小鼠給予編碼人尿激酶的載體。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述載體被靜脈內(nèi)給予。
29.權(quán)利要求27或觀的方法，其中在進(jìn)行肝細(xì)胞移植前約M-48小時(shí)給予所述載體。
30.權(quán)利要求1- 中任一項(xiàng)的方法，其中移植所述人肝細(xì)胞包括將所述人肝細(xì)胞注射至所述小鼠的脾臟或門靜脈中。
31.權(quán)利要求1-30中任一項(xiàng)的方法，其中移植至所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中的人肝細(xì)胞是分離的人肝細(xì)胞。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述人肝細(xì)胞分離自器官供體的肝臟，分離自外科手術(shù)切除物或者源自干細(xì)胞、單核細(xì)胞或羊水細(xì)胞。
33.權(quán)利要求32的方法，其中在進(jìn)行注射之前所述肝細(xì)胞被冷凍保存。
34.權(quán)利要求1-33中任一項(xiàng)的方法，還包括從所述小鼠收集所述人肝細(xì)胞。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述人肝細(xì)胞收集自所述小鼠的肝臟。
36.權(quán)利要求34或35的方法，還包括通過連續(xù)移植擴(kuò)增所收集的人肝細(xì)胞。
37.權(quán)利要求1-36中任一項(xiàng)的方法，還包括從所述小鼠收集生物樣品。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述生物樣品為血液、尿、細(xì)胞或組織樣品。
39.一種選擇可有效用于治療人肝臟疾病的試劑的方法，包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑；并且( )評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟疾病的效果，其中所述肝臟疾病的一種或多種體征或癥狀的改善表示所述候選試劑可有效用于治療所述肝臟疾病。
40.權(quán)利要求39的方法，其中所述人肝臟疾病是人肝臟病原體感染，并且所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷且Fah 缺陷小鼠的移植人肝細(xì)胞被所述肝臟病原體感染；并且( )評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述肝臟感染的效果，其中與給予所述候選試劑之前所述 Fah缺陷小鼠中的感染負(fù)荷相比，所述肝臟病原體的感染負(fù)荷的降低表示所述候選試劑可有效用于治療所述肝臟病原體的感染。
41.權(quán)利要求40的方法，其中通過測(cè)量從所述小鼠獲得的樣品中的病原體滴度來確定所述感染負(fù)荷。
42.權(quán)利要求40的方法，其中通過測(cè)量從所述小鼠獲得的樣品中的病原體特異性抗原來確定所述感染負(fù)荷。
43.權(quán)利要求40的方法，其中通過測(cè)量從所述小鼠獲得的樣品中的病原體特異性核酸分子來確定所述感染負(fù)荷。
44.權(quán)利要求40-43中任一項(xiàng)的方法，其中所述肝臟病原體為嗜肝病毒。
45.權(quán)利要求44的方法，其中所述嗜肝病毒為HBV或HCV。
46.權(quán)利要求39的方法，其中所述人肝臟疾病為肝硬化，并且所述方法包括(i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷且Fah 缺陷的小鼠已被給予可誘導(dǎo)所述小鼠中發(fā)生肝硬化的化合物；并且( )評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷小鼠中肝硬化的至少一種診斷標(biāo)記物的效果，其中所述肝硬化的至少一種診斷標(biāo)記物選自AST、ALT、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白，并且其中與給予所述候選試劑之前的所述Fah缺陷小鼠相比，所述Fah缺陷小鼠中 AST、ALT、膽紅素或堿性磷酸酶的減少或白蛋白的增加表示所述候選試劑可有效用于治療肝硬化。
47.權(quán)利要求39的方法，其中所述人肝臟疾病為肝細(xì)胞癌(HCC)，并且所述方法包括 (i)將候選試劑給予移植有人肝細(xì)胞的所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑，并且其中所述免疫缺陷且Fah 缺陷的小鼠已被給予可誘導(dǎo)所述小鼠發(fā)生HCC的化合物或者已被移植惡性肝細(xì)胞；并且( )評(píng)估所述候選試劑對(duì)所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中HCC的效果，其中與給予所述候選試劑之前的所述小鼠相比，所述小鼠中腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤體積的減少表示所述候選試劑可有效用于治療HCC。
48.一種評(píng)估外源性試劑在體內(nèi)對(duì)人肝細(xì)胞效果的方法，包括(i)將所述外源性試劑給予移植有人肝細(xì)胞的免疫缺陷且Fah缺陷小鼠，其中所述小鼠還有IL-IR表達(dá)缺陷，或者所述小鼠被給予IL-IR拮抗劑；并且( )測(cè)量所述免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中肝功能的至少一種標(biāo)記物，其中所述肝功能的至少一種標(biāo)記物選自AST、ALT、膽紅素、堿性磷酸酶和白蛋白，并且其中與給予所述外源性試劑之前的所述小鼠相比，所述小鼠中AST、ALT、膽紅素或堿性磷酸酶的增加或白蛋白的減少表示所述外源性試劑有毒性。
49.權(quán)利要求48的方法，其中所述外源性試劑為已知的毒素或疑似的毒素。
全文摘要
本文描述了一種使用還有延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠，在體內(nèi)擴(kuò)增人肝細(xì)胞的方法。所述方法包括將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，將IL-1R拮抗劑給予所述小鼠，并允許所述肝細(xì)胞擴(kuò)增?；蛘?，所述方法包括將人肝細(xì)胞移植到免疫缺陷且Fah缺陷的小鼠中，其中所述小鼠還有IL-1R缺陷，并允許所述肝細(xì)胞擴(kuò)增。所述方法還允許將所述人肝細(xì)胞連續(xù)移植到第二級(jí)、第三級(jí)、第四級(jí)或其他小鼠中。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102460162SQ201080030136
公開日2012年5月16日 申請(qǐng)日期2010年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月1日
發(fā)明者H·蘭, M·葛洛佩 申請(qǐng)人:俄勒岡健康科學(xué)大學(xué)