一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備方法及使用該培養(yǎng)基快速鑒別結(jié)核分枝桿菌的方法、測定結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥的耐藥性方法及使用該培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)卡介苗的方法。本發(fā)明制備的雙相培養(yǎng)基能用于結(jié)核分枝桿菌的快速培養(yǎng)，雙相快速培養(yǎng)基能在2-5天鑒別出結(jié)核分枝桿菌，并且可利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法對鑒別出的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性檢測，本發(fā)明制備的液體培養(yǎng)基可在6-9天完成卡介苗的培養(yǎng)。
【專利說明】—種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)菌培養(yǎng)與疫苗制備領(lǐng)域。具體涉及一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備方法及使用該培養(yǎng)基快速鑒別結(jié)核分枝桿菌的方法、測定結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥的耐藥性方法及使用該培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)卡介苗的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核分枝桿菌俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌?？汕址溉砀髌鞴伲苑谓Y(jié)核為最多見。結(jié)核病至今仍為重要的傳染病。估計世界人口中1/3感染結(jié)核分枝桿菌。據(jù)WHO報道，全世界約每3個人中就有I個人感染了結(jié)核分枝桿菌，在某些發(fā)展中國家成人中結(jié)核分枝桿菌攜帶率高達(dá)80%，其中約5%~10%攜帶者可發(fā)展為活動性結(jié)核病。目前全球每年約出現(xiàn)8百萬結(jié)核新病例，并導(dǎo)致約3百萬人死亡。中國每年死于結(jié)核病的人約25萬之多，是各類傳染病死亡人數(shù)總和的兩倍多。通常對兒童采取接種卡介苗來預(yù)防結(jié)核病的發(fā)生，在臨床上，只有快速鑒別出結(jié)核分枝桿菌，并對其進(jìn)行培養(yǎng)，才能進(jìn)一步找到對結(jié)核分枝桿菌有效的藥物，因此要求提高結(jié)核分枝桿菌的鑒別速度，并且要盡量避免培養(yǎng)過程中存在的細(xì)菌污染問題。
[0003]長期以來我國一直采用羅氏培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)成功需I個月以上，目前的培養(yǎng)卡介苗(BCG)培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法嚴(yán)重滯后。由于結(jié)核分枝桿菌的快速培養(yǎng)、鑒定以及卡介苗(BCG)的制備對于結(jié)核病的確診和治療及結(jié)核病的預(yù)防具有重要的作用，因此迫切需要進(jìn)行快速培養(yǎng)BCG和結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)基。
[0004]結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)所用時間較長，原因是無論使用現(xiàn)在的固體培養(yǎng)基或液體培養(yǎng)基均不能及時給結(jié)核分枝桿菌提供生長所需營養(yǎng)物質(zhì)，固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)物質(zhì)需不斷擴(kuò)散到表面，才能被結(jié)核分枝桿菌吸收，這樣營養(yǎng)物質(zhì)提供的速度決定了結(jié)核分枝桿菌增殖的速度；液體培養(yǎng)基在培養(yǎng)初期能較快的提供營養(yǎng)物質(zhì)，但隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，營養(yǎng)物質(zhì)被不斷消耗，從而影響結(jié)核分枝桿菌的增殖速度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備方法及使用該培養(yǎng)基快速鑒別結(jié)核分支桿菌的方法、測定結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥的耐藥性方法及使用該培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)卡介苗的方法。本發(fā)明用于解決當(dāng)前結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)鑒別時間長，疫苗生產(chǎn)時間長的問題。
[0006]實現(xiàn)本發(fā)明上述目的所采用的技術(shù)方案為:
一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的制備方法如下:
(I)固體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取鹽酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸鈉180~220mg、氯化鈣10~20mg、硫酸鎂15~25mg、檸檬酸鐵銨80~120mg、檸檬酸鈉180~220mg、硫酸銨380~420mg、丙酮酸鈉950~1050mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅I~10mg、天門冬素1950~2050mg、磷酸二氫鉀15~25mg和憐酸二氫鈉15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管7~IOml ；
c.將b步驟所得無菌培養(yǎng)管于80~90°C加熱10~20分鐘，冷卻，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆?br> (2)液體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取氯化韓I~10mg、硫酸鎂5~15mg、油酸15~20mg、枸櫞酸鐵銨5~15mg、枸櫞酸鈉5~lOOmg、硫酸銨180~220mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅5~15mg、丙酮酸鈉400~500mg、吐溫-80 0.5~1ml、天門冬素950~1050mg、憐酸二氧鐘950~1050mg和憐酸二氧鈉1750~1850mg溶于蒸餾水450~600ml中，121°C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C,得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml中，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液；
c.將步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液與步驟b所得促生長因子混合液按體積比1:1混合均勻，得液體培養(yǎng)基混合液，向其中添加過濾除菌后的抑菌劑，得到液體培養(yǎng)基；其中抑菌劑為多粘菌素B，氨芐青霉素和兩性霉素B，且三者的質(zhì)量與液體培養(yǎng)基混合液的質(zhì)量體積比均為0.lmg/ml
(3)將步驟(2)所得液體培養(yǎng)基加入步驟(1)所得固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的體積比為1:1~1:3，得到結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基；
(4)在結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基液體中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或?qū)ο趸郊姿?br> 0.1ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基。
[0007]本發(fā)明優(yōu)選的方案是:固體培養(yǎng)基的制備中，制備步驟為:
a.稱取鹽酸批卩多醇lmg、谷氨酸鈉200mg、氯化韓20mg>硫酸鎂20mg、檸檬酸鐵銨lOOmg、檸檬酸鈉200mg、硫酸銨400mg、丙酮酸鈉lOOOmg、氯化銅5mg、氯化鋅5mg、天門冬素2000mg、磷酸二氫鉀20mg和磷酸二氫鈉20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加熱18分鐘,冷卻至20°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管8ml ；
c.將步驟b所得無菌培養(yǎng)管于85°C加熱15分鐘，冷卻，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0008]本發(fā)明優(yōu)選的方案是:液體培養(yǎng)基的制備中，液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液的制備步驟，具體如下:稱取氯化韓5mg、硫酸鎂10mg、油酸18mg、枸櫞酸鐵銨10mg、枸櫞酸鈉50mg、硫酸銨200mg、氯化銅5mg、氯化鋅10mg、丙酮酸鈉450mg、吐溫-80 0.8ml、天門冬素lOOOmg、磷酸二氫鉀1000mg和磷酸二氫鈉1800mg溶于蒸餾水500ml中，121°C加熱18分鐘，冷卻至20°C，
得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液。
[0009]本發(fā)明還涉及將結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基用于結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別并對鑒別出的結(jié)核桿菌進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定；其中結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別方法為:
A.將待鑒定菌配制成90-110個細(xì)菌/ml;
B.將待鑒定菌接種于結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基的接種量為10μ1，以結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基為對照，得接種后的培養(yǎng)基；
C.將接種后的培養(yǎng)基置入37°C溫箱中孵育2-5天，觀察培養(yǎng)基液體中出現(xiàn)顆?；蚺囵B(yǎng)基固體表面出現(xiàn)菜花樣菌落，則待鑒定菌在培養(yǎng)基中生長；
D.待鑒定菌在噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基中生長，在對硝基苯甲酸培養(yǎng)基中不生長，則為結(jié)核分枝桿菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸的培養(yǎng)基中均不生長，則為非結(jié)核分枝桿菌。
[0010]對鑒別出的結(jié)核桿菌可同時進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL序列設(shè)計引物,反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)核分枝桿菌目的基因的mRNA，其中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因為rpoB，異煙肼耐藥基因為katG、inhA,鏈霉素耐藥基因為rrs、rpsL,同時以傳統(tǒng)藥敏試驗和DNA序法為對照；
所述的結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列為:rpoB基因上游引物序列為:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常擴(kuò)增長度:743bp ；
katG基因上游引物序列為:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTA C，正常擴(kuò)增長度:664bp ；
inhA基因上游引物序列為:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列為:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常擴(kuò)增長度:741bp ；
rrs基因上游引物序列為:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列為:CCCAACATCTCACGACACGA，正常擴(kuò)增長度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列為:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列為:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常擴(kuò)增長度:215bp。
[0011]本發(fā)明還涉及一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的應(yīng)用，其中的液體培養(yǎng)基用于卡介苗的快速培養(yǎng)，方法如下:
取100個細(xì)菌/ml的卡介苗?ομL接種于100mL液體培養(yǎng)基中，于38°C，150rpm恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)一天，36°C下恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5-8天，每天觀察現(xiàn)象，用紫外分光光度計測菌密度，當(dāng)0D600為0.8時，停止培養(yǎng)，收集菌體，得到卡介苗。
[0012]本發(fā)明所提供的一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備及其應(yīng)用，與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點:本發(fā)明制備的雙相培養(yǎng)基可用于結(jié)核分枝桿菌的快速培養(yǎng)，在液體培養(yǎng)狀態(tài)下得到細(xì)菌，在固體培養(yǎng)基上得到單菌落，得到單菌落有利于從形態(tài)上對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行初步鑒定，并且能夠進(jìn)行后續(xù)的藥敏實驗。
[0013]本發(fā)明提供的液體培養(yǎng)基中含有細(xì)菌生長刺激劑酵母浸液、馬鈴薯汁，能大大提高結(jié)核分枝桿菌的生長和培養(yǎng)速度，因此，制備的液體培養(yǎng)基6-9天可完成卡介苗的培養(yǎng)，相比現(xiàn)有卡介苗的培養(yǎng)時間縮短了 I倍以上；本發(fā)明固體培養(yǎng)基含有的雞卵液、丙酮酸鈉、天冬門素等成分和液體培養(yǎng)基含有的馬鈴薯汁、酵母浸液等促生長因子均能使結(jié)核分枝桿菌快速增殖，并且將固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基混合使用，液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分能被結(jié)核桿菌快速吸收，固體培養(yǎng)基的營養(yǎng)能擴(kuò)散到表面，及時補(bǔ)充細(xì)菌增殖時消耗液體培養(yǎng)基的營養(yǎng)。固體培養(yǎng)基含有的孔雀綠和液體培養(yǎng)基含有的抑菌劑能有效防止雜菌污染，實驗數(shù)據(jù)顯示，普通培養(yǎng)基的污染率是2%，而該培養(yǎng)基的污染率僅為0.2%。
[0014] 雙相培養(yǎng)基中加入噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸對結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒別，方法簡單容易操作，能在2-5天鑒別出結(jié)核分枝桿菌，并且可利用反轉(zhuǎn)錄PCR方法測定結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性。
【具體實施方式】
[0015]本發(fā)明的目的是提供一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備方法及使用該培養(yǎng)基快速鑒別結(jié)核分枝桿菌的方法、測定結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥的耐藥性方法及使用該培養(yǎng)基中的液體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)卡介苗的方法。
[0016]一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的制備方法如下:
(1)固體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取鹽酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸鈉180~220mg、氯化鈣10~20mg、硫酸鎂15~25mg、檸檬酸鐵銨80~120mg、檸檬酸鈉180~220mg、硫酸銨380~420mg、丙酮酸鈉950~1050mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅I~10mg、天門冬素1950~2050mg、磷酸二氫鉀15~25mg和憐酸二氫鈉15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管7~IOml ；
c.將b步驟所得無菌培養(yǎng)管于80~90°C加熱10~20分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆茫?br> 所述雞卵液為新鮮雞卵液，具體的制備方法如下:選擇不超過7天、中等大小的雞蛋，洗凈雞蛋表面，浸泡在70%乙醇中25分鐘，取出，拭干，開口，收集雞卵液，攪拌均勻，通過消毒的紗布過濾得新鮮雞卵液；
(2)液體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取氯化韓I~10mg、硫酸鎂5~15mg、油酸15~20mg、枸櫞酸鐵銨5~15mg、枸櫞酸鈉5~lOOmg、硫酸銨180~220mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅5~15mg、丙酮酸鈉400~500mg、吐溫-80 0.5~1ml、天門冬素950~1050mg、憐酸二氧鐘950~1050mg和憐酸二氧鈉1750~1850mg溶于蒸餾水450~600ml中，121 °C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C,得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml中，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液；
所述的馬鈴薯汁，其制備方法為稱取去皮馬鈴薯200克，切成小塊，加水1000毫升煮沸30分鐘，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1000毫升，得馬鈴薯汁；
c.將步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液與步驟b所得促生長因子混合液按體積比1:1混合均勻，得液體培養(yǎng)基混合液，向其中添加過濾除菌后的抑菌劑，得到液體培養(yǎng)基；
所述的抑菌劑為多粘菌素B、氨芐青霉素和兩性霉素B，且三者的質(zhì)量與液體培養(yǎng)基混合液的質(zhì)量體積比均為0.lmg/ml ；(3)將步驟(2)所得液體培養(yǎng)基加入步驟(1)所得固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的體積比為1:1~1:3，得到結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基；
(4)在結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基液體中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或?qū)ο趸郊姿?br> 0.1ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基。
[0017]本發(fā)明還涉及將結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基用于結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別并對鑒別出的結(jié)核桿菌進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定；
其中結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別方法為:
A.將待鑒定菌配制成90-110個細(xì)菌/ml；
B.將待鑒定菌接種于結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基的接種量為10μ1，以結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基為對照，得接種后的培養(yǎng)基；
C.將接種后的培養(yǎng)基置入37°C溫箱中孵育2-5天，觀察培養(yǎng)基液體中出現(xiàn)顆?；蚺囵B(yǎng)基固體表面出現(xiàn)菜花樣菌落，則待鑒定菌在培養(yǎng)基中生長；
D.待鑒定菌在噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基中生長，在對硝基苯甲酸培養(yǎng)基中不生長，則為結(jié)核分枝桿菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸的培養(yǎng)基中均不生長，則為非結(jié)核分枝桿菌。
[0018]對于長期服 藥病人及原發(fā)后感染病人，有必要對其進(jìn)行耐藥性檢測，以提高臨床用藥的療效，本研究可成功對培養(yǎng)的結(jié)核桿菌進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因序列設(shè)計引物,反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)核分枝桿菌目的基因的mRNA，其中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因為rpoB，異煙肼耐藥基因為katG、inhA,鏈霉素耐藥基因為rrs、rpsL,同時以傳統(tǒng)藥敏試驗和DNA序法為對照；
所述的結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列為:rpoB基因上游引物序列為:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常擴(kuò)增長度:743bp ；
katG基因上游引物序列為:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC,正常擴(kuò)增長度:664bp ；
inhA基因上游引物序列為:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列為:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常擴(kuò)增長度:741bp ；
rrs基因上游引物序列為:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列為:CCCAACATCTCACGACACGA，正常擴(kuò)增長度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列為:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列為:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常擴(kuò)增長度:215bp。
[0019]一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的應(yīng)用，其中的液體培養(yǎng)基可用于卡介苗的快速培養(yǎng)，方法如下:
取100個細(xì)菌/ml的卡介苗10μ1接種于100mL液體培養(yǎng)基中，于38°C，150rpm恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)一天，36°C下恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5-8天，每天觀察現(xiàn)象，用紫外分光光度計測菌密度，當(dāng)0D600為0.8時，停止培養(yǎng)，收集菌體，得到卡介苗。
[0020]下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0021]實施例1
(I)固體培養(yǎng)基的制備:a.稱取鹽酸批卩多醇4mg、谷氨酸鈉180mg、氯化韓15mg、硫酸鎂25mg、檸檬酸鐵銨90mg、檸檬酸鈉200mg、硫酸銨380mg、丙酮酸鈉950mg、氯化銅5mg、氯化鋅5mg、天門冬素2000mg、磷酸二氫鉀20mg和磷酸二氫鈉25mg溶于蒸餾水700ml，121°C加熱20分鐘，冷卻至21°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管IOml ；
c.將b步驟所得無菌培養(yǎng)管于90°C加熱10分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)液體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取氯化韓5mg、硫酸鎂5mg、油酸15mg、枸櫞酸鐵銨10mg、枸櫞酸鈉50mg、硫酸銨200mg、氯化銅10mg、氯化鋅10mg、丙酮酸鈉450mg、吐溫-80 1ml、天門冬素950mg、磷酸二氫鉀950mg和磷酸二氫鈉1800mg溶于蒸餾水600ml中，121 °C加熱20分鐘，冷卻至21 °C，得到
液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml中，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液；
c.取液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml加入步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml中，混合均勻，并向其中加入過濾除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨芐青霉素0.1g和兩性霉素B 0.lg，得到液體培養(yǎng)基；
(3)向每個步驟(1)制備的裝有固體培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)管中加入步驟(2)所得液體培養(yǎng)基5ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基；
(4)在結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基液體中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或硝基苯甲酸
0.1ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基。
[0022]將上述制備的結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基用于結(jié)核分支桿菌的快速鑒別:
取結(jié)核病患者的痰液樣品，首先進(jìn)行前處理，在離心管內(nèi)加入樣品，再加入樣品廣2倍的4%的氫氧化鈉液漩渦振蕩10秒后靜置20分鐘，成待鑒定菌，將待鑒定菌配置成大約100個細(xì)菌/ml ;將待鑒定菌接種于含有噻吩-2-羧酸肼結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、含有對硝基苯甲酸結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、含有噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸的結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、不含有噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸的結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基的接種量均為ΙΟμΙ，其中結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基為對照，得接種后的培養(yǎng)基；將接種后的培養(yǎng)基置37°C溫箱中孵育4天后，在含有噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基液體中出現(xiàn)顆粒，在含有對硝基苯甲酸培養(yǎng)基的液體中未出現(xiàn)顆粒并且該培養(yǎng)基固體表面未出現(xiàn)菜花樣菌落，則判斷該患者的痰液樣品中含有結(jié)核分枝桿菌。
[0023]實施例2 液體培養(yǎng)基的制備:
a.秤取氯化韓5mg、硫酸鎂10mg、油酸18mg、枸櫞酸鐵銨IOmg、枸櫞酸鈉50mg、硫酸銨200mg、氯化銅5mg、氯化鋅10mg、丙酮酸鈉450mg、吐溫-80 0.75ml、天門冬素lOOOmg、磷酸二氫鉀lOOOmg、磷酸二氫鈉1800mg溶于蒸餾水500ml中，121 °C加熱20分鐘，冷卻至22°C，得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液；
c.取液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml加入步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml中，混合均勻，并向其中加入過濾除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨芐青霉素0.1g和兩性霉素B 0.lg，得到液體培養(yǎng)基；
將制備的液體培養(yǎng)基用于卡介苗的快速培養(yǎng):取100個細(xì)菌/ml的卡介苗ΙΟμΙ接種于100mL液體培養(yǎng)基中，于38°C，150rpm恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)一天，36°C下恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察現(xiàn)象，適時用紫外分光光度計測菌密度，當(dāng)0D600為0.8時，停止培養(yǎng)，收集菌體，使用該培養(yǎng)基7天可以收集菌體，完成卡介苗的培養(yǎng)。
[0024]實施例3
(I)固體培養(yǎng)基的制備:
a.稱取鹽酸批卩多醇lmg、谷氨酸鈉200mg、氯化韓20mg>硫酸鎂20mg、檸檬酸鐵銨lOOmg、檸檬酸鈉200mg、硫酸銨400mg、丙酮酸鈉lOOOmg、氯化銅5mg、氯化鋅5mg、天門冬素2000mg、磷酸二氫鉀20mg和磷酸二氫鈉20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加熱18分鐘,冷卻至20°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液； b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和新鮮雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管8ml，其中新鮮雞卵液的制備方法同實施例1 ;
c.將b步驟所得無菌培養(yǎng)管斜置于加熱器內(nèi)，85°C加熱15分鐘，冷卻，得到固體培養(yǎng)基，將所得固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0025](2)液體培養(yǎng)基的制備:
a.秤取氯化韓5mg、硫酸鎂10mg、油酸18mg、枸櫞酸鐵銨IOmg、枸櫞酸鈉50mg、硫酸銨200mg、氯化銅5mg、氯化鋅10mg、丙酮酸鈉450mg、吐溫-80 0.8ml、天門冬素lOOOmg、磷酸二氫鉀1000mg和磷酸二氫鈉1800mg溶于蒸餾水500ml中，121 °C加熱18分鐘，冷卻至20°C，得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液；
b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液；
c.取液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml加入步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液500ml中，混合均勻，并向其中加入過濾除菌后的多粘菌素B 0.lg、氨芐青霉素0.1g和兩性霉素B 0.lg，得到液體培養(yǎng)基；
(3)向每個步驟(1)制備的裝有固體培養(yǎng)基的無菌培養(yǎng)管中加入步驟(2)所得液體培養(yǎng)基4ml，得雙相培養(yǎng)基；
(4)在步驟(3)制備的培養(yǎng)基液體中分別加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或硝基苯甲酸
0.1ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基。
[0026]取結(jié)核病患者的膿液樣品，首先進(jìn)行前處理，在離心管內(nèi)加入樣品，再加入樣品1~2倍的4%的氫氧化鈉液漩渦振蕩10秒后靜置20分鐘，成待鑒定菌，將待鑒定菌配置成大約100個細(xì)菌/ml ;將待鑒定菌接種于含有噻吩-2-羧酸肼結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、含有對硝基苯甲酸結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、含有噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸的結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基、不含有噻吩-2-羧酸肼和對硝基苯甲酸的結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基的接種量均為10μ1，其中結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基為對照，得接種后的培養(yǎng)基；將接種后的培養(yǎng)基置37°C溫箱中孵育3天后，在含有噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基液體中出現(xiàn)顆粒，在含有對硝基苯甲酸培養(yǎng)基的液體中未出現(xiàn)顆粒并且該培養(yǎng)基固體表面未出現(xiàn)菜花樣菌落，則判斷該患者的膿液樣品中含有結(jié)核分枝桿菌。
[0027] 將制備的液體培養(yǎng)基用于卡介苗的快速培養(yǎng)方法如下:取100個細(xì)菌/ml的卡介苗ΙΟμΙ接種于100mL液體培養(yǎng)基中，于38°C，150rpm恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)一天，36°C下恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)，每天觀察現(xiàn)象，適時用紫外分光光度計測菌密度，當(dāng)0D600為0.8時，停止培養(yǎng)，收集菌體，使用該培養(yǎng)基6天可以收集菌體，完成卡介苗的培養(yǎng)。
[0028]測定結(jié)核分枝桿菌對利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因序列設(shè)計引物,反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)核分枝桿菌目的基因的mRNA，同時以傳統(tǒng)藥敏試驗和DNA序法為對照；
結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列為:
rpoB基因上游引物序列為:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常擴(kuò)增長度:743bp ；
katG基因上游引物序列為:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常擴(kuò)增長度:664bp ；
inhA基因上游引物序列為:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列為:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常擴(kuò)增長度:741bp ；
rrs基因上游引物序列為:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列為:CCCAACATCTCACGACACGA，正常擴(kuò)增長度:179bp ；
rpsL基因上游引物序列為:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列為:GTTTGCGGTTCTTGACACCC，正常擴(kuò)增長度:215bp ；
結(jié)果為60株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株中，20株藥物敏感株擴(kuò)增結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)株完全相同；40株耐利福平臨床分離株均檢測到基因突變。45株異煙肼耐藥株中有41株檢測到katG基因突變，4株檢測到inhA突變，20株鏈霉素耐藥株中，12株檢測到rrs突變，8株檢測到rpsL突變。與對照結(jié)果相同顯示，用反轉(zhuǎn)錄PCR可快速、特異地檢測出大多數(shù)結(jié)核分枝桿菌分離株的rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因突變,可用于臨床耐藥性的檢測,指導(dǎo)臨床用藥。而傳統(tǒng)的檢測DNA誤差大，時間長(因mRNA只有活的細(xì)菌才有，死亡的細(xì)菌仍就具有 DNA)。
【權(quán)利要求】
1.一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基，其特征在于:培養(yǎng)基的制備方法如下: (1)固體培養(yǎng)基的制備: a.稱取鹽酸吡卩多醇I~5mg、谷氨酸鈉180~220mg、氯化鈣10~20mg、硫酸鎂15~25mg、檸檬酸鐵銨80~120mg、檸檬酸鈉180~220mg、硫酸銨380~420mg、丙酮酸鈉950~1050mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅I~10mg、天門冬素1950~2050mg、磷酸二氫鉀15~25mg和憐酸二氫鈉15~25mg溶于蒸懼水600~700ml中，121°C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液； b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管7~IOml ； c.將b步驟所得無菌培養(yǎng)管于80~90°C加熱10~20分鐘，冷卻至20-25°C，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆茫? (2)液體培養(yǎng)基的制備: a.稱取氯化|丐I~10mg、硫酸鎂5~15mg、油酸15~20mg、枸櫞酸鐵銨5~15mg、枸櫞酸鈉5~lOOmg、硫酸銨180~220mg、氯化銅I~10mg、氯化鋅5~15mg、丙酮酸鈉400~500mg、吐溫-80 0.5~1ml、天門冬素950~1050mg、憐酸二氧鐘950~1050mg和憐酸二氧鈉1750~1850mg溶 于蒸餾水450~600ml中，121 °C加熱15~20分鐘，冷卻至20-25°C,得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液； b.稱取鹽酸吡卩多醇0.15g、甘油5ml、酵母浸液4ml、過氧化氫酶0.2g、生物素0.15g、聚氧乙烯硬脂酸酯0.6g、牛血清白蛋白200g、酪蛋白消化物2g和分枝桿菌培養(yǎng)上清液5ml加入馬鈴薯汁500ml中，混合均勻，過濾除菌，得到促生長因子混合液； c.將步驟a所得液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液與步驟b所得促生長因子混合液按體積比1:1混合均勻，得液體培養(yǎng)基混合液，向其中添加過濾除菌后的抑菌劑，得到液體培養(yǎng)基； 所述的抑菌劑為多粘菌素B、氨芐青霉素和兩性霉素B，且三者的質(zhì)量與液體培養(yǎng)基混合液的質(zhì)量體積比均為0.lmg/ml ； (3)將步驟(2)所得液體培養(yǎng)基加入步驟(1)所得固體培養(yǎng)基中，液體培養(yǎng)基與固體培養(yǎng)基的體積比為1:1~1:3，得到結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基； (4)在結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基液體中加入噻吩-2-羧酸肼0.1ml或?qū)ο趸郊姿?.1ml，得到結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基。
2.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基，其特征在于:固體培養(yǎng)基的制備: a.稱取鹽酸批卩多醇lmg、谷氨酸鈉200mg、氯化韓20mg>硫酸鎂20mg、檸檬酸鐵銨100mg、檸檬酸鈉200mg、硫酸銨400mg、丙酮酸鈉lOOOrng、氯化銅5mg、氯化鋅5mg、天門冬素2000mg、磷酸二氫鉀20mg和磷酸二氫鈉20mg溶于蒸懼水650ml中，121°C加熱18分鐘,冷卻至20°C，得到固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液； b.稱取中性甘油8ml、1%孔雀綠水溶液15ml和雞卵液1000ml加入步驟a所得固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液中，混合均勻，分裝于無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管8ml ； c.將步驟b所得無菌培養(yǎng)管于85°C加熱15分鐘，冷卻，得到固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基于4°C保存?zhèn)溆谩?br> 3.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基，其特征在于:液體培養(yǎng)基的制備中，液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液的制備步驟，具體如下:稱取氯化鈣5mg、硫酸鎂10mg、油酸18mg、枸櫞酸鐵銨10mg、枸櫞酸鈉50mg、硫酸銨200mg、氯化銅5mg、氯化鋅10mg、丙酮酸鈉450mg、吐溫-80 0.8ml、天門冬素lOOOmg、磷酸二氫鉀1000mg和磷酸二氫鈉1800mg溶于蒸餾水500ml中，121°C加熱18分鐘，冷卻至20°C，得到液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)液。
4.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于:結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別并對鑒別出的結(jié)核桿菌進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定； 結(jié)核分枝桿菌的快速鑒別方法為: A.將待鑒定菌配制成90-110個細(xì)菌/ml； B.將待鑒定菌接種于結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基和結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基上，每個培養(yǎng)基的接種量為10μ1，以結(jié)核分枝桿菌雙相培養(yǎng)基為對照，得接種后的培養(yǎng)基； C.將接種后的培養(yǎng)基置于37°C溫箱中孵育2-5天，觀察培養(yǎng)基液體中出現(xiàn)顆?；蚺囵B(yǎng)基固體表面出現(xiàn)菜花樣菌落，則待鑒定菌在培養(yǎng)基中生長； D.待鑒定菌在噻吩-2-羧酸肼培養(yǎng)基中生長，在對硝基苯甲酸培養(yǎng)基中不生長，則為結(jié)核分枝桿菌，在含有噻吩-2-羧酸肼的培養(yǎng)基和對硝基苯甲酸的培養(yǎng)基中均不生長，則為非結(jié)核分枝桿菌； 對鑒別出的結(jié)核桿菌可同時進(jìn)行利福平、異煙肼、鏈霉素抗結(jié)核藥的耐藥性測定，根據(jù)結(jié)核分枝桿菌耐藥基因rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL序列設(shè)計引物,反轉(zhuǎn)錄PCR檢測結(jié)核分枝桿菌目的基因的mRNA，其中結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因為rpoB，異煙肼耐藥基因為katG、inhA,鏈霉素耐藥基因為rrs、rpsL ； 所述的結(jié)核分枝桿菌rpoB、katG、inhA、rrs、rpsL基因引物序列為:rpoB基因上游引物序列為:CCTAAGGTTGACGACGGACC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC，正常擴(kuò)增長度:743bp ； katG基因上游引物序列為:TCGTCCAGCCATTGACCATC，下游引物序列為:TCGACCAACAGCACGTCTAC,正常擴(kuò)增長度:664bp ； inhA基因上游引物序列為:CGGAATCATCACCGACTCGT，下游引物序列為:GCGTAGATGATGTCACCCGT，正常擴(kuò)增長度:741bp ； rrs基因上游引物序列為:ACTCGAAGGAATTGACGGGG，下游引物序列為:CCCAACATCTCACGACACGA，正常擴(kuò)增長度:179bp ； rpsL基因上游引物序列為:CACTCCGAAGAAGCCGAACT，下游引物序列為:GTTTGCGGTTCTTGACACCC,正常擴(kuò)增長度:215bp。
5.如權(quán)利要求1所述的一種結(jié)核分枝桿菌雙相快速鑒別培養(yǎng)基的應(yīng)用，其特征在于:權(quán)利要求1的液體培養(yǎng)基用于卡介苗的快速培養(yǎng)，方法如下: 取100個細(xì)菌/ml的卡介苗?ομL接種于100mL液體培養(yǎng)基中，于38°C，150rpm恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)一天，36°C下恒溫?fù)u床振蕩繼續(xù)培養(yǎng)5-8天，每天觀察現(xiàn)象，用紫外分光光度計測菌密度，當(dāng)0D600為0.8時，停止培養(yǎng)，收集菌體，得到卡介苗。
【文檔編號】C12Q1/68GK103993065SQ201410241566
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月7日
【發(fā)明者】薛慶節(jié), 閆迎春, 聶尚丹, 李秀真, 章洪華, 楊媛媛, 胡文潔 申請人:濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院