專利名稱：用于分枝桿菌的增強的檢測的方法和培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及用于分枝桿菌的增強的檢測的培養(yǎng)基和方法。更具體地，本發(fā)明涉及針對用于改良或減少培養(yǎng)基中的分枝桿菌生長的檢出時間(TTD)的培養(yǎng)基和方法的各種改良。
背景技術(shù)：
分枝桿菌是細菌的一個屬，其特征為抗酸性的、非運動性的、革蘭氏陽性桿菌。 該屬包括許多種，包括非洲分枝桿菌(Mycobacterium africanum)、烏分枝桿菌(M. avium)、牛分枝桿菌(M. bovis)、牛分枝桿菌卡介苗(M. bovis-BCG)、龜分枝桿菌(M. chelonae)、偶發(fā)分枝桿菌(M.和rtuitum)、戈登分枝桿菌(M. gordonae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M. intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M. kansasii)、麻風分枝桿菌(M. leprae), 田鼠分枝桿菌(M. microti)、瘰疬分枝桿菌(M. scrofulaceum)、副結(jié)核分枝桿菌 (M. paratuberculosis)和結(jié)核分枝桿菌(M. tuberculosis)。分枝桿菌中的一些對于人和動物是致病的，尤其是結(jié)核分枝桿菌、麻風分枝桿菌和牛分枝桿菌。其他的分枝桿菌屬物種 (mycobacterial species)通常不是致病的，但在諸如AIDS患者的無免疫應(yīng)答的個體中導(dǎo)致機會感染。例如，在免疫系統(tǒng)受抑制或免疫系統(tǒng)受損的受試者中，堪薩斯分枝桿菌、烏分枝桿菌和胞內(nèi)分枝桿菌的感染可導(dǎo)致嚴重的肺病。事實上，自1953年首次報道后，所報道的分枝桿菌感染的病例在美國逐漸增加；這些病例中的許多與AIDS流行有關(guān)。在臨床物種中檢測分枝桿菌屬物種作為臨床診斷工具是重要的。歷史上，認為結(jié)核分枝桿菌是該屬中唯一的臨床上重要的病原體。結(jié)核分枝桿菌的藥物抗性菌株的發(fā)病率的增高已進一步地加強了檢測該物種的需求。結(jié)核病表現(xiàn)出全球流行病的所有主要特性。目前，世界范圍中超過三千五百萬的個體罹患結(jié)核病，并導(dǎo)致每年四百萬以上的死亡。 因此，結(jié)核病是全世界主要關(guān)心的問題。結(jié)核病可由結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌和田鼠分枝桿菌(分枝桿菌科的抗酸性的、革蘭氏陽性的結(jié)核桿菌)導(dǎo)致。在印度的馬德拉斯(Madras)和其他城市中還已從患者中分離了結(jié)核分枝桿菌的一些地方性致病菌株，其在某些方面不同于強毒株結(jié)核分枝桿菌H37Rv。然而，其他分枝桿菌屬物種在臨床上也是重要的。這些分枝桿菌屬物種有時被稱作“Μ0ΤΤ”，即非結(jié)核分枝桿菌，通常包括烏分枝桿菌/胞內(nèi)分枝桿菌復(fù)合物生物體(烏分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌，常稱作MAIC)、戈登分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌、產(chǎn)粘液分枝桿菌(M. mucogenicum)和臨床樣本中分枝桿菌屬物種的混合物。例如， 已顯示通過烏分枝桿菌復(fù)合物(MAC)細菌的快速生長機會感染頻繁發(fā)生于AIDS個體和其他的無免疫應(yīng)答的個體中。在此類感染的個體中，已發(fā)現(xiàn)每毫升痰沉淀物至少IO6MAC細胞。因此，可檢測許多分枝桿菌屬物種的檢測測定在臨床上是重要的。用于檢測和鑒定樣品中的分枝桿菌屬物種的許多臨床方法需要分析細菌的物理特性(例如，抗酸細菌染色法和桿菌的顯微鏡檢測)、生理特性(例如，在確定的培養(yǎng)基上的生長)或生化特性(例如，膜脂組成)。這些方法需要待檢測的樣品中相對高濃度的細菌， 根據(jù)臨床技術(shù)人員的經(jīng)驗和專業(yè)知識不同可能是主觀的，且是費時的。因為分枝桿菌屬物種通常難以在體外生長，且可能需要幾周來達到有用的培養(yǎng)密度，所以這些方法還可能導(dǎo)致延遲的患者治療和診斷完成之前與隔離感染的個體有關(guān)的花費。一般分枝桿菌是生長非常緩慢的苛求菌，尤其是結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。使這些生物體在常用的培養(yǎng)基上生長可能需要2至3周。已作出許多努力來尋找可增強生長并降低時間因素的培養(yǎng)基或物質(zhì)。例如，美國專利第3，935，073號，其通過引用并入本文，公開了用于培養(yǎng)分枝桿菌的生長培養(yǎng)基，其含有指定水平的以下營養(yǎng)物7H9肉湯基質(zhì) 0. 47% (含有獲自 Cockeysville, Maryland 的 BBL Microbiology Systems 的磷酸鉀和磷酸鈉、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨、吡哆素、檸檬酸鐵銨、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、生物素和氯化鈣)、牛血清白蛋白0. 5%、酪蛋白水解物0. 1%、過氧化氫酶96單位/小瓶、14C標記的底物2uCi/小瓶，去離子水平衡至anl，最終pH 6. 8 士0. 1。白蛋白可用作用于分枝桿菌的生長的培養(yǎng)基中的解毒劑。白蛋白是發(fā)現(xiàn)于幾乎每種動物中和許多植物組織中的單純蛋白質(zhì)。白蛋白的特征是在水中是可溶的并通過加熱可凝固。它們含有碳、氫、氮、氧和硫。對于本發(fā)明的生長培養(yǎng)基，優(yōu)選的白蛋白是牛血清白蛋白。白蛋白通常以按重量計約0. 至按重量計約10%的水平存在于生長培養(yǎng)基中。然而，因為緩慢的生長速率和對用于培養(yǎng)中分枝桿菌生長的富集培養(yǎng)基的需求， 從臨床樣品(例如，痰、肺液、組織或排泄物)中檢測分枝桿菌仍代表著重要的生物學(xué)挑戰(zhàn)。 該挑戰(zhàn)中的一個因素起因于以下事實更快速地生長的細菌可能過度生長而抑制感興趣的緩慢生長的分枝桿菌生物體，因此阻止了或顯著阻礙了分枝桿菌檢測。數(shù)十年以來，已開發(fā)了一些技術(shù)來使提交分枝桿菌鑒定的診斷樣品脫去雜質(zhì)(即，殺滅或抑制非分枝桿菌生物體)。這些技術(shù)殺滅可能的污染物或?qū)⑵鋼p害至其生長受到抑制或完全阻止的程度。常規(guī)地，分枝桿菌的實驗室診斷基于抗酸細菌染色法和生物體的培養(yǎng)，然后進行生化測定。由于分枝桿菌的緩慢生長和長的增代時間，通過常規(guī)技術(shù)對分枝桿菌進行精確的實驗室診斷可能需要長達6周。諸如BacT/ALERT 系統(tǒng)(bioM6rieux，Inc.)的自動化培養(yǎng)系統(tǒng)可以將鑒定分枝桿菌的時間減少長達兩周。本專利受讓人，bioMerieux, Inc.提供了在BacT/ ALERT 微生物檢測系統(tǒng)中用作其基于培養(yǎng)的系統(tǒng)的塑料BacT/ALERT MP培養(yǎng)瓶，以用于檢測除血液外的臨床樣品中的分枝桿菌。該BacT/ALERT 微生物檢測系統(tǒng)利用了比色傳感器和反射光以監(jiān)測溶解于培養(yǎng)基中的二氧化碳(CO2)的存在和產(chǎn)生。如果檢驗樣品中存在分枝桿菌，則二氧化碳隨微生物代謝培養(yǎng)基中的底物而產(chǎn)生。當分枝桿菌的生長產(chǎn)生(X)2時，安裝在每個培養(yǎng)瓶底部的透氣性傳感器的顏色從藍綠色變?yōu)辄S色。BacT/ ALERT MP試劑系統(tǒng)包括BacT/ ALERT MP培養(yǎng)瓶、重構(gòu)液體(RF)和 MB BacT抗生素補充物(MAS)(下文稱作常規(guī)或舊RF (或常規(guī)/舊RF)和常規(guī)或舊MAS (或常規(guī)/舊MAS))。BacT/ALERT MP培養(yǎng)瓶是含有培養(yǎng)基的一些組分的塑料瓶。重構(gòu)液體 (RF)含有用于分枝桿菌生長的其余營養(yǎng)物并用來重構(gòu)MAS。MAS是由阻抑來自痰樣品的不想要的呼吸道菌群的6種抗微生物劑組成的凍干的粉末。RF和MAS被包裝為MAS試劑盒。 盡管如此，本領(lǐng)域中仍存在進一步減少精確診斷分枝桿菌所需時間的需求。因此，本發(fā)明的主要目的是提供用于可能存在于臨床樣品中的分枝桿菌屬物種的增強的生長和檢測的培養(yǎng)基和方法。本發(fā)明的另一個目的是提供適用于體外培養(yǎng)分枝桿菌的新穎的分枝桿菌培養(yǎng)基。本發(fā)明的又一個目的是提供根據(jù)前述目的的分枝桿菌培養(yǎng)基， 其中抑制了污染生物體的生長。因此，我們在本文描述了新型培養(yǎng)基制品(formulation)、新型營養(yǎng)補充物(NS) 和新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品，和顯示分枝桿菌的生長和檢測的出人意料的增強的制造工藝改良。本文還描述了用于分枝桿菌的增強的生長和檢測的方法。發(fā)明概述本發(fā)明總體上涉及用于分枝桿菌的生長和檢測的新穎培養(yǎng)基。并且，本發(fā)明提供了檢測可能存在于臨床樣品中的廣譜的分枝桿菌屬物種的組合物和診斷方法。本發(fā)明還涉及顯示分枝桿菌生長和檢測的增強的檢出時間(TTD)的新型的和改良的MP系統(tǒng)或試劑盒， 所述MP系統(tǒng)或試劑盒包括可高壓滅菌的BacT/ALERT MP培養(yǎng)瓶、營養(yǎng)補充物(賂)和新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)。在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于培養(yǎng)分枝桿菌的新穎培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基包括(a)適合于分枝桿菌的生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；(b) —種或多種營養(yǎng)補充物添加劑；(c)以及改良的抗微生物補充物；并且其中所述培養(yǎng)基表現(xiàn)出所述分枝桿菌的增強的生長。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及用于分枝桿菌的增強的生長的方法，所述方法包括將懷疑含有分枝桿菌的樣品添加到含有有效量的一種或多種營養(yǎng)添加劑以增強所述分枝桿菌的生長的培養(yǎng)基中，和將所述培養(yǎng)基置于適宜于所述分枝桿菌的生長的條件下。本發(fā)明的另一個實施方案涉及用于診斷由分枝桿菌屬物種導(dǎo)致的感染的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供培養(yǎng)基；(b)將營養(yǎng)補充物添加到所述培養(yǎng)基中，所述營養(yǎng)補充物包括用于所述分枝桿菌的增強的生長的一種或多種營養(yǎng)添加劑；(c)添加待確定其中存在所述分枝桿菌屬物種或不存在所述分枝桿菌屬物種的樣品，和(d)分析培養(yǎng)物中分枝桿菌屬物種的存在，其中發(fā)現(xiàn)存在分枝桿菌屬物種表明所述感染的陽性診斷。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及改良的BacT/ ALERT MP試劑系統(tǒng)或試劑盒。 改良的BacT/ ALERT MP試劑系統(tǒng)或試劑盒將包括改良的MP培養(yǎng)瓶，所述改良的MP培養(yǎng)瓶包括用于分枝桿菌的生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基或水。任選地，新型MP培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基或水將不包括任何熱不穩(wěn)定組分，從而允許新型MP培養(yǎng)瓶可高壓滅菌。試劑系統(tǒng)或試劑盒還將包括新型營養(yǎng)補充物(賂)和新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ。營養(yǎng)補充物(賂)可包括用于分枝桿菌的生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基和/或一種或多種碳源、氮源、糖類、鹽類、營養(yǎng)物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸或其他營養(yǎng)物。附圖簡述圖IA——是顯示在具有脂肪酸補充和沒有脂肪酸補充時結(jié)核分枝桿菌的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖IB——是顯示在具有脂肪酸補充和沒有脂肪酸補充時胞內(nèi)分枝桿菌的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖IC——是顯示在具有脂肪酸補充和沒有脂肪酸補充時烏分枝桿菌的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖2——是顯示在具有α -酮戊二酸(a-ketoglutarate)和沒有α -酮戊二酸時分枝桿菌菌株的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖3——是顯示利用阿洛西林時分枝桿菌菌株的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖4——是顯示萬古霉素對分枝桿菌菌株生長的作用的箱線圖。圖5Α——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時結(jié)核分枝桿菌1擬83的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖5Β——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時結(jié)核分枝桿菌27四4的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖5C——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時烏分枝桿菌 569的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖5D——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時胞內(nèi)分枝桿菌13950的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖5Ε——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時瘰疬分枝桿菌19981的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖5F——是顯示利用不同的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ制品時堪薩斯分枝桿菌12478的檢出時間(TTD)的箱線圖。圖6——是顯示先前的MAS制品與新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)制品關(guān)于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合物生長的檢出時間(TTD)的比較的箱線圖。圖7——是顯示先前的MAS制品與新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)制品關(guān)于其他分枝桿菌菌株生長的檢出時間(TTD)的比較的箱線圖。發(fā)明詳述通過提供適當?shù)臓I養(yǎng)條件和環(huán)境條件來培養(yǎng)增殖的微生物是熟知的。適宜的生長培養(yǎng)基或培養(yǎng)基應(yīng)該含有待培養(yǎng)的微生物所需的所有營養(yǎng)物。例如，典型的微生物培養(yǎng)基應(yīng)該含有可獲得的水源、碳源、氮源、維生素、痕量元素諸如鉀、鎂、鈣和鐵，和礦物質(zhì)，比如硫和磷。通常，這些需求從許多來源來供給。用于適宜的增殖條件的其他因素可包括培養(yǎng)基的pH、溫度、通氣、鹽濃度和滲透壓。另外，已知可能需要某些生長因子。生長因子是微生物必須含有以進行生長但該微生物不能合成的有機化合物。當提供以上所列的營養(yǎng)物時，許多微生物能夠合成其原生質(zhì)的所有有機成分，包括氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他化合物。這些必需化合物中的每一種通過順序不相連的酶促反應(yīng)來合成，且每種酶在特定基因的控制下產(chǎn)生。然而，某些微生物不能合成這些生長因子中的一種或多種，且然后必須從環(huán)境中獲得該化合物。所需的生長因子可包括，但不限于，氨基酸、維生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他生長所需的化合物。如以上所討論的，本專利受讓人，bioMerieux, he.，生產(chǎn)并銷售用于分枝桿菌的生長和檢測的培養(yǎng)基瓶(BacT/ ALERT MP程序瓶(BacT/ ALERT MP Process Bottle))。BacT/ALERT MP程序瓶是為與 BacT/ALERT 或BacT/ALERT 3D 系統(tǒng)一起使用來用于從無菌機體樣本(sterile body specimens)和消化的-去除污染的臨床樣本(digested—decontaminated clinical specimens)中進 亍分枝桿菌的回收禾口檢測而設(shè)計的。MP程序瓶可與MB/BacT 抗微生物補充物(MAS)和/或MBBacT 重構(gòu)液體(RF) (本文中稱作常規(guī)或舊MAS和常規(guī)或舊RF) —起使用。BacT/ALERT MP —次性培養(yǎng)瓶具有可移出的蓋(removable closure)并含有約IOml的培養(yǎng)基和檢測作為微生物生長的指示物的二氧化碳的內(nèi)部傳感器。培養(yǎng)基制品包括凈化水中的Middlebrook 7H9肉湯(0. 47% w/v)、酪蛋白的胰腺消化物(pancreatic digest of casein) (0· w/v)、牛血清白蛋白(0· 5% w/v)，和過氧化氫酶(48u/ml)(本文中稱作常規(guī)或舊培養(yǎng)基)。常規(guī)或舊MB/BacT 抗微生物補充物(常規(guī)/舊MAS)是經(jīng)配制含有兩性霉素 Β(0· 0180% w/v)、阿洛西林(0. 0034% w/v)、萘啶酮酸(0. 0400% w/v)、多粘菌素 B (10，000 單位)、甲氧芐啶(0. 00105% w/v)，和萬古霉素(0. 0005% w/v)的凍干的補充物。常規(guī)/舊MB/ BacT 重構(gòu)液體(常規(guī)/舊RF)含有凈化水中的油酸(0. 05 % w/ ν)、甘油(5% w/v)、莧菜紅(0.004% )、和牛血清白蛋白(l%w/v)。重構(gòu)液體(RF)和MB BacT/ALERT 抗微生物補充物(MAS)構(gòu)成可添加到MP瓶中的補充物試劑盒。本發(fā)明涉及用于分枝桿菌的增強的生長的新型的和改良的培養(yǎng)基和方法。本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法可用于培養(yǎng)任何已知的分枝桿菌，包括但不限于，結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、非洲分枝桿菌、卡氏分枝桿菌(Mycobacterium canetti)、烏分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、瑪爾摩分枝桿菌(Mycobacterium malimoense)、蟾分枝桿菌(Mycobacterium xenopt)、海分枝桿菌(Mycobacterium marinum)、猿分枝桿菌(Mycobacterium simiae)、土地分枝桿菌(Mycobacterium terrae)、 饋痛分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus)、偶發(fā)分枝桿菌、龜分枝桿菌和戈登分枝桿菌。我們現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)新型的培養(yǎng)基制品、新型營養(yǎng)補充物(本文稱新型賂)和新型抗微生物補充物(本文稱新型MAQ制品，和在分枝桿菌的生長和檢測上表現(xiàn)出出人意料的增強的制造工藝改良。本發(fā)明的MP系統(tǒng)的新穎特征可包括(1)將熱不穩(wěn)定組分從MP培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到營養(yǎng)補充物，允許MP瓶的終末滅菌；( 使用新穎的碳源來優(yōu)化CO2產(chǎn)生；C3)營養(yǎng)補充物的優(yōu)化；和/或(4)MAS抗微生物劑和/或抗微生物劑的濃度的優(yōu)化。這些改良導(dǎo)致分枝桿菌的生長和檢測上的一些出人意料的改良，包括(I)MP瓶關(guān)于分枝桿菌生長的檢出時間(TTD)的改良的表現(xiàn)；( 臨床相關(guān)的分枝桿菌的提高的回收率；C3)污染性呼吸道菌群 (CRF)的突破的降低；和/或(4)假陽性的最小化。另外的改良包括制造工藝的簡化，從而 BacT/ ALERT MP瓶可在室溫下貯存和運輸。培養(yǎng)基在一個實施方案中，本發(fā)明的新穎培養(yǎng)基提供了分枝桿菌的增強的生長。如本文所用的，“增強的生長”意為利用本發(fā)明的培養(yǎng)基和/或補充物可比利用常規(guī)培養(yǎng)基早至少約0. 5天、至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約5天或至少約7天在例如培養(yǎng)瓶中檢測分枝桿菌生長。換言之，可增強分枝桿菌生長從而允許與常規(guī)培養(yǎng)基中的分枝桿菌的生長相比生長的檢出時間(TTD)的改良或減少。根據(jù)本發(fā)明，與常規(guī)培養(yǎng)基相比，利用本發(fā)明的培養(yǎng)基可改良或減少TTD至少約0. 5天、至少約1天、至少約2天、至少約3天、 至少約5天或至少約7天。在一個實施方案中，常規(guī)培養(yǎng)基可以是補充有如上文所描述的 BacT/ ALERT MP程序瓶(bi0M6rieux，Inc.)的常規(guī)/舊RF和常規(guī)/舊MAS的常規(guī)培養(yǎng)
8基。在另一個實施方案中，本發(fā)明的新穎培養(yǎng)基提供了分枝桿菌生長的滯后時間的減少。如本文所用的，“減少的滯后時間”意為分枝桿菌進入對數(shù)期生長之前的培養(yǎng)時間或潛伏時間的減少。根據(jù)本發(fā)明，當與常規(guī)/舊培養(yǎng)基中的分枝桿菌的滯后期相比較時，培養(yǎng)基和/或補充物導(dǎo)致滯后時間降低或減少至少約0. 5天、或至少約1天、或至少約2天、或至少約3天。在一個實施方案中，常規(guī)/舊培養(yǎng)基可以是補充有如上文所描述的BacT/ ALERT MP程序瓶(bi0M6rieux，Inc.)的常規(guī)/舊RF和常規(guī)/舊MAS的常規(guī)培養(yǎng)基。本發(fā)明的培養(yǎng)基包括液體營養(yǎng)培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯。本發(fā)明的培養(yǎng)基或營養(yǎng)肉湯通常包括一種或多種已知的營養(yǎng)物，例如，培養(yǎng)基可含有一種或多種碳源(例如，甘油)、氮源 (例如，銨鹽)、糖類、鹽類(例如，K+、Mg2+、Ca2+、Zn2+)、營養(yǎng)物、和/或水。在一個實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包括Middlebrook 7H9。如上文所討論的，Middlebrook 7H9包括鉀鹽、 鈉鹽、谷氨酸鈉、檸檬酸鈉、硫酸銨、吡哆素、檸檬酸鐵銨、硫酸鎂、硫酸鋅、硫酸銅、生物素和氯化鈣。本發(fā)明的培養(yǎng)基還可包括允許分枝桿菌生長的增強的檢測的另外的營養(yǎng)物和/ 或組分?？商砑拥奖景l(fā)明的培養(yǎng)基中的另外的營養(yǎng)物和/或組分包括，但不限于，蛋白質(zhì)、 氨基酸、脂肪酸、細胞或植物提取物和/或其他營養(yǎng)物。例如，本發(fā)明的培養(yǎng)基還可包括酪蛋白(例如，酪蛋白的胰腺消化物)、白蛋白(例如，牛血清白蛋白)、過氧化氫酶和/或莧菜紅。在一個實施方案中，如本文所進一步討論的，這些另外的營養(yǎng)物和/或組分可包括在用可能需要確定其中存在分枝桿菌或不存在分枝桿菌的樣品接種培養(yǎng)基之前可添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的單獨的營養(yǎng)補充物。根據(jù)本發(fā)明，我們已發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基瓶中與牛血清白蛋白(BSA)結(jié)合的高水平的短鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸(例如，具有約8個或更少碳原子的脂肪酸)可能導(dǎo)致假陽性讀數(shù)。 因此，避免使用短鏈脂肪酸或中鏈脂肪酸可能是優(yōu)選的。例如，根據(jù)本實施方案，應(yīng)避免使用具有8個或更少碳原子的脂肪酸(例如，辛酸)。然而，我們也已發(fā)現(xiàn)，通過使用無脂肪酸BSA和用長鏈脂肪酸補充培養(yǎng)基制品可消除或顯著減少這些試劑引起的假陽性。因此，培養(yǎng)基還可包括無脂肪酸BSA(無FA BSA) 和一種或多種飽和的或不飽和的長鏈脂肪酸，或其鹽類。在一個實施方案中，使用具有10 個或更多碳原子的一種或多種長鏈脂肪酸可能是優(yōu)選的。一般地說，可使用任何已知的長鏈脂肪酸，包括，但不限于，肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，和其鹽類。在另一個實施方案中，如本文所進一步討論的，我們已發(fā)現(xiàn)可將脂肪酸從瓶的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到在利用檢驗樣品接種之前可單獨地添加到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)補充物。如本文所示(參見，例如，實施例 1和

圖1A-1C)，無脂肪酸BSA的使用和用長鏈脂肪酸補充培養(yǎng)基導(dǎo)致了結(jié)核分枝桿菌(參見圖1A)、胞內(nèi)分枝桿菌(參見圖1B)和烏分枝桿菌(參見圖1C)的生長和檢測的檢出時間 (TTD) 2至2. 5天的改良。在本發(fā)明的一方面，可利用一種或多種已知的代謝途徑底物或中間產(chǎn)物來補充本發(fā)明的培養(yǎng)基。我們令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過在培養(yǎng)基中包括代謝途徑底物(例如，α-酮戊二酸)，與不含代謝途徑底物(例如，α-酮戊二酸)的培養(yǎng)基相比可增強分枝桿菌的生長和檢測。雖然不希望被理論所束縛，相信在培養(yǎng)基中使用代謝途徑底物(例如，α-酮戊二酸)可增強由存在于培養(yǎng)基中的分枝桿菌產(chǎn)生的C02。根據(jù)本實施方案，可使用檸檬酸循環(huán)、糖酵解或乙醛酸支路中的底物或中間產(chǎn)物。在一個實施方案中，產(chǎn)生(X)2的酶 (C02-producing enzymes)的底物或輔因子、或其中間產(chǎn)物、前體或衍生物可用于本發(fā)明中。例如，檸檬酸循環(huán)中間產(chǎn)物，比如，丙酮酸(pyruvate)、檸檬酸(citrate)、順烏頭酸 (cis-aconitate)、異檸檬酸(isocitrate)、草酰琥珀酸(oxalosuccinate)、α-酮戊二酸、琥珀酰輔酶Α、琥珀酸(succinate)、延胡索酸(fumarate)、蘋果酸(malate)、草酰乙酸 (oxaloacetate)可能是有用的。在另一個實施方案中，α -酮戊二酸、α -酮戊二酸前體、 和/或α-酮戊二酸衍生物中的一種或多種可被包括于本發(fā)明的培養(yǎng)基中。α-酮戊二酸前體或衍生物可包括，但不限于，谷氨酸(glutamate)、異檸檬酸、草酰琥珀酸、或其混合物。 α -酮戊二酸、α -酮戊二酸前體、和/或α -酮戊二酸衍生物能夠以從約0. lg/L至約50g/ L的終濃度、從約0. 5g/L至約20g/L的終濃度、從約lg/L至約20g/L的終濃度存在于培養(yǎng)基中。在一個實施方案中，如本文所進一步討論的，α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體、和/ 或α-酮戊二酸衍生物可被包括在可單獨地添加到培養(yǎng)基中的營養(yǎng)補充物中。在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明的培養(yǎng)基還可包括一種或多種抗微生物劑或抗微生物物質(zhì)?？刮⑸飫┦菤纭⒆枰只蛞云渌绞揭种莆⑸锏纳L的劑或物質(zhì)。一般地說， 可使用任何已知的抗微生物劑，比如，殺滅、阻抑或減緩微生物的生長的藥物、化學(xué)品或其他物質(zhì)。有用的抗微生物劑包括，但不限于，抗生素、制菌劑、殺菌劑、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑和抗寄生蟲劑。一般地說，抗微生物劑以足以殺滅、阻抑或抑制可能存在于培養(yǎng)基中的污染性細菌的生長的量來使用。例如，如本領(lǐng)域中的技術(shù)人員將理解地， 抑制培養(yǎng)基中污染性呼吸道菌群(CRF)的生長可能是優(yōu)選的。CRF可干擾分枝桿菌的生長，消耗用于分枝桿菌生長的必需營養(yǎng)物和/或?qū)е录訇栃?。污染性呼吸道菌?CRF)可包括，但不限于，銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)、白色念珠菌 (C. albicans)、糞腸球菌(E. faecalis)、肺炎克雷伯氏菌(K. pnuemoniae)、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌(S. maltophilia)、熱帶念珠菌(C. tropicalis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(即， MRSA)、耐萬古霉素糞腸球菌(即，VRE)。抗微生物劑可以是一種或多種抗生素或合成藥物，包括但不限于，多粘菌素B、萬古霉素、阿洛西林、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素。在一個優(yōu)選的實施方案中，有用的抗生素抑制污染性呼吸道菌群(CRF)而不阻抑或抑制分枝桿菌生長。在一些實施方案中，抗微生物補充物包括一種或多種抗真菌抗生素、革蘭氏陰性菌抗生素、革蘭氏陽性菌抗生素、抗真菌抗生素和廣譜抗生素。例如，本發(fā)明的抗微生物補充物可包括，抗真菌劑(例如，兩性霉素B)、改變細胞質(zhì)膜通透性的革蘭氏陰性菌抗生素 (例如，多粘菌素B)、抑制DNA促旋酶的廣譜抗生素(例如，萘啶酮酸)、化療劑(例如，抑制二氫葉酸還原酶的劑(例如，甲氧芐啶))和抑制烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移酶的廣譜抗生素(例如，磷霉素)。一般地說，任何已知的抗真菌劑、革蘭氏陰性菌抗生素、廣譜抗生素、DNA促旋酶的抗生素抑制物、或化療劑可用于本發(fā)明的實踐中。在一個實施方案中，抗微生物補充物可包括兩性霉素B、多粘菌素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素。如本文所示(參見，例如，實施例3-4和圖3-4)，萬古霉素和/或阿洛西林的使用可阻抑、抑制或減緩一些分枝桿菌物種的生長。因此，在一些實施方案中，避免使用萬古霉素和/或阿洛西林可能是優(yōu)選的。我們已發(fā)現(xiàn)可使用磷霉素替代阿洛西林和萬古霉素以產(chǎn)生可用來(當與MB/BaeT 抗微生物補充物相比較時)增強培養(yǎng)中的分枝桿菌的生長和檢測的抗微生物補充物(MAQ。例如，通過用磷霉素來替代阿洛西林和萬古霉素，我們已發(fā)現(xiàn)當與常規(guī)/舊MAS比較時，新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)將分枝桿菌生長的檢出時間(TTD)改良或減少了 2至9天(參見，例如，實施例5和圖5A-5F)。因此，在一些實施方案中，多粘菌素B、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素的使用可以是優(yōu)選的。這些抗生素能夠以足以抑制可能存在于培養(yǎng)基中的污染性細菌的生長的量來使用。例如，培養(yǎng)基可含有終濃度從約400單位/ml到約2000單位/ml的多粘菌素B、終濃度從約50 μ g/ml到約400 μ g/ml的兩性霉素B、終濃度從約100 μ g/ml到約1000 μ g/ml的萘啶酮酸、終濃度從約10 μ g/ml到約100 μ g/ml的甲氧芐啶和終濃度從約100 μ g/ml到約1000 μ g/ml的磷霉素。在一個實施方案中，如本文所進一步討論的，這些抗微生物劑可包括在用可能需要確定其中存在分枝桿菌或不存在分枝桿菌的樣品接種培養(yǎng)基之前可添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的單獨的補充物。根據(jù)本發(fā)明，在一個實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基可包括Middlebr00k7H9、牛血清白蛋白、α-酮戊二酸、酪蛋白、過氧化氫酶和/或水中的一種或多種。培養(yǎng)基還可包括本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的有利于培養(yǎng)分枝桿菌的一種或多種另外的營養(yǎng)物和/或組分。例如，本發(fā)明的培養(yǎng)基可另外包括一種或多種糖類或碳源、氮源、礦物質(zhì)、鹽類、氨基酸、 維生素、嘌呤和嘧啶、脂肪酸和其他化合物。在另一個實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包括 Middlebrook 7Η9、甘油、硬脂酸(例如，硬脂酸鈉)、肉豆蔻酸(或其鹽)、棕櫚酸(例如，棕櫚酸鈉)、油酸(例如，油酸鈉)、牛血清白蛋白、酪蛋白(例如，酪蛋白的胰腺消化物)、過氧化氫酶、丙酮酸鈉、α-酮戊二酸、莧菜紅和水。在另一個實施方案中，培養(yǎng)基還包括一種或多種抗微生物劑(例如，磷霉素)。例如，培養(yǎng)基還可包括選自多粘菌素B、阿洛西林、萬古霉素、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和/或磷霉素中的一種或多種的抗微生物劑的混合物。培養(yǎng)基還可包括含多粘菌素B、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素的抗生素的混合物。在又一個實施方案中，可將培養(yǎng)基調(diào)至從約5. 5至約7. 5的ρΗ、從約6. 0至約7. 0 的ΡΗ、從約6. 5至約7. 0的ρΗ。根據(jù)本發(fā)明，與常規(guī)/舊分枝桿菌培養(yǎng)基相比，培養(yǎng)基將分枝桿菌生長的檢出時間(TTD)改良或減少了至少約0.5天、至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約5天或至少約7天。用于分技桿菌的增強的檢測的方法一般地說，本發(fā)明還涉及用于檢測可能存在于生物樣品中的一種或多種分枝桿菌的生長的方法?？蓹z驗的樣品包括可能懷疑其中存在分枝桿菌的臨床樣品和非臨床樣品兩者。可檢驗的臨床樣品包括臨床實驗室中通常檢驗的任何樣品類型，包括但不限于，血液、 痰、吸出物、拭子和拭子漂洗物，其他的體液和類似的樣品。在一個實施方案中，樣品可以是無菌機體樣本或消化的-去除污染的臨床樣本?？蓹z驗的非臨床樣品還包括高度易變的物質(zhì)，包括但不限于，食品、飲料、藥物、化妝品、水、空氣、土壤、植物、血液產(chǎn)品(包括血小板)、供體器官或組織樣品，和類似的樣品。在一方面，本發(fā)明涉及用于分枝桿菌的增強的生長和/或檢測的方法，所述方法包括將懷疑含有分枝桿菌的樣品添加到含有包括α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或 α-酮戊二酸衍生物的有效量的添加劑以增強所述分枝桿菌的生長的培養(yǎng)基中，并將所述培養(yǎng)基置于適宜于所述分枝桿菌的生長的條件下。我們已出人意料地發(fā)現(xiàn)，通過在本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法中使用α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或α-酮戊二酸衍生物，可檢測的分枝桿菌生長的檢出時間(TTD)比使用常規(guī)/舊培養(yǎng)基(即，不具有α-酮戊二酸、 α -酮戊二酸前體和/或α -酮戊二酸衍生物的培養(yǎng)基)早至少約0. 5天、至少約1天、至少約2天、至少約3天、至少約5天、或至少約7天。如實施例2和圖2中所示，含有α -酮戊二酸的培養(yǎng)基中的分枝桿菌菌株的檢出時間(TTD)與不含α-酮戊二酸的培養(yǎng)基中的 TTD相比改良了或減少了約2天。本發(fā)明還涉及用于診斷由分枝桿菌屬物種導(dǎo)致的感染的方法，所述方法包括以下步驟(a)提供培養(yǎng)基；(b)將營養(yǎng)補充物添加到所述培養(yǎng)基中，所述營養(yǎng)補充物添加劑包括代謝途徑底物(例如，α -酮戊二酸、α -酮戊二酸前體和/或衍生物)；(C)添加待確定其中存在所述分枝桿菌屬物種或不存在所述分枝桿菌屬物種的樣品；和(d)分析所述培養(yǎng)物中所述分枝桿菌屬物種的存在，其中發(fā)現(xiàn)存在所述分枝桿菌屬物種表明所述感染的陽性診斷。如上文所討論的，本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法中α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或 α -酮戊二酸衍生物的使用可將TTD減少至少約0. 5天、至少約1天、至少約2天、至少約3 天、至少約5天、或至少約7天。根據(jù)該方法，營養(yǎng)補充物(NS)可任選地使用無脂肪酸BSA 且還包括一種或多種長鏈脂肪酸(例如，具有10個或更多個碳原子的脂肪酸)。我們已發(fā)現(xiàn)在NS中使用無脂肪酸BSA和一種或多種長鏈脂肪酸導(dǎo)致假陽性讀數(shù)的顯著減少。并且， 如本文所示(參見實施例1和圖1A-1C)，無脂肪酸BSA的使用和用長鏈脂肪酸補充培養(yǎng)基導(dǎo)致了結(jié)核分枝桿菌(參見圖1Α)、胞內(nèi)分枝桿菌(參見圖1Β)和烏分枝桿菌(參見圖1C) 的生長和檢測的檢出時間(TTD)2至2. 5天的改良。在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及抑制分枝桿菌培養(yǎng)物中的細菌污染的方法，所述方法包括在含足以抑制污染性細菌的生長的量的磷霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)懷疑含有分枝桿菌的樣品，所述培養(yǎng)在適宜于所述分枝桿菌的生長的條件下進行。根據(jù)該方法，在利用待檢驗的生物樣品接種培養(yǎng)基之前、或與利用待檢驗的生物樣品接種培養(yǎng)基同時，可將一種或多種抗微生物劑或抗微生物物質(zhì)添加到培養(yǎng)基中。隨后，可將培養(yǎng)基和樣品培養(yǎng)足夠的時間，并處于允許可能存在于檢驗樣品中的任何分枝桿菌的生長和檢測的充足的溫度下。 在另一個實施方案中，一種或多種抗微生物劑可被包括在分枝桿菌抗微生物補充物(MAS) 中，所述分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ可在利用待檢驗的樣品接種培養(yǎng)基之前、或與利用待檢驗的樣品接種培養(yǎng)基同時加入到可添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。如上文所描述的，MAS可包括一種或多種多粘菌素B、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素。在又一個實施方案中，本發(fā)明涉及應(yīng)用改良的BacT/ALERT MP試劑系統(tǒng)或試劑盒用于可能存在于生物樣品中的分枝桿菌的生長和/或檢測的用途的方法。根據(jù)該實施方案，如本文所進一步詳細描述的，改良的BacT/ alert MP試劑系統(tǒng)將包括改良的MP培養(yǎng)瓶，所述改良的MP培養(yǎng)瓶包括用于分枝桿菌生長的基礎(chǔ)培養(yǎng)基、新型營養(yǎng)補充物(NS)和新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ。在利用待檢驗存在分枝桿菌的生物樣品接種培養(yǎng)基之前、或與利用待檢驗存在分枝桿菌的生物樣品接種培養(yǎng)基同時，可將營養(yǎng)補充物(NS)和 /或分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)添加到瓶的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中。接種的瓶將培養(yǎng)足夠的時間并處于允許可能存在于生物樣品中的任何分枝桿菌的生長和/或檢測的充足的溫度下。 在一個實施方案中，新型MP培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基將不包括任何熱不穩(wěn)定組分，從而允許新型培養(yǎng)瓶可高壓滅菌。
MP試劑盒在一方面，本發(fā)明涉及用于分枝桿菌的增強的生長和檢測的MP試劑盒。MP試劑盒將包括培養(yǎng)瓶，所述培養(yǎng)瓶具有基礎(chǔ)分枝桿菌培養(yǎng)基、營養(yǎng)補充物(賂)、和/或分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)。培養(yǎng)瓶在一個實施方案中，本發(fā)明涉及含有新型和改良的分枝桿菌培養(yǎng)基的瓶或容器 (即，培養(yǎng)瓶)。一般地說，培養(yǎng)瓶可具有本領(lǐng)域中已知的任何設(shè)計或尺寸，且可包括有利于分枝桿菌的生長和/或檢測的任何已知的培養(yǎng)基。在一個實施方案中，培養(yǎng)瓶包括作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的Middlebrook 7H9肉湯和/或水。常規(guī)/舊MP瓶使用了 pH約6. 8的液體培養(yǎng)基以用于分枝桿菌的生長和檢測。同樣地，新型和改良的MP培養(yǎng)瓶將具有其中可添加新型營養(yǎng)補充物和/或新型分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ的液體基礎(chǔ)培養(yǎng)基或肉湯基礎(chǔ)培養(yǎng)基?？蓪⑴囵B(yǎng)基調(diào)至從約5. 5至約7. 5的pH、從約6. O至約7. O的pH、或從約6. 5至約7. O 的pH。在另一個實施方案中，MP培養(yǎng)瓶培養(yǎng)基將具有約6. 8的pH。我們已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，通過從培養(yǎng)基瓶中去除某些生長營養(yǎng)物，包括例如牛血清白蛋白、牛肝過氧化氫酶和/或酪蛋白，瓶可被終末滅菌。例如，通過去除熱不穩(wěn)定組分可對瓶進行高壓滅菌。與瓶的終末滅菌有關(guān)的改良包括改良的貯存和運輸。例如，可在室溫下貯存和運輸終末滅菌的瓶(例如，高壓滅菌過的瓶)，導(dǎo)致可觀的成本減少。終末滅菌的瓶還可進一步導(dǎo)致提高的貯藏壽命和/或提高的滅菌水平(SAL)。營養(yǎng)補充物(NS)本發(fā)明還涉及可添加到本發(fā)明的培養(yǎng)瓶中以增強分枝桿菌的生長和檢測的改良的營養(yǎng)補充物(賂)。一般地說，在利用需要檢測其中存在分枝桿菌的樣品接種瓶和培養(yǎng)基之前，可將營養(yǎng)補充物(賂)添加到含基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中以用于分枝桿菌生長。本發(fā)明的改良的營養(yǎng)補充物(NS)可包括有利于分枝桿菌的生長的任何已知的營養(yǎng)物或補充物。例如，營養(yǎng)補充物可包括一種或多種碳源、氮源、糖類、鹽類、營養(yǎng)物、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸和/或本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知的其他營養(yǎng)物。根據(jù)本發(fā)明，在一個實施方案中，營養(yǎng)補充物還可包括α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或α-酮戊二酸衍生物。一般地說，可使用任何已知的α-酮戊二酸前體或衍生物，包括但不限于，谷氨酸、異檸檬酸、草酰琥珀酸、或其混合物。α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或α-酮戊二酸衍生物能夠以足夠的量存在于營養(yǎng)補充物中以使α-酮戊二酸、α-酮戊二酸前體和/或α-酮戊二酸衍生物添加到培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)基之后的終濃度為從約0. lg/L到約50g/L。根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案，營養(yǎng)補充物還可包括一種或多種飽和的或不飽和的長鏈脂肪酸，或其鹽類。在一個實施方案中，利用一種或多種具有10個或更多個碳原子的長鏈脂肪酸可能是優(yōu)選的。一般地說，可使用任何已知的長鏈脂肪酸，包括但不限于，肉豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸，和其鹽類。在另一個實施方案中，避免使用短鏈脂肪酸或中鏈脂肪酸可能是優(yōu)選的。例如，根據(jù)該實施方案，應(yīng)該避免使用具有8個或更少碳原子的脂肪酸(例如，辛酸)。在另一方面，如上文所述，在本發(fā)明的營養(yǎng)補充物中使用無脂肪酸牛血清白蛋白 (BSA)可能是優(yōu)選的。如先前所述，無脂肪酸BSA的使用可顯著地減少或消除基于試劑的假陽性。在一個實施方案中，營養(yǎng)補充物(賂)包括乙二醇、一種或多種長鏈脂肪酸、無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白的胰腺消化物、丙酮酸鈉、莧菜紅和α-酮戊二酸。可將營養(yǎng)補充物與基礎(chǔ)培養(yǎng)基一起添加到培養(yǎng)瓶中，或可在利用檢驗樣品接種之前將營養(yǎng)補充物添加到培養(yǎng)瓶中?？蛇x地，營養(yǎng)補充物可用來重懸分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ且然后添加到培養(yǎng)基瓶中。分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)本發(fā)明還涉及可添加到本發(fā)明的培養(yǎng)瓶中以增強分枝桿菌的生長和檢測的改良的分枝桿菌抗微生物補充物(MA 。我們已開發(fā)了增強培養(yǎng)中的分枝桿菌生長的改良的分枝桿菌抗微生物補充物(MAS)。改良的MAS有效阻抑或抑制污染性呼吸道菌群(CRF)的生長而不阻抑或抑制分枝桿菌生長。污染性呼吸道菌群(CRF)可包括，但不限于，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜麥芽糖寡養(yǎng)單胞菌、熱帶念珠菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)，耐萬古霉素糞腸球菌(VRE)。在一個實施方案中，在利用需要檢測分枝桿菌的存在的樣品接種瓶和培養(yǎng)基之前，可將分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ直接添加到包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中以用于分枝桿菌生長。在另一個實施方案中，可在將營養(yǎng)補充物(賂)添加到培養(yǎng)基瓶之前，使用營養(yǎng)物培養(yǎng)物(賂)來重懸抗微生物補充物(MAS)。一般地說，可使用任何已知的抗微生物劑或抗微生物物質(zhì)，包括但不限于，抗生素、制菌劑、殺菌劑、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑和/或抗寄生蟲劑。然而， 優(yōu)選的抗微生物劑包括阻抑或抑制污染性呼吸道菌群(CRF)的生長而不阻抑或抑制分枝桿菌的生長的任何抗微生物劑。在一個實施方案中，MAS包括足以抑制所述培養(yǎng)基中的細菌污染的量的一種或多種抗微生物劑。在另一個實施方案中，本發(fā)明的培養(yǎng)基包括一種或多種抗生素。有用的抗生素包括，例如，阻抑或抑制CRF生長的抗生素，包括但不限于，多粘菌素B(P0LY B)、萬古霉素(VAN)、阿洛西林(AZL)、兩性霉素B (AMP B)、萘啶酮酸(NA)、甲氧芐啶(TMP)和磷霉素 (FOS)。用來治療分枝桿菌感染和可能殺滅、阻抑或抑制分枝桿菌生長的抗生素不用于本發(fā)明的抗生素補充物中，且包括，例如，異煙胼、利福平、吡嗪酰胺、鏈霉素和乙胺丁醇。如上文先前所討論的，本專利受讓人銷售和出售MB/BaeT 抗微生物補充物，其是凍干的補充物， 經(jīng)配制含有兩性霉素B(0. 0180% w/v)、阿洛西林(0. 0034% w/v)、萘啶酮酸(0. 0400% w/ ν)、多粘菌素B (10，000單位)、甲氧芐啶(0. 00105% w/v)，和萬古霉素(0. 0005% w/v)。然而，我們現(xiàn)已出人意料地發(fā)現(xiàn)，可用磷霉素補充阿洛西林和萬古霉素以產(chǎn)生可用于培養(yǎng)中的分枝桿菌(當與常規(guī)/舊MB/BaeT 抗微生物補充物相比時)增強的生長和檢測的抗微生物補充物(MAS)。因此，在一個實施方案中，改良的分枝桿菌抗微生物補充物(MAQ包括經(jīng)配制含有兩性霉素B(AMP B)、多粘菌素B(P0LY B)、甲氧芐啶(TMP)、萘啶酮酸(NA)和磷霉素(FOS) 的凍干的補充物?？膳渲品种U菌抗微生物補充物(MAQ而使最終培養(yǎng)基將含有終濃度從約400單位/ml到約2000單位/ml的多粘菌素B、終濃度從約50 μ g/ml到約400 μ g/ml的兩性霉素B、終濃度從約100 μ g/ml到約800 μ g/ml的萘啶酮酸、終濃度從約10 μ g/ml到約 100 μ g/ml的甲氧芐啶和終濃度從約100 μ g/ml到約1000 μ g/ml的磷霉素。
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在另一個實施方案中，營養(yǎng)補充物(賂)和抗微生物補充物(MAQ可形成單獨的試劑盒，且然后可將所述單獨的試劑盒添加到經(jīng)終末滅菌的培養(yǎng)基瓶中。在該實施方案中， NS/MAS試劑盒可作為BacT/ALERT MP瓶的添加劑來單獨地銷售和出售。給出了以下的實施例來進一步地示出本發(fā)明的特征，但并不意在以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
實施例實施例1.具有脂肪酸補充和沒有脂肪酸補充時不同的分枝桿菌菌株的TTD為評估長鏈脂肪酸(FA)對分枝桿菌生長的作用，選擇了來自Proliant，Inc. (Ames, Iowa)的無脂肪酸(FAF) BSA?；谥舅嶙V和生長表現(xiàn)將5種長鏈脂肪酸肉豆蔻酸(C14 0)、棕櫚酸(C16 0)、硬脂酸(C18 0)、油酸(C18 1)和亞油酸(C18 2) 鑒定為可能的脂肪酸補充物。制備了具有FAF BSA的新型補充物制品，并在具有5種脂肪酸和沒有5種脂肪酸時對其進行檢驗(關(guān)于新型補充物制品參見表1)。脂肪酸補充靶水平以獲自先前評估的脂肪酸含量為基礎(chǔ)。使用的FAF BSA濃度為10g/L。通過脂肪酸甲酯 (FAME)分析確定了新型補充物過濾過程中脂肪酸的損失。在用0. 45 μ m濾器過濾之后觀察的脂肪酸的回收率為> 80%。對該制品的分析證明，較高水平的BSA通過BSA-脂肪酸結(jié)合增強了脂肪酸溶解和穩(wěn)定性(數(shù)據(jù)未示出)。該分析還證明BSA含量越低，脂肪酸結(jié)合越少，導(dǎo)致過濾過程中更多的脂肪酸損失。通過將存在于常規(guī)瓶或舊瓶中的培養(yǎng)基的熱不穩(wěn)定組分轉(zhuǎn)移到常規(guī)/舊RF中而設(shè)計了新型可高壓滅菌的培養(yǎng)瓶。該新型可高壓滅菌的培養(yǎng)瓶包括Middlebrook 7H9。利用常規(guī)或舊RF(但經(jīng)更改以適合從舊MP瓶制品中轉(zhuǎn)移的熱不穩(wěn)定組分)的組合物制備了新型RF補充物。以下表1顯示了新型可高壓滅菌的MP瓶(如上文所描述的)和新型補充物的組成。用于該新型補充物中的BSA是無脂肪酸(FAF)BSA(Proliant Inc. ,Ames, Iowa) 而不是用于常規(guī)/舊RF中的常規(guī)BSA。表1——新型MP瓶和新型補充物制品
權(quán)利要求
1.一種用于分枝桿菌的增強的生長的方法，所述方法包括將懷疑含有分枝桿菌的樣品添加到含有有效量的包括α -酮戊二酸的添加劑的培養(yǎng)基中，和將所述培養(yǎng)基置于適宜于所述分枝桿菌的生長的條件下，其中所述添加劑增強了所述分枝桿菌的生長。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述增強的生長包括將分枝桿菌生長的檢出時間減少至少約2天。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述增強的生長包括將分枝桿菌生長的滯后期減少至少約1天。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基處于約5.5至約7. 5之間的ρΗ。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基含有約0.lg/L至約50g/L的所述α-酮戊二酸。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包括抗微生物補充物，并且其中所述抗微生物補充物包括足以抑制所述培養(yǎng)基中的細菌污染、酵母污染或真菌污染的量的一種或多種抗微生物劑。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一種或多種抗微生物物質(zhì)選自由抗生素、制菌齊U、殺菌劑、抗菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗原生動物劑和抗寄生蟲劑組成的組。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述一種或多種抗微生物劑包括一種或多種抗生素，并且其中所述一種或多種抗生素選自由多粘菌素B、萬古霉素、阿洛西林、兩性霉素B、 萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素組成的組。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗微生物補充物包括多粘菌素B、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素。
10.如權(quán)利要求6所述的方法，其中所述抗微生物補充物包括磷霉素。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其中所述磷霉素以約ΙΟΟμg/ml至約ΙΟΟΟμ g/ml存在于所述培養(yǎng)基中。
12.一種用于診斷由分枝桿菌屬物種導(dǎo)致的感染的方法，所述方法包括如下步驟(a) 提供培養(yǎng)基；(b)將營養(yǎng)補充物添加到所述培養(yǎng)基中，所述營養(yǎng)補充物添加劑包括α-酮戊二酸；(c)添加待確定其中存在所述分枝桿菌屬物種或不存在所述分枝桿菌屬物種的樣品；和(d)分析所述培養(yǎng)物中所述分枝桿菌屬物種的存在，其中發(fā)現(xiàn)存在所述分枝桿菌屬物種表明所述感染的陽性診斷。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基和營養(yǎng)補充物將分枝桿菌生長的檢出時間減少了至少約2天。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基和營養(yǎng)補充物將分枝桿菌生長的滯后期減少了至少約1天。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其中在步驟(d)之前將所述培養(yǎng)基、營養(yǎng)補充物和樣品置于適宜于所述分枝桿菌的生長的條件下。
16.如權(quán)利要求12所述的培養(yǎng)基，其中所述培養(yǎng)基處于約5.5至約7. 5之間的ρΗ。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述樣品選自由血液樣品、血清樣品、血漿樣品、 血液級分樣品、唾液樣品、痰樣品、吸出物樣品和拭子樣品組成的組。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其中所述培養(yǎng)基還包括抗微生物補充物，并且其中在步驟(c)中添加所述樣品之前添加所述抗微生物補充物。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中利用所述營養(yǎng)補充物懸浮所述抗微生物補充物并且將所述營養(yǎng)補充物懸浮的抗微生物補充物在步驟(b)中添加到所述培養(yǎng)基中。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗微生物補充物包括選自由多粘菌素B、萬古霉素、阿洛西林、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素組成的組的一種或多種抗生素。
21.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗微生物補充物包括多粘菌素B、兩性霉素B、 萘啶酮酸、甲氧芐啶和磷霉素。
22.如權(quán)利要求19所述的方法，其中所述抗微生物補充物包括磷霉素。
23.一種用于檢測培養(yǎng)基中分枝桿菌的生長的試劑盒，所述試劑盒包括(1)含有基礎(chǔ)培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶；( 包括α -酮戊二酸的營養(yǎng)補充物；和C3)包括用于阻抑所述培養(yǎng)基中的污染性呼吸道菌群的生長的一種或多種抗微生物劑的抗微生物補充物。
24.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述增強的生長包括將分枝桿菌生長的檢出時間減少至少約2天。
25.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述增強的生長包括將分枝桿菌生長的滯后期減少至少約1天。
26.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是middlebr00k7H9。
27.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基不含熱不穩(wěn)定組分。
28.如權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述培養(yǎng)瓶和所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基通過高壓滅菌來滅菌。
29.如權(quán)利要求23所述的試劑盒，其中所述抗微生物補充物包括磷霉素。
30.如權(quán)利要求四所述的試劑盒，其中所述抗微生物補充物還包括選自由多粘菌素B、 萬古霉素、阿洛西林、兩性霉素B、萘啶酮酸和甲氧芐啶組成的組的一種或多種另外的抗生ο
31.如權(quán)利要求四所述的試劑盒，其中所述抗微生物補充物還包括多粘菌素B、萬古霉素、兩性霉素B、萘啶酮酸和甲氧芐啶。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于分枝桿菌(Mycobacterium)生長的增強的生長和檢測的改良的培養(yǎng)基和方法。本發(fā)明還涉及可用于分枝桿菌的增強的生長和檢測的改良的分枝桿菌試劑系統(tǒng)或試劑盒。
文檔編號C12N1/20GK102471756SQ201080030005
公開日2012年5月23日 申請日期2010年6月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月1日
發(fā)明者帕拉姆帕爾·多爾, 約安尼·波爾蒂拉, 萊蒂西亞·巴頓, 道格拉斯·勞沃恩 申請人:生物梅里埃有限公司