一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種白禿馬勃菌絲體中水溶性多糖的制備方法，其步驟為：將白禿馬勃菌接種于固體斜面培養(yǎng)基，恒溫培養(yǎng)，得斜面種子；取培養(yǎng)后的斜面接種到一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)；將培養(yǎng)后的一級(jí)液體種子接種到二級(jí)液體種子中培養(yǎng)；將培養(yǎng)后的二級(jí)液體種子接種發(fā)酵；將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，烘干后研磨得到菌絲體干粉；將菌絲體干粉進(jìn)行浸提或超聲浸提，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物，將多糖粗沉淀物用熱水溶解，除去游離蛋白質(zhì)以及小分子雜質(zhì)，濃縮，加入乙醇沉淀，經(jīng)干燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精制提取物。本發(fā)明方法易行，制備操作簡(jiǎn)便，低溫、短時(shí)、高效。
【專利說(shuō)明】一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備方法
[0001]
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明屬于生物工程與【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體涉及一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0003]白禿馬勃中文別名白馬勃，是擔(dān)子菌綱、灰包目、灰包科、馬勃屬的藥用真菌，是我國(guó)著名的藥用真菌之一，主要分布于我國(guó)河北、山西、遼寧、黑龍江、陜西、甘肅、新疆等地區(qū)。子實(shí)體小，扁球形，近球形，梨形，淺棕灰色，并有發(fā)達(dá)的根狀的菌絲索。外包被薄，粉狀，有斑紋，內(nèi)包被堅(jiān)實(shí)而脆。孢子體蜜黃色到淺茶色，孢子球形，淺青黃色，直徑4~5μπι。光滑或有極細(xì)的小疣，常殘留有小柄。孢絲同色，稀有的橫隔，粗細(xì)均勻，4.5~6μπι。幼時(shí)可食用，老后藥用。白馬勃含有賴氨酸、蛋氨酸等人體必需的八種氨基酸以及馬勃素、麥角甾醇、類脂、抗敗血酸、脫氫抗敗血酸和白馬勃多糖等，其活性成分具收斂性消炎止血，散熱解毒利咽喉，抗腫瘤，提高人體免疫力等功效。由于其優(yōu)良的食療保健作用，國(guó)際市場(chǎng)對(duì)該菌的需求不斷增加。馬勃多糖主要通過(guò)大禿馬勃、黃硬皮馬勃、褐皮馬勃、黃硬皮馬勃、梨形馬勃等子實(shí)體中提取或通過(guò)液體深層發(fā)酵培養(yǎng)制備胞外多糖。但白馬勃的傳統(tǒng)生產(chǎn)方法是固體栽培，這種方法周期長(zhǎng)、占地面積大，又受季節(jié)和原料的限制，使得其子實(shí)體活性多糖物質(zhì)產(chǎn)量低，難以推廣，從而使其不能得到充分的利用。從白禿馬勃菌絲體中提取水溶性活性多糖目前仍不見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，其它馬勃多糖提取則以子實(shí)體為材料，經(jīng)熱水浸提，用Sevag法脫蛋白，乙醇沉淀制備多糖，這些方法存在著提取效率低、用時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法。
[0005]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，包括如下步驟:
(O將白禿馬勃菌接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基，于26°C恒溫培養(yǎng)5~7天，得到斜面種子。所述的PDA固體斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分含量組分:馬鈴薯18~22%，葡萄糖
1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白胨0.5~0.7%，七水硫酸鋅0.01~0.03%,七水硫酸鎂0.04~0.07%,磷酸二氫鉀0.05~0.15%，瓊脂粉1.0~2.0%，余量為水。
[0006](2)取上述斜面種子接種到裝有一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、13 0r/min培養(yǎng)72~96小時(shí)。所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分含量組分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黃豆粉1.0~2.5%，蛋白胨1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸鎂1.0~2.5%，七水硫酸鋅0.1~0.3%，磷酸二氫鉀1.5~2.5%，余量為水。[0007](3)將培養(yǎng)72~96小時(shí)后的一級(jí)液體種子接種到裝有二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、150r/min培養(yǎng)60~72小時(shí)。所述的二級(jí)液體種子培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子培養(yǎng)基相同。
[0008](4)將培養(yǎng)60~72小時(shí)后的二級(jí)液體種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基A的三角瓶中，于28°C、180r/min培養(yǎng)96小時(shí)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基A包含如下質(zhì)量百分含量組分:馬鈴薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白胨0.6~1.2%，七水硫酸鎂0.2~0.6%，磷酸二氫鉀0.3~
0.6%，碳酸鈣0.2~0.6%，余量為水。
[0009](5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，用水沖洗干凈，烘干后得到白禿馬勃菌絲體。
[0010]步驟(2)優(yōu)選為取斜面種子3~5環(huán)接種到裝有IOOmL —級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，于26°C、130r/min培養(yǎng)72~96小時(shí)。
[0011]步驟(3)優(yōu)選為將一級(jí)液體種子按10% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL 二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，于26°C、150r/min培養(yǎng)60~72小時(shí)。
[0012]步驟(4)優(yōu)選為將二級(jí)液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基A的250mL三角瓶中，于28°C、180r/min培養(yǎng)96小時(shí)。
[0013]步驟(4)還可以為:將培養(yǎng)60~72小時(shí)后的二級(jí)液體種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基B的IOL發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為0.7，罐壓為0.04~0.07MPa，于28°C、220r/min培養(yǎng)72小時(shí)后放罐。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基B包含如下質(zhì)量百分含量組分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黃豆 粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸鋅
1.0~2.0%，七水硫酸鎂1.5~3.0%，磷酸二氫鉀2.0~3.0%，余量為水。
[0014]步驟(5)中所述的烘干優(yōu)選為50°C烘干。
[0015]上述培養(yǎng)基的pH均優(yōu)選為自然pH。
[0016]一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，包括如下步驟:
(I)將通過(guò)上述方法得到的白禿馬勃菌絲體研磨粉碎，加入去離子水進(jìn)行浸提或超聲，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物。
[0017](2)將白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物用熱水溶解，再用Sevag法反復(fù)除去游離蛋白質(zhì)，直至檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，濃縮，再用乙醇沉淀，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉淀物。
[0018](3)將去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉淀物經(jīng)透析方法分離，除去小分子雜質(zhì)，得到多糖分子量在3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃菌水溶性活性多糖精制提取液，加入乙醇沉淀，得到精制沉淀物。
[0019](4)將精制沉淀物干燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精制提取物。
[0020]步驟(2)中所述的Sevag法具體為=Sevag溶液為三氯乙酸和正丁醇按體積比5:1混合，Sevag溶液和粗多糖溶液按體積比1:2混合，振蕩25分鐘，靜置60分鐘，去除蛋白沉淀，反復(fù)進(jìn)行4~6次。
[0021]步驟(2)中所述的干燥優(yōu)選為加熱恒溫干燥。
[0022]上述方法中濃縮優(yōu)選為將提取液濃縮至原體積的1/2~1/4，濃縮采用在50~55 0C > 0.08~0.09MPa下的減壓濃縮。
[0023]上述方法中醇析沉淀所用的乙醇優(yōu)選為體積分?jǐn)?shù)為75%~95%乙醇，用量為濃縮液的2~4倍體積量。
[0024]本發(fā)明方法得到的白禿馬勃水溶性活性多糖呈白色，易溶于熱水，不易溶于正丁醇、丙酮等有機(jī)溶劑。
[0025]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)和效果:本發(fā)明所使用的培養(yǎng)基及發(fā)酵工藝是 申請(qǐng)人:經(jīng)過(guò)無(wú)數(shù)次的試驗(yàn)得出的最佳條件，通過(guò)本發(fā)明方法培養(yǎng)白禿馬勃菌絲，其產(chǎn)量高達(dá)11.7g/L，提取得到的白禿馬勃水溶性多糖的產(chǎn)量高達(dá)153.57mg/L，純度高達(dá)99.86%。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0027]下述實(shí)施例中培養(yǎng)基的pH均為自然pH (5~6)。
[0028]實(shí)施例1
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備，其步驟是:
(I)將白禿馬勃菌接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基，于26°C恒溫培養(yǎng)6天，得到斜面種子。所述PDA固體斜面培養(yǎng)基中各組分及含量分別為(％):馬鈴薯20，葡萄糖2.0,酵母粉1.4，蛋白胨0.6，七水硫酸鋅0.02，七水硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.10，瓊脂粉1.0，余量為水。
[0029](2)取上述斜面種子3~5環(huán)，接種到裝有IOOmL —級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加12顆玻璃珠，于26°C、130r/min培養(yǎng)96小時(shí)。所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基中各組分及其含量分別為(％):玉米粉4.0,葡萄糖2.0，黃豆粉1.0，蛋白胨2.0，酵母粉2.0，七水硫酸鎂1.5，七水硫酸鋅0.1，磷酸二氫鉀2.0，余量為水。
[0030](3)將培養(yǎng)96小時(shí)后的一級(jí)液體種子按10% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL 二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加12顆玻璃珠，于26°C、150r/min培養(yǎng)60小時(shí)。所述的二級(jí)液體種子培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子培養(yǎng)基相同。
[0031](4)將培養(yǎng)60小時(shí)后的二級(jí)液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基A的250mL三角瓶中發(fā)酵，于28°C、180r/min培養(yǎng)96小時(shí)。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基A各組分及含量分別為(％):馬鈴薯20，蔗糖2.0，蛋白胨0.6，七水硫酸鎂0.2，磷酸二氫鉀
0.3，碳酸鈣0.2，余量為水。
[0032](5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，用純凈水沖洗干凈，于50°C烘干后研磨得到1.166g菌絲體干粉。
[0033](6)將上述白禿馬勃菌絲體干粉加入到其40倍質(zhì)量的去離子水中，在50或51或52或53°C浸提3小時(shí)，重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀析出，收集得11.43mg白禿馬勃菌絲體多糖粗沉淀物。
[0034](7)向多糖粗沉淀物中加入熱去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用Sevag法去除蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)；減壓濃縮(條件同(6))后，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌絲體多糖沉淀物10.74mg。
[0035](8)將去蛋白質(zhì)后的多糖沉淀溶于熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，靜置析出精制沉淀物10.2Img0[0036](9)將精制沉淀物50°C恒溫干燥得到白禿馬勃精制多糖固體10.12mg，該多糖顏色為白色，純度為99.54%ο
[0037](10)本發(fā)明白禿馬勃多糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法，測(cè)定方法如下:
精確稱葡萄糖0.1Og (預(yù)先在105°C烘干至恒重)于小燒杯中，用少量去離子水溶解后定量轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，以去離子水定容至刻度線，搖勻，其濃度為1.0mg/mL，分吸取OmL、0.02mL,0.04mL、0.06mL,0.08mL,0.lOmL.0.12 mL 于比色管中，補(bǔ)加蒸餾水至 2.0mL，接著加入5%苯酚溶液1.0mL，搖勻后立即滴加5.0mL濃硫酸(物質(zhì)的量濃度為18.4mol ,L-1),混合均勻后25°C保溫20min，測(cè)定各溶液在490nm處的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取白禿馬勃多糖樣品，按照標(biāo)準(zhǔn)液配制的方法配制樣品液，測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。
[0038]實(shí)施例2
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備，其步驟是:
(O白禿馬勃菌絲體干粉的制備同實(shí)施例1步驟(1)~(5)。
[0039](2)將上述白禿馬勃菌絲體干粉加入到其40倍質(zhì)量的去離子水中，在50或51或52或53°C超聲6min，重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀析出，收集得13.99mg白禿馬勃菌絲體多糖粗沉淀物。
[0040](3)向多糖粗沉淀物中加入熱去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用Sevag法去除蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮(條件同(2))后，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌絲體多糖沉淀物13.57mg。
[0041](4)將去蛋白質(zhì)后的多糖沉淀溶于熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，靜置析出精制沉淀物13.43mg。
[0042](5)將精制沉淀物50°C恒溫干燥得到白禿馬勃精制多糖固體13.36mg,該多糖顏色為白色，純度為99.81%。
[0043]實(shí)施例3
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備，其步驟是:
(I) 二級(jí)液體種子的制備同實(shí)施例1步驟(1)~(3)，不同的是(3)中一級(jí)液體種子接種后培養(yǎng)的時(shí)間是72小時(shí)。
[0044](2)將培養(yǎng)72小時(shí)后的二級(jí)液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基B的IOL發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為0.7，罐壓為0.04或0.05或0.06或0.07MPa,于28°C、220r/min培養(yǎng)72小時(shí)后放罐。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基B各組分及含量分別為(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黃豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸鋅1.0，七水硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀2.0,余量為水。
[0045](3)將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到80.64g菌絲體干粉。
[0046](4)將上述白禿馬勃菌絲體干粉加入40倍質(zhì)量的去離子水，在50或51或52或53°C浸提 3小時(shí)，重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95%(V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀析出，收集得0.887g白禿馬勃菌絲體多糖粗沉淀物。
[0047](5)向多糖粗沉淀物中加入熱去離子水溶解,使之充分復(fù)溶,用Sevag法去除蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮(條件同(4))后，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌絲體多糖沉淀物0.834g。
[0048](6)將去蛋白質(zhì)后的多糖沉淀溶于熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，靜置析出精制沉淀物0.809g。
[0049](7)將精制沉淀物50°C恒溫干燥得到白禿馬勃精制多糖固體0.802g,該多糖顏色為白色，純度為99.62%。
[0050]實(shí)施例4
一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的制備，其步驟是:
(I)二級(jí)液體種子的制備同實(shí)施例1步驟(1)~(3)，不同的是(3)中一級(jí)液體種子接種后培養(yǎng)的時(shí)間是72小時(shí)。
[0051](2)將培養(yǎng)72小時(shí)后的二級(jí)液體種子按6% (V/V)的接種量接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基B的IOL發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為0.7，罐壓為0.04或0.05或0.06或0.07MPa,于28°C、220r/min培養(yǎng)72小時(shí)后放罐。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基B各組分及含量分別為(％):玉米粉5.0，糖蜜1.5，黃豆粉2.0，花生油1.0，酵母粉2.0，七水硫酸鋅1.0，七水硫酸鎂1.5，磷酸二氫鉀2.0,余量為水 。
[0052](3)將菌絲體與發(fā)酵液分離，清水沖凈，于50°C烘干后研磨得到80.36g菌絲體干粉。
[0053](4)將上述白禿馬勃菌絲體干粉加入到其40倍質(zhì)量的去離子水中，在50或51或52或53°C超聲6min，重復(fù)3次，合并3次提取液，將提取液在6000rpm下離心5min。濾液在52°C減壓(0.08~0.09MPa)濃縮至原體積的1/3，攪拌下向濃縮提取液中加入3倍體積95% (V/V)乙醇，將濃縮提取液中的多糖沉淀析出，收集得1.125g白禿馬勃菌絲體多糖粗沉淀物。
[0054](5)向多糖粗沉淀物中加入熱去離子水溶解，使之充分復(fù)溶，用Sevag法去除蛋白，重復(fù)進(jìn)行，直到檢測(cè)不出蛋白質(zhì)。減壓濃縮(條件同(4))后，加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，沉淀接著用乙醇洗滌，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌絲體多糖沉淀物1.091g。
[0055](6)將去蛋白質(zhì)后的多糖沉淀溶于熱水，用去離子水透析，得到分子量3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃多糖精制液，在攪拌下再加入3倍體積95% (V/V)乙醇沉淀，靜置析出精制沉淀物1.080g。
[0056](7)將精制沉淀物50°C恒溫干燥得到白禿馬勃精制多糖固體1.075g,該多糖顏色為白色，純度為99.86%ο
[0057]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟: (O將白禿馬勃菌接種于PDA固體斜面培養(yǎng)基，于26°C恒溫培養(yǎng)5~7天，得到斜面種子；所述的PDA固體斜面培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分含量組分:馬鈴薯18~22%，葡萄糖1.0~3.0%，酵母粉1.0~2.0%，蛋白胨0.5~0.7%，七水硫酸鋅0.01~0.03%,七水硫酸鎂0.04~0.07%,磷酸二氫鉀0.05~0.15%，瓊脂粉1.0~2.0%，余量為水； (2)取上述斜面種子接種到裝有一級(jí)液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、130r/min培養(yǎng)72~96小時(shí)；所述的一級(jí)液體種子培養(yǎng)基包含如下質(zhì)量百分含量組分:玉米粉3.0~5.0%，葡萄糖1.0~2.0%，黃豆粉1.0~2.5%，蛋白胨1.5~3.0%，酵母粉1.5~2.5%，七水硫酸鎂1.0~2.5%，七水硫酸鋅0.1~0.3%，磷酸二氫鉀1.5~2.5%，余量為水； (3)將培養(yǎng)72~96小時(shí)后的一級(jí)液體種子接種到裝有二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的三角瓶中，加入玻璃珠，于26°C、150r/min培養(yǎng)60~72小時(shí)；所述的二級(jí)液體種子培養(yǎng)基與一級(jí)液體種子培養(yǎng)基相同； (4)將培養(yǎng)60~72小時(shí)后的二級(jí)液體種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基A的三角瓶中，于28°C、180r/min培養(yǎng)96小時(shí)；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基A包含如下質(zhì)量百分含量組分:馬鈴薯20~30%，蔗糖2.0~4.0%，蛋白胨0.6~1.2%，七水硫酸鎂0.2~0.6%，磷酸二氫鉀0.3~0.6%，碳酸鈣0.2~0 .6%，余量為水； (5)將菌絲體與發(fā)酵液分離，用水沖洗干凈，烘干后得到白禿馬勃菌絲體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(2)為取斜面種子3~5環(huán)接種到裝有IOOmL —級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，于26°C、130r/min培養(yǎng)72~96小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(3)為將一級(jí)液體種子按10%的接種量接種到裝有IOOmL 二級(jí)液體種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，加10~15顆玻璃珠，于26°C、150r/min培養(yǎng)60~72小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)為將二級(jí)液體種子按6%的接種量接種到裝有IOOmL發(fā)酵培養(yǎng)基A的250mL三角瓶中，于28°C、180r/min培養(yǎng)96小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(4)為將培養(yǎng)60~72小時(shí)后的二級(jí)液體種子接種到裝有發(fā)酵培養(yǎng)基B的IOL發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝料系數(shù)為0.7，罐壓為0.04~0.07MPa,于28°C、220r/min培養(yǎng)72小時(shí)后放罐；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基B包含如下質(zhì)量百分含量組分:玉米粉4.0~6.0%，糖蜜1.0~3.0%，黃豆粉1.5~3.0%，花生油1.0~2.0%，酵母粉1.5~3.0%，七水硫酸鋅1.0~2.0%，七水硫酸鎂1.5~3.0%，磷酸二氫鉀2.0~3.0%,余量為水。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的白禿馬勃菌絲體的培養(yǎng)方法，其特征在于:步驟(5)中所述的烘干為50°C烘干。
7.一種白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:包括如下步驟: (I)將通過(guò)權(quán)利要求1~6任一項(xiàng)所述的方法得到的白禿馬勃菌絲體研磨粉碎，加入去離子水進(jìn)行浸提或超聲，濃縮液體，加入乙醇沉淀收集白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物；(2)將白禿馬勃菌水溶性活性多糖粗沉淀物用熱水溶解，再用Sevag法反復(fù)除去游離蛋白質(zhì)，直至檢測(cè)不到蛋白質(zhì)，濃縮，再用乙醇沉淀，得到去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉淀物； (3)將去蛋白質(zhì)后的白禿馬勃菌水溶性活性多糖沉淀物經(jīng)透析方法分離，除去小分子雜質(zhì)，得到多糖分子量在3500~8000道爾頓之間的白禿馬勃菌水溶性活性多糖精制提取液，加入乙醇沉淀，得到精制沉淀物； (4)將精制沉淀物干燥得到白禿馬勃菌水溶性活性多糖精制提取物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:步驟(2)中所述的干燥為加熱恒溫干燥。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于:所述的方法中濃縮為將提取液濃縮至原體積的1/2~1/4，濃縮采用在50~55°C、0.08~0.09MPa下的減壓濃縮。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的白禿馬勃菌絲體中水溶性活性多糖的提取方法，其特征在于: 所述的方法中醇析沉淀所用的乙醇為體積分?jǐn)?shù)為75%~95%乙醇，用量為濃縮液的2~4倍體積量。
【文檔編號(hào)】C12P19/04GK103993051SQ201410241551
【公開(kāi)日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年6月3日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月3日
【發(fā)明者】張華山, 陽(yáng)飛, 王偉平, 蘇正定 申請(qǐng)人:湖北工業(yè)大學(xué)