專利名稱：分枝桿菌干燥培養(yǎng)基及其生產方法
技術領域：
本發(fā)明分枝桿菌干燥培養(yǎng)基及其生產方法，涉及微生物存在測定的選擇性培養(yǎng)基。
結核病是一種存在于世界范圍發(fā)病率很高的傳染性疾病之一，雖是一種病因明確，治有辦法，防有措施的病種，但關鍵的問題仍是要早期發(fā)現，及時治療，才能無虞。因此，盡早鑒別和診斷是控制該病的首要步驟。
在傳統(tǒng)的X放射線放射診斷、OT試驗和細菌培養(yǎng)三大診斷結核病技術中，尤以細菌培養(yǎng)發(fā)現結核菌生長最為直接。而細菌培養(yǎng)檢測技術本身，需要解決的是優(yōu)質、價廉的分枝桿菌生長培養(yǎng)基的供應問題。目前，已有的培養(yǎng)基多數由于“原料來源困難”、“難以獲得純菌液”、“操作繁瑣”、“觀察不便”、“檢出陽性率低”等原因得不到推廣。以羅氏雞蛋基培養(yǎng)基和瓊脂培養(yǎng)基為代表的固體培養(yǎng)基，雖是當前分枝桿菌分離培養(yǎng)和藥敏檢測最主要的手段，但均有局限性。羅氏培養(yǎng)基、改良羅氏培養(yǎng)基、酸羅氏培養(yǎng)基、丙酮酸鈉培養(yǎng)基、小川氏培養(yǎng)基均為傳統(tǒng)以雞蛋為賦形劑和營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基，配制過程繁瑣，只能小量制備，質量差異大，易發(fā)生藥物加熱失效和蛋白質吸附消耗等缺陷，難以保證檢測的準確性，且需用血清凝固器等，不利于基層及非?？漆t(yī)院推廣應用;米氏培養(yǎng)基是以瓊脂為賦形劑的培養(yǎng)基，由于需牛血清白蛋白第Ⅴ部分(Fv)和過氧化物酶，價格昂貴，且需二氧化碳培養(yǎng)箱及特殊濾菌設備，僅能在發(fā)達國家使用，廣大第三世界無法推廣。近年來，由于吡嗪酰胺(PZA)在短程化療中的重要作用已引起學者們的日益重視，鑒于上述傳統(tǒng)培養(yǎng)基對PZA藥敏試驗存在困難，因此，尋找一種簡便、可靠的方法來檢測藥敏已迫在眉睫，鑒于PZA最佳殺菌酸度要求在pH5.6，這一特性給研制一種菌株生長良好、結果準確的培養(yǎng)基增加了難度。
本發(fā)明的目的在于要提供一種具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，便于運輸和保藏的分枝桿菌干燥培養(yǎng)基。
本發(fā)明是這樣實現的，培養(yǎng)基以瓊脂和淀粉為賦形劑，加入分枝桿菌生長所需的碳源、氮源、磷酸鹽、硫酸鹽和以及微量刺激生長因子組合群及其他輔劑構成，其各主要組分的重量配比為磷酸二氫鉀68-88、磷酸氫二鈉10-15，檸檬酸三銨10.5-14，檸檬酸三鈉9-11，檸檬酸鐵銨0.5-1.1，L-谷氨酸或天門冬氨酸10.5-14.5，葡萄糖酸鈉或葡萄糖酸鉀10.5-14.5，葡萄糖45-48，硫酸鎂或氯化鎂1.2-2.5，丙酮酸鈉10.5-14.5，尿嘧啶或/和胸腺嘧啶0.8-1.0，-磷酸腺苷(AMP)或鳥嘌呤核苷酸(GMP)0.4-0.6，硫酸鋅或氯化鋅0.2-0.68，偏重亞硫酸鈉2-3，硒酸鈉0.05-0.16，泛酸鈣0.04-0.05，孔雀綠0.05-0.16，DNA0.10-0.50，琥珀酸鈣3-4.5，酵母粉4.6-10.0，淀粉150-270，瓊脂487-664。
其制備方法為按上述重量比分別稱取本發(fā)明各組分原料，以下列步驟配制本發(fā)明培養(yǎng)基1，磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽分別置烤箱內在100℃下烘烤，脫去結晶水;
2，將孔雀綠吸附于上述磷酸鹽，研磨均勻，以10-50份淀粉收底;
3，將上述檸檬酸鹽，L-谷氨酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，置粉碎器內磨勻，在烤箱內80-90℃烘1-2小時，加入淀粉10-50份混合;
4，DNA，用最少量蒸餾水加熱溶解，以最少量瓊脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小時，加入與瓊脂量相同的牛肉膏，蛋白胨以及酵母粉適量球磨，300轉/分，混勻2小時;
5，將上述嘧啶，核苷酸，鋅鹽，偏重亞硫酸鈉，硒酸鈉，泛酸鈣和琥珀酸鈣研磨均勻，置37℃溫箱過夜;
6，取上述處理后的各成分，補足瓊脂和淀粉，酵母粉所需量后，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，仃半小時，再球磨，反復4次，取出置80℃烘箱烘1小時，即得淡黃色粉末狀的本發(fā)明干燥培養(yǎng)基。產品用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置塑料瓶密封，放置避光干燥處保存。
使用本培養(yǎng)基時，只需加入適量的甘油和蒸餾水，混勻，在高溫高壓下滅菌15-20分鐘，冷卻后再加入小牛血清，不需用血清凝固器等專用設備，接著參照中國防癆協(xié)會細菌學標準操作規(guī)程，即可進行分枝桿菌的分離培養(yǎng)、鑒定的工作。由于使用了磷酸鹽緩沖液，使培養(yǎng)基的pH穩(wěn)定在5.6±0.10內，為PZA藥敏檢測提供了最佳酸度，且可以大規(guī)模生產，消除了質量差異，從而為檢測結果的準確性提供了可靠的保證。經用于分枝桿菌的分離培養(yǎng)證明，菌株生長迅速，六周可出報告，用于PZA藥敏試驗，大多數菌株三周內即可報告，而用酸羅氏培養(yǎng)基則需10周，本發(fā)明還可反應菌株對藥物的真實耐藥性。故本發(fā)明培養(yǎng)基，及其生產方法，具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，易于標準化生產，便于運輸和保藏的優(yōu)點，對于指導常規(guī)用藥以及PZA臨床用藥具有重大意義。
以下實施例將對本發(fā)明的技術特征作進一步描述。
實施例1，將磷酸二氫鉀68克，磷酸二氫鈉10克于烤箱內100℃烘烤4小時，脫去結晶水;將孔雀綠0.05克吸附于上述磷酸鹽，研磨均勻，以50克淀粉收底;稱取檸檬酸三銨10.5克，檸檬酸三鈉9克，檸檬酸鐵銨0.5克，L-谷氨酸10.5克，葡萄糖酸鈉10.5克，葡萄糖45克，硫酸鎂1.2克，丙酮酸鈉10.5克，置粉碎器內磨勻，烤箱內80-90℃烘1小時，加入淀粉50克混合;稱取DNA0.10克，以最少量蒸餾水加熱溶解，吸附于最少量瓊脂，80-90℃烤箱烘24小時，加入與瓊脂等量的牛肉膏，蛋白胨以及1-2克酵母粉，球磨，300轉/分，混勻2小時;稱取尿嘧啶0.8克，一磷酸腺苷0.4克，硫酸鋅0.2克，偏重亞硫酸鈉2克，硒酸鈉0.05克，泛酸鈣0.04克和琥珀酸鈣3克研磨均勻，置37℃溫箱過夜;取上述處理后的成分，補足一瓊脂和淀粉所需量，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，隔半小時，反復4次，取出置80℃烘箱烘1小時，用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置500克塑料瓶密封，放置避光干燥處保存。
實施例2，將磷酸二氫鉀68克，磷酸二氫鈉10克于烤箱內100℃烘烤4小時，脫去結晶水;將孔雀綠0.05克吸附于上述磷酸鹽，研磨均勻，以50克淀粉收底;稱取檸檬酸三銨10.5克，檸檬酸三鈉9克，檸檬酸鐵銨0.5克，天門冬氨酸10.5克，葡萄糖酸鉀10.5克，葡萄糖45克，氯化鎂1.2克，丙酮酸鈉10.5克，置粉碎器內磨勻，烤箱內80-90℃烘1小時，加入淀粉50克混合;稱取DNA0.10克，以最少量蒸餾水加熱溶解，吸附于最少量瓊脂，80-90℃烤箱烘24小時，加入與瓊脂等量的牛肉膏，蛋白胨以及1-2克酵母粉，球磨，300轉/分，混勻2小時;稱取胸腺嘧啶0.8克，鳥嘌呤核苷酸0.4克，氯化鋅0.2克，偏重亞硫酸鈉2克，硒酸鈉0.05克，泛酸鈣0.04克和琥珀酸鈣3克研磨均勻，置37℃溫箱過夜;取上述處理后的成分，補足瓊脂和淀粉至全量，置球磨機混勻，300轉/分×1小時，隔半小時，反復4次，取出置80℃烘箱烘1小時，用鋁塑封口袋包裝，暫不包裝則置500克塑料瓶密封，放置避光干燥處保存。
實施例3-15，操作工藝同實施例1，培養(yǎng)基各組分的含量為

實施例13，本發(fā)明用于分枝桿菌分離培養(yǎng)，一，菌株來源牛型、鳥結核分枝桿菌標準菌株來源于美國。其余由日本清瀨市結核病研究室提供。臨床標本來源于上海市及全國各大醫(yī)院收治患者。
二，培養(yǎng)基制備及使用1，稱取10克包裝干燥培養(yǎng)基粉劑，加入甘油3～4毫升，蒸餾水250毫升，搖勻，115℃高壓滅菌10分鐘;
2，待冷卻至60-65℃，加10毫升小牛血清，混勻無菌分裝，放置斜面，凝固后37℃增菌過夜待用。室溫或4℃箱保存，4周內用畢;
3，以2%NaOH處理標本，振蕩消化痰液至透明或半透明，半小時內接種畢，每支0.1毫升37℃溫箱培養(yǎng)，每周觀察一次，第6周報告結果;
三，菌落形態(tài)保持人形結核桿菌基本特征，與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)基比較菌落稍細小，濕潤，光滑，呈表面生長。
四，結果1，標準菌株在干燥培養(yǎng)基的生長試驗人型分枝桿菌(H37Rv)牛型菌株及9株非典型標準菌株在干燥培養(yǎng)基與羅氏培養(yǎng)基比較，無論大接種量(10-3mg/ml)和小接種量(10-5mg/ml)生長速度和最終菌量均無差異
2，臨床標本分離培養(yǎng)試驗用2%NaOH前處理，與酸性羅氏對照，統(tǒng)計1133例臨床標本，干燥培養(yǎng)基陽性為121例，酸羅氏為103例，統(tǒng)計學分析P>0.05，無顯著性差異 干燥培養(yǎng)基，經6家醫(yī)院共計2068例標本，比較5種培養(yǎng)基生長試驗結果，證明其陽性率均高于羅氏及小川氏，僅略低于丙酮酸鈉培養(yǎng)基
從上列三種培養(yǎng)基生長曲線比較圖表明，干燥培養(yǎng)基的生長速度，快于雞蛋基培養(yǎng)基，6周可出報告，3周生長達到高峰。而酸羅氏、丙酮酸鈉培養(yǎng)基生長曲線相似，8周后仍有少量陽性，4周后才達到高峰。干燥培養(yǎng)基可提前二周出報告實施例14，本發(fā)明干燥培養(yǎng)基用于分枝桿菌吡嗪酰胺(PZA)藥敏試驗1，菌株來源標準株中牛型、鳥結核分枝桿菌來源于美國。其余由日本清瀨市結核病研究室提供。臨床初、復治菌株來源于上海市各大醫(yī)院。
2，培養(yǎng)基制備基礎液A取10克包裝干燥培養(yǎng)基粉劑，加入甘油3毫升，蒸餾水250毫升，加熱溶解，10磅滅菌15分鐘;基礎液B新鮮小牛釁血清10ml。
待A液冷卻至50-65℃，將B液倒入混勻，分別加入PZA藥粉，得最終濃度0，25，50，250μg/ml四組，趁熱分裝，放置斜面。凝固后置37℃溫箱增菌過夜，室溫保存，4周內用完。
3，操作方法參照中國防癆協(xié)會細菌學標準操作規(guī)程，做分枝桿菌各群標準菌株生長試驗和臨床初復治菌間接藥敏試驗，藥敏試驗最終接種量為10-3mg/ml。
4，結果觀察于接種后2、3周各觀察一次，第4周出報告。原則上以空白管生長至“+”以上，即可報告藥敏結果。
按上述操作所得158株臨床分離菌PZA藥敏試驗結果為 結果顯示初治菌絕大多數敏感，復治菌株耐藥產生快，三個月內即可達48%，用藥1年者90%耐藥。
118株初治菌各濃度管生長情況
權利要求
1.分枝桿菌干燥培養(yǎng)基，其特征在于，培養(yǎng)基包括磷酸二氫鉀68-88(重量份)，磷酸氫二鈉10-15(重量份)，檸檬酸三銨10.5-14(重量份)，檸檬酸三鈉9-11(重量份)，檸檬酸鐵銨0.5-1.1(重量份)，L-谷氨酸10.5-14.5(重量份)，葡萄糖酸鈉10.5-14.5(重量份)，葡萄糖45-48(重量份)，硫酸鎂1.2-2.5(重量份)，丙酮酸鈉10.5-14.5(重量份)，尿嘧啶0.8-1.0(重量份)，一磷酸腺苷0.4-0.6(重量份)，硫酸鋅0.2-0.28(重量份)，偏重亞硫酸鈉2-3(重量份)，硒酸鈉0.05-0.16(重量份)，泛酸鈣0.04-0.05(重量份)，孔雀綠0.05-0.16(重量份)，DNA0.10-0.27(重量份)，琥珀酸鈣3-4.5(重量份)，酵母粉4.6-10.0(重量份)，淀粉150-270(重量份)，瓊脂487-664(重量份)。
2.如權利要求2所述的分枝桿菌干燥培養(yǎng)基的生產方法其特征在于按培養(yǎng)基組分配比要求，分別稱取原料，通過以下步驟配制本發(fā)明培養(yǎng)基(1)，磷酸鹽、硫酸鹽等無機鹽分別置烤箱內在100℃下烘烤，脫去結晶水和表面吸附水;(2)，將孔雀綠吸附于上述磷酸鹽，研磨均勻，以適量淀粉收底;(3)，將檸檬酸鹽，氨基酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，置粉碎器內磨勻，在烤箱內80-90℃烘1-2小時，加入適量淀粉混合;(4)，DNA，以最少量蒸餾水加熱溶解，用最少量瓊脂吸附，置烤箱中80-90℃下烘24小時，加入與瓊脂量相同的牛肉膏，蛋白胨以及酵母粉適量球磨，300轉/分，混勻2小時;(5)，將嘧啶，核苷酸，鋅鹽，偏重亞硫酸鈉，硒酸鈉，泛酸鈣和琥珀酸鈣研磨均勻，置37℃溫箱過夜;(6)，取上述處理后的各成分，補足瓊脂、淀粉、酵母至全量后，混合置球磨機混勻，300轉/分×1小時，仃半小時，再球磨，反復4次，取出置80℃烘箱烘1小時，即得本發(fā)明培養(yǎng)產品;(7)將上述培養(yǎng)基產品密封置避光干燥處保存。
全文摘要
本發(fā)明分枝桿菌干燥培養(yǎng)基，涉及微生物存在測定的選擇性培養(yǎng)基，主要由磷酸鹽，檸檬酸鹽，氨基酸，葡萄糖酸鹽，葡萄糖，鎂鹽，丙酮酸鈉，嘧啶，鋅鹽，硒酸鈉，泛酸鈣，孔雀綠，DNA，琥珀酸鈣，酵母粉，淀粉和瓊脂，通過大規(guī)模干燥培養(yǎng)生產技術，經脫水、吸附、干燥、球磨等工藝配制而成，具有操作簡便，檢測快速，陽性檢出率高，價格低廉，易于標準化生產，便于運輸和保藏的優(yōu)越性。
文檔編號C12Q1/04GK1103893SQ9311262
公開日1995年6月21日 申請日期1993年12月14日 優(yōu)先權日1993年12月14日
發(fā)明者徐建新 申請人:中國科學院上海植物生理研究所