專利名稱：包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分枝桿菌的分枝桿菌培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法
包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群分枝桿菌的分枝桿菌培養(yǎng)基和培
養(yǎng)方法本發(fā)明涉及分枝桿菌特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium tuberculosis complex)的分枝桿菌的新培養(yǎng)基，其可顯著減少通過培養(yǎng)進(jìn)行分離的時(shí)間以及因此減少診斷分枝桿菌病、特別是結(jié)核的時(shí)間。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)和鑒定分枝桿菌和特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌的方法。具體而言，本發(fā)明涉及在所述用于分離和培養(yǎng)分枝桿菌的新培養(yǎng)基中凈化生物學(xué)樣品的新方法。本發(fā)明還涉及，使用本發(fā)明的固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物，快速確定分枝桿菌特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對抗生素敏感性的表型的方法。最后，本發(fā)明涉及通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行液相鑒定的新方法，從而有助于顯著減少診斷分枝桿菌病特別是結(jié)核的時(shí)間。分枝桿菌是通過16S rRNA基因測序和通過所謂的“多基因座系統(tǒng)發(fā)育 (multi locus phylogeny) ，， ^v ^ ^^ ^ M^M Π (Actinobacteria phylum)白勺 M 菌[Mignard S, Flandrois JP. A seven-gene, multilocus, genus-wide approach to phylogeny of mycobacteria using supertrees.Int J Syst Evol Microbiol. 2008 ； 58 :1432-41],且其特征在于在它們的細(xì)胞壁中存在分枝菌酸和染色體具有> 60 %的高G+C %，所述分枝酸賦予它們特別的染色親和性(Ziehl-Neelsen染色)[Pfyffer GE.Mycobacterium :general characteristics, laboratory detection, in staning procedures. In :Murray Pr, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA. Manual of Clinical Microbiology 9th Ed. Amercian Society for Microbiology, Washington DC ；2007, pp. 543-572]。分枝桿菌屬(Mycobacterium)包括60多個(gè)種，包括分離自惰性環(huán)境(突然、水)的環(huán)境種類、與動物有關(guān)的種類和嚴(yán)格的人類種類即麻風(fēng)分枝桿菌 (Mycobacterium 1印rae)，其是麻風(fēng)病的病因[Cole S et al. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001 ；409 :1007-11] 某些環(huán)境種類是造成人類機(jī)會性感染的原因(例如鳥分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium avium complex)的種類)，且某些種類是造成人畜共患病的原因，特別是造成結(jié)核的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的某些種類。分枝桿菌病的診斷基于來自人或動物臨床樣品的分枝桿菌屬的種類之一的分離和培養(yǎng)。根據(jù)這一觀點(diǎn)，分枝桿菌屬包括不可培養(yǎng)的種類(麻風(fēng)分枝桿菌)、在培養(yǎng)不到 7天產(chǎn)生可見菌落的快速生長的種類(偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacterium fortuitum)、潰瘍分枝桿菌(Mycobacterium ulcerans)、月農(nóng)月中分枝桿菌(Mycobacterium abscessus))禾口緩慢生長的種類，所述緩慢生長的種類在培養(yǎng)7天以上，或以常規(guī)實(shí)踐，在培養(yǎng)3-8周之間， 特別是用Middlebrook培養(yǎng)基，產(chǎn)生可見菌落。在人類醫(yī)學(xué)中，鳥分枝桿菌復(fù)合群的種類在培養(yǎng)10-20天后是可檢測的，而結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的種類需要10-100個(gè)活生物/ml 樣品和培養(yǎng)6-8周，以便獲得100%陽性樣品[Colebunders R, Bastian I. A review of the diagnosis and treatment of smear-negative pulmonary tuberculosis.Int J Tuberc Lung Dis. 2000 ;4 :97-107]。根據(jù)人類結(jié)核病例的數(shù)字重要性和嚴(yán)重性，在結(jié)核的診斷中，確實(shí)在實(shí)驗(yàn)室技術(shù)上已經(jīng)取得特別顯著單獨(dú)改善。實(shí)際上，結(jié)核是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群7個(gè)種之一在人類和動物中引起的感染性疾病結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)(和由其衍生的BCG)、非洲分枝桿菌 (Mycobacterium africanum) > Mycobacterium canettii> lll^^l^lf lif (Mycobacterium caprae)、田鼠分枝桿菌(Mycobacterium microti)以及海豹分枝桿菌(Mycobacterium pinnipedii)[Dye C. et al. Prospects for worldwide tuberculosis control under the WHO DOTS strategy. Lancet 1998;352:1886-91]。世界健康組織(WHO)估計(jì)，在 2006 年， 結(jié)核是造成9. 2百萬新病例和1. 6百萬死亡的原因[World Health Organization. 2008. Global tuberculosis control :surveillance, planning, financing. WHO report. Geneva =World Health Organization. WH0/HTM/TB/2008. 393]。這些數(shù)字強(qiáng)調(diào)了優(yōu)化結(jié)核的微生物診斷以便改善患者和其家人朋友的醫(yī)藥管理的重要性。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的分離和培養(yǎng)，從表現(xiàn)出表示結(jié)核的病征和癥狀的患者獲得的臨床樣品開始。最常見的臨床形式也是傳染性的唯一臨床形式，是肺結(jié)核， 其通過從呼吸樣品分離和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌來診斷，所述呼吸樣品如痰、支氣管抽吸物、支氣管鏡檢獲得的支氣管肺泡灌洗液或肺部活檢。在不產(chǎn)生痰的患者中，在肺結(jié)核的情況下，胃抽吸液可以用作分離和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的可選方案。還存在結(jié)核的其他臨床形式，特別是淋巴結(jié)核和骨結(jié)核(卜德氏病(Pott' S disease))以及消化道結(jié)核。取決于臨床形式，可將不同的臨床樣品送往實(shí)驗(yàn)室，供分離和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌并診斷肺部外形式。固體培養(yǎng)基、液體培養(yǎng)基以及具有固相和液相的兩相培養(yǎng)基可用于分離和培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌。固體培養(yǎng)基基于瓊脂制造。通常使用含有全卵的培養(yǎng)基， 并且最常用的培養(yǎng)基是羅氏培養(yǎng)基(Lowenstein-Jensen medium)。該培養(yǎng)基和其他含有卵的培養(yǎng)一樣，含有有助于抑制污染性微生物生長的孔雀綠。已經(jīng)提出了幾種含有不同濃度的孔雀綠的制劑，恒定的結(jié)果是，孔雀綠濃度的降低增加培養(yǎng)基污染的比例，且孔雀綠濃度的增加傾向于降低結(jié)核組分枝桿菌的分離和培養(yǎng)。另一類固體培養(yǎng)基包括瓊脂培養(yǎng)基特別是Middlebrook 7H10培養(yǎng)基和培養(yǎng)基7H11(培養(yǎng)基7H10加0. 水解的酪蛋白)。 Middlebrook培養(yǎng)基含有促進(jìn)鳥分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的培養(yǎng)的2%甘油。液體培養(yǎng)基基本上與Middlebrook 7H9培養(yǎng)基一致。然而，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的分離非常緩慢，因?yàn)楦鞣N結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群種類的所有菌株在6-8周的時(shí)間內(nèi)分離。因此，該時(shí)間的任何減少都代表了結(jié)核和其他分枝桿菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷的顯著改善。在多次努力后，本發(fā)明開發(fā)了培養(yǎng)基的新配方，從而允許更快速地分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌和分枝桿菌，特別是允許從臨床樣品開始，在不到15天內(nèi)，甚至在 10天內(nèi)檢測和鑒定。本發(fā)明的培養(yǎng)基配方允許在適合裝置或自動檢測的液體培養(yǎng)基中和在手工檢測的固體培養(yǎng)基中分離分枝桿菌，另外，在可能包含呈現(xiàn)抑制分枝桿菌生長風(fēng)險(xiǎn)的共生菌群細(xì)菌的臨床樣品的情況下，其與用氯己定凈化相容。更準(zhǔn)確而言，本發(fā)明提供了分枝桿菌培養(yǎng)基，包含分枝桿菌生長因子和優(yōu)選地?zé)o抗分枝桿菌活性的抗生素，其特征在于，其包含下列附加成分-卵磷脂，和
-去纖維蛋白血液，和-去補(bǔ)體胎牛血清。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，組合添加去纖維蛋白血液、卵磷脂以及去補(bǔ)體胎牛血清滿足了本發(fā)明的目的，特別是在由液體培養(yǎng)液直接培養(yǎng)和鑒定的情況下。胎牛血清是經(jīng)常用于細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞內(nèi)微生物分離但不是用于分離細(xì)胞外細(xì)菌的組分的試劑。以已知的方式，通過加熱、特別是在56°C加熱1小時(shí)，使胎牛血清去補(bǔ)體，即從胎牛血清中去除所有稱為“血清補(bǔ)體”的蛋白。已知該血清補(bǔ)體具有抗菌活性。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)基由已知用于培養(yǎng)分枝桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基構(gòu)成，特別是，包含礦物鹽、糖、氨基酸、蛋白以及維生素的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基補(bǔ)充有上文提到的所述附加成分。根據(jù)實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選特征-所含的卵磷脂的重量比為0.1_5%，優(yōu)選0.5-1%，-卵磷脂是蛋黃卵磷脂，-所含的去補(bǔ)體胎牛血清的體積比為2.5-25%，優(yōu)選10-20%，-所含血液的體積比為2.5-15%，優(yōu)選5-10%，-血液是去纖維蛋白的兔血液，或優(yōu)選去纖維蛋白的綿羊血液。更具體而言，本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)基包含分枝桿菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，除了蒸餾水以外，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基還包含下列成分硫酸銨、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、枸櫞酸鈉、枸櫞酸鐵銨、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、L-谷氨酸、生物素以及吡哆醇。特別是，這些成分是稱為Middlebrook培養(yǎng)基的分枝桿菌培養(yǎng)基所含的成分。在實(shí)踐中，這種培養(yǎng)基最初采用上文所列成分的凍干物形式，用于在蒸餾水中稀釋，以便形成本發(fā)明的培養(yǎng)基。更具體而言，所述無抗分枝桿菌活性的抗生素是多粘菌素、萘啶酮酸、甲氧芐啶、 阿洛西林和萬古霉素，且培養(yǎng)基含包含抗真菌劑，優(yōu)選兩性霉素B。上文提到的抗生素和抗真菌劑的組合，例外是萬古霉素，構(gòu)成了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的稱為PANTA的組合。根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。更具體而言，本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)基包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，其是參照號為7H9的 Middlebrook液體培養(yǎng)基；和分枝桿菌的下列附加生長因子酪蛋白水解產(chǎn)物、甘油、聚山梨醇酯、氯高鐵血紅素、乳酸、生物素、聚氧乙烯硬脂酸酯、牛血清白蛋白、葡萄糖和優(yōu)選補(bǔ)充物H (supplement H)。補(bǔ)充物H是高度精煉的酪蛋白消化物。根據(jù)本發(fā)明培養(yǎng)基的第二實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基是含有優(yōu)選選自糖的膠凝劑的固體培養(yǎng)基，所述膠凝劑的重量比為0. 5-5%，更優(yōu)選1-2%。更具體而言，所述培養(yǎng)基是參照號為7H10的Middlebrook類型的含水固體培養(yǎng)基，添加有所述膠凝劑和分枝桿菌的下列附加生長因子油酸、牛白蛋白優(yōu)選牛白蛋白的級份V、葡萄糖、過氧化氫酶以及甘油。包含于培養(yǎng)基7H10的孔雀綠是除了分枝桿菌以外的細(xì)菌的生長抑制劑。上文提到的分枝桿菌的附加生長因子，除了甘油，由名稱OADC因子而知名。
本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于，在適于培養(yǎng)包含于樣品中的分枝桿菌種類的30-37°C溫度下，在上述分枝桿菌培養(yǎng)基中，孵育含有上述分枝桿菌的樣品。大多數(shù)分枝桿菌培養(yǎng)于37 °C下。然而某些分枝桿菌，如海分枝桿菌 (Mycobacterium marinum)、嗜血分枝桿菌(Mycobacterium haemophilum)、饋痛分枝桿菌，培養(yǎng)于-30°C的溫度下。楚爾蓋分枝桿菌(Mycobacterium szulgai)可以培養(yǎng)于251-371之間，Mycobacterium conspicuum培養(yǎng)于22Γ之間。蟾蜍分枝桿菌 (Mycobacterium xenopi)禾口石氏分枝桿菌(Mycobacterium shimoidei)的最佳生長溫度為 45。C。細(xì)菌日內(nèi)瓦分枝桿菌(Mycobacterium genavense)、堪薩斯分枝桿菌(Mycobacterium kmsasii)、偶發(fā)分枝桿菌，鳥分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌，即鳥分枝桿菌(Mycobacterium avium)、胞內(nèi)分枝桿菌(Mycobacterium intracellulare)、嵌合分枝桿菌(Mycobacterium chimaera)以及 Mycobacterium colombiense 都培養(yǎng)于 37。C。更具體而言，在本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)方法中，將含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌的樣品在37°C的溫度下培養(yǎng)于上述分枝桿菌培養(yǎng)基中。本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)方法還涉及結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群以外的分枝桿菌，如上文所提到的那些分枝桿菌，特別是海分枝桿菌、鳥分枝桿菌復(fù)合群的種類、嗜血分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、膿腫分枝桿菌復(fù)合群的種類、日內(nèi)瓦分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌以及偶發(fā)分枝桿菌。在此，“結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌”表示結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌和其克隆或 BCG亞種、非洲分枝桿菌、MyccAacterium canettii、山羊分枝桿菌、田鼠分枝桿菌以及海豹分枝桿菌種類的細(xì)菌。有利的是，在本發(fā)明的分枝桿菌培養(yǎng)方法中，進(jìn)行下列4個(gè)階段-培養(yǎng)可能含有分枝桿菌的生物學(xué)樣品，直到細(xì)菌的生長是可檢測的，和-通過染色試驗(yàn)，優(yōu)選Ziehl-Neelsen或Kinyoun染色試驗(yàn)，鑒定所檢測的細(xì)菌是分枝桿菌屬的細(xì)菌，和-如有需要，通過分子分析，優(yōu)選通過質(zhì)譜分析法分析細(xì)菌蛋白的分子量，鑒定所述分枝桿菌屬的種類。Kinyoun染色包括雙染色，連續(xù)用堿性sushine (kisic fushine)處理和用亞甲藍(lán)處理。當(dāng)在藍(lán)色細(xì)胞背景下有紅色細(xì)菌染色時(shí)，染色是陽性的。所下文所解釋的，分子分析方法是分析細(xì)菌蛋白的方法，特別是通過利用質(zhì)譜分析法測定它們的分子量。然而，可選地，可能的是，借助于用對不同分枝桿菌種類具有特異性的探針/或擴(kuò)增引物的基因組(DNA或RNA)分子鑒定的經(jīng)典方法，特別是申請WO 2008/050064中所述。特別是，為了檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌，借助于稱為多間隔序列分型(multispacer sequence typing，在本文中縮寫為MST)的系統(tǒng)是可能的，所述系統(tǒng)由一系列結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌基因組非編碼基因間區(qū)(noncoding intergenic zone)的核酸的片段構(gòu)成，所述片段構(gòu)成了這樣的基因標(biāo)記，其允許通過分析稱為MST的所述區(qū)的片段的序列鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的不同種類并對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的一相同(one and the same)種類的分離物、特別是結(jié)核分枝桿菌的分離物進(jìn)行基因分型。有利的是，在不到15天內(nèi)，優(yōu)選在不多于10天內(nèi)，檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌生長因子。此外，本發(fā)明的培養(yǎng)基允許在不到1周內(nèi)檢測50%的所有各種主要的分枝桿菌種類，即海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群細(xì)菌，即細(xì)菌結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、Mycobacterium canettii、山羊分枝桿菌、海豹分枝桿菌以及田鼠分枝桿菌。在包括培養(yǎng)可能含有分枝桿菌和污染性細(xì)菌的生物學(xué)樣品的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述污染性細(xì)菌的生長抑制分枝桿菌的生長，所述方法的特征在于1/用氯己定對所述培養(yǎng)基中的所述樣品進(jìn)行有限時(shí)期的初步階段的初始凈化，以便將氯己定的作用限制在針對除了分枝桿菌以外的其他細(xì)菌的活性，優(yōu)選在氯己定溶液中處理約15分鐘，同時(shí)攪拌，和2/通過以下方法除去氯己定用中性緩沖液洗滌由階段1/因此處理的樣品，隨后離心并回收含有因此失活的污染性細(xì)菌和沒有失活的分枝桿菌的細(xì)胞團(tuán)，將所述細(xì)胞團(tuán)接種于上述分枝桿菌培養(yǎng)基中。以前，將作為凈化劑的氯己定的用途限于在固體培養(yǎng)基中凈化樣品，因?yàn)槁燃憾▽?dǎo)致液體培養(yǎng)基沉淀。此外，已知氯己定大體上對分枝桿菌是有毒性的。然而，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中卵磷脂的存在一方面使得避免或延遲液體培養(yǎng)基沉淀是可能的，另一方面，通過應(yīng)用所述洗滌階段2/，氯己定的時(shí)間限制作用使得抑制隨后的氯己定抗分枝桿菌的活性是可能的。然而，氯己定保存其抗共生菌群的細(xì)菌的主要活性，所述抗共生菌群的細(xì)菌在上文中稱為污染性細(xì)菌，其生長可抑制分枝桿菌的生長。特別是，對于已知是共生菌群的攜帶者的生物學(xué)樣品，如來自痰、皮膚活檢、大便樣品的樣品，它們代表了可用于分枝桿菌分析的95%的生物學(xué)樣品，應(yīng)用該初步凈化階段。 然而，對于諸如從血培養(yǎng)物或淋巴結(jié)活檢或肺活檢或骨活檢獲得的樣品的生物學(xué)樣品，并不需要該凈化。因此，當(dāng)所述分枝桿菌培養(yǎng)基是分枝桿菌的液體培養(yǎng)基時(shí)，上文的方法特別有利。當(dāng)所述生物學(xué)樣品是大便樣品時(shí)，上文的方法也特別有利。在一實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是上述分枝桿菌的液體培養(yǎng)基，并通過定期分析培養(yǎng)容器中氧濃度檢測所述分枝桿菌的生長。優(yōu)選地，最多每3小時(shí)，測量氧濃度，直到到達(dá)氧濃度的閾值，優(yōu)選與對應(yīng)于至少 IO4個(gè)細(xì)菌/ml的細(xì)菌生長一致。通過測量氧濃度檢測細(xì)菌的這一方法是已知的，并且自動檢測的裝置可商購獲得。取決于用于自動檢測的裝置，分枝桿菌的最小濃度不同并且通常對應(yīng)于IO3-IO4個(gè)分枝桿菌/ml的濃度，從所述最小濃度開始，檢測到顯著的氧消耗和因此氧濃度的顯著減低。在另一實(shí)施方案中，所述培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，且當(dāng)可在所述固體培養(yǎng)基上觀察到細(xì)菌菌落形式時(shí)，用肉眼檢測到所述分枝桿菌的生長。通常，觀察到細(xì)菌菌落的形成，對應(yīng)于IO6個(gè)細(xì)菌/ml的細(xì)菌濃度。在本發(fā)明方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，通過分子分析鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌的種類，所述分子分析包括分析通過質(zhì)譜分析法所獲得的蛋白特征譜，并將其與用培養(yǎng)于相同培養(yǎng)條件下的不同種類的分枝桿菌的參照菌株的樣品所獲得的一系列蛋白特征譜進(jìn)行比較。在此，“相同的培養(yǎng)條件”表示，對于分枝桿菌的一個(gè)相同種類，在相同的培養(yǎng)溫度下，使用相同的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供了培養(yǎng)和鑒定生物學(xué)樣品中分枝桿菌的方法，其特征在于將所述上文樣品培養(yǎng)于上述分枝桿菌液體培養(yǎng)基中，并為了進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)下列階段，直接由培養(yǎng)液分析通過雙離心所獲得的細(xì)菌團(tuán)a_通過在90°C以上，優(yōu)選在95°C，加熱1小時(shí)，優(yōu)選同時(shí)攪拌，滅活培養(yǎng)的生物學(xué)樣品懸浮液中的分枝桿菌，其中已經(jīng)檢測了所述樣品中的細(xì)菌的生長，和b-以低速、優(yōu)選500reV/min，對所述的培養(yǎng)的生物學(xué)樣品的上清液進(jìn)行第一次離心，其中已經(jīng)檢測了所述樣品中的細(xì)菌的生長，進(jìn)行所述第一次離心，直到所述樣品中所含的血液中的紅細(xì)胞發(fā)生沉淀，和C-由階段a_的第一次離心回收上清液，并以高速、優(yōu)選至少10，OOOrev/min、優(yōu)選約14，OOOrev/min，進(jìn)行第二次離心，進(jìn)行該第二次離心，以便獲得細(xì)菌團(tuán)的沉淀，和d-優(yōu)選地，用中性緩沖液，如PBS，洗滌來自階段b_的所述細(xì)菌團(tuán)，并進(jìn)行化學(xué)處理，優(yōu)選地用乙腈和三氟乙酸的混合物，以便從細(xì)菌中分離蛋白，從而使得它們可以通過質(zhì)譜分析法分析，以及e-回收來自階段d-的細(xì)菌蛋白團(tuán)，并將其存放在質(zhì)譜分析板上。階段a-的滅活方法經(jīng)證明，與階段e_中獲得質(zhì)量良好的質(zhì)譜相容。通過質(zhì)譜分析法直接從液體培養(yǎng)基的樣品鑒定的這一方法由于其快速性而特別有利，因?yàn)樵诂F(xiàn)有技術(shù)中，質(zhì)譜分析法僅用于分析直接從固體培養(yǎng)基采集的細(xì)菌菌株。因此，如果是培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基的臨床樣品，在通過質(zhì)譜分析法鑒定之前，再接種細(xì)菌并隨后將其培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基上，取決于分枝桿菌的類型，這另外花費(fèi)3-8周的時(shí)間，特別是對于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌而言，在所述固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)6-8周。根據(jù)本發(fā)明，可以直接由獲得自液體培養(yǎng)基的細(xì)菌團(tuán)進(jìn)行質(zhì)譜分析?？傊?，考慮到上文的加熱階段和離心階段a_至e_的時(shí)間，通過培養(yǎng)，在檢測所述細(xì)菌的生長后約1.5h，通過質(zhì)譜分析法獲得蛋白分析譜是可能的，所述蛋白分析譜，如上述，在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的情況下，可以在不多于15天甚至10天內(nèi)獲得。本發(fā)明還涉及快速確定分枝桿菌特別是結(jié)核分枝桿菌對抗生素的敏感性的表型的方法。結(jié)核的治療基于組合了 5種抗生素的綜合化學(xué)療法，所述5種抗生素為利福平、異煙胼、乙胺丁醇以及吡嗪酰胺，它們與鏈霉素一起稱為一線抗結(jié)核藥物。在全世界，已經(jīng)出現(xiàn)了抗利福平和抗異煙胼的稱為“多藥物抗性的”的結(jié)核桿菌菌株(MDR-TB)，和抗性廣泛的菌株O(DR-TB)，所述抗性廣泛的菌株O(DR-TB)是還對二線抗結(jié)核藥物(氟喹諾酮、氨基糖苷、卷曲霉素)有抗性的 MDR-TB 菌株[Gagneux S. Clin Infect Dis. 2009 ； 15 :S1 :66-68]。 在法國，它們的流行程度據(jù)估計(jì)為15%。術(shù)語“原發(fā)性抗性”指分離自從未接受抗結(jié)核治療的患者的抗性菌株，術(shù)語“繼發(fā)性抗性”指，分離自在分離菌株之前已經(jīng)由抗結(jié)核治療獲利的患者的抗性菌株[Schluger NW, Up-to-date 2009]。結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的抗性菌株造成了治療難題，因?yàn)樗鼈冃枰o予二線抗結(jié)核藥物，所述二線抗結(jié)核藥物具有以下缺陷(1)它們不及第一線抗結(jié)核抗生素有效，(2)與第一線抗結(jié)核抗生素相反，它們必須以胃腸外的方式給予，
(3)它們比第一線抗結(jié)核抗生素更具毒性。因?yàn)榻Y(jié)核的預(yù)后與有效抗生素的給藥有關(guān)，因此絕對需要以可能最短的延遲確定菌株對抗結(jié)核藥物的敏感性(抗菌譜)。檢測靶基因中突變存在的基因分型方法，基于并非廣泛可用的技術(shù)和專門技能[Woods GL, Warren NG, Inderlind CB. Susceptibility test methods !Mycobacteria, Nocardia, and other actinomycetes in Annual of Clinical Microbiology,9th edition(Nurray PR, Baren EJ, Jorgensen JH, Bry NL, Psaller MA. American Society for Microbiology, 2007, page 1223-1247]。對于除了利福平以外的抗生素，靶基因的突變和抗性表型之間的統(tǒng)計(jì)關(guān)聯(lián)非常低。這是為何對表型試驗(yàn)有這類興趣的原因。在液體培養(yǎng)基中，后者可以是自動化的；但是，該技術(shù)僅允許每種菌株試驗(yàn)一種或兩種濃度的抗生素，并且對結(jié)核分枝桿菌的抗性和污染性菌株間的混亂耐受[Anthony RM et al. Int J Tuberc Lung Dis. 2009 ;13 :1051-1053]。因此，優(yōu)選在固體培養(yǎng)基中進(jìn)行該試驗(yàn)，從而允許區(qū)分污染性菌落。這些試驗(yàn)基于，在存在已知濃度的抗生素的情況下，相對于無抗生素而生長的對照，結(jié)核分枝桿菌生長抑制的觀察。目前，在固體培養(yǎng)基中表型試驗(yàn)的限制是，獲得結(jié)果和操作大量結(jié)核分枝桿菌(3級致病菌)延遲3-4周，這對應(yīng)于每種所試驗(yàn)的抗生素的濃度一種培養(yǎng)基。本發(fā)明的固體培養(yǎng)基使得在存在抗生素的情況下減少結(jié)核分枝桿菌菌落的生長時(shí)間成為可能，并且因此快速獲得抗菌譜結(jié)果。此外，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，有利地使用進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌抗菌譜的E試驗(yàn)(E-test)方法是可能的。E試驗(yàn)(AB Biodisk, Solna, Sweden ； BioMerieux, Marcy-I' Etoile, France)由浸入了所研究的濃度梯度的抗生素的試紙條構(gòu)成，從而直接給出抑制細(xì)菌生長的濃度讀數(shù)(Minimum Inhibitory Concentration，MIC，最小抑制濃度)。對于在不同于本發(fā)明的培養(yǎng)基的參照培養(yǎng)基上的結(jié)核分枝桿菌，E試驗(yàn)是有效的[Esteban J. et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005 ;24 :856-857]，并且所述本發(fā)明固體培養(yǎng)基的特征不允許預(yù)測它是否適合進(jìn)行E試驗(yàn)。本發(fā)明已經(jīng)證明，本發(fā)明的固體培養(yǎng)基還允許比標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基更快速地進(jìn)行和更容易地讀取結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群抗生素敏感性和抗性的表型試驗(yàn)。因此，如實(shí)施例所述，本發(fā)明提供了用于分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和使其快速生長的培養(yǎng)基，供用于快速進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對抗結(jié)核抗生素敏感性的表型試驗(yàn)。更準(zhǔn)確地說，本發(fā)明提供了允許快速確定分枝桿菌對抗生素敏感性的表型的培養(yǎng)方法，根據(jù)所述方法，進(jìn)行下述階段i/_在不同的已知濃度的至少一種給定的抗生素存在的情況下，在所述培養(yǎng)基上， 培養(yǎng)上述分枝桿菌，優(yōu)選結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，和ii/-測定抑制所述分枝桿菌所有可見生長的抗生素的最小濃度(MIC 最小抑制濃度)，所述抗生素選自利福平、異煙胼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和鏈霉素。因此，如所述知的，對于每個(gè)分枝桿菌-抗生素對，可以測定最小抑制濃度或MIC， 并將其與患者可以無風(fēng)險(xiǎn)地接受且阻斷所討論的細(xì)菌菌株生長的抗生素的臨界濃度進(jìn)行比較。隨后按如下確定細(xì)菌對抗生素的敏感性或抗性。-如果MIC低于較低的臨界濃度，則細(xì)菌對抗生素敏感，和-如果MIC高于上部的臨界濃度，則細(xì)菌對所討論的抗生素有抗性。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，在階段i/_，將至少一試紙條放置在所述固體培養(yǎng)基上，其中沿著所述試紙條按濃度梯度浸有不同濃度的所述抗生素。具體而言，以至少IO4個(gè)菌落/ml、優(yōu)選IO6個(gè)菌落/ml的濃度，接種包含本發(fā)明固體培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿，然后將上述的試紙條置于所述培養(yǎng)基上，特別是，從頭到尾包含連續(xù)梯度的濃度漸增的抗生素E試驗(yàn)類型的試紙條，將所述抗生素的濃度直接寫在試紙條上，并且孵育上面具有試紙條的皮氏培養(yǎng)皿，在細(xì)菌生長抑制盤(disk)與試紙條的交叉點(diǎn)讀取MIC。根據(jù)其他已知的應(yīng)用方法，可以用浸入了臨界濃度的抗生素的印跡紙盤取代試紙條，以便證實(shí)盤周圍抑制圈的存在，從而確定菌株對抗生素是敏感的。根據(jù)另一已知的應(yīng)用變型，可以將抗生素以所述臨界濃度直接并入大部分所述固體培養(yǎng)基中，且可以將菌株在浸入了所述抗生素的固體培養(yǎng)基中的生長與一相同(one and the same)菌株在一不含有抗生素的相同固體培養(yǎng)基中的生長進(jìn)行比較，以證實(shí)在抗生素存在或不存在的情況下，所述培養(yǎng)基中細(xì)菌生長的存在或缺少，并且，如果在含有所述抗生素的固體培養(yǎng)基中觀察到菌株生長較少，則推論該菌株對抗生素是敏感的。通過閱讀下文給出的實(shí)施例，參考

圖1-7，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢會變得更明顯，其中圖1-4表示，對于參照培養(yǎng)基(圖1)和本發(fā)明的培養(yǎng)基而言(圖2-4)，如由1_10 所示，代表檢測結(jié)核分枝桿菌10株菌株的細(xì)菌數(shù)量的累積時(shí)間τ(以小時(shí)表示)的圖；圖5表示根據(jù)實(shí)施例2培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中的2個(gè)分枝桿菌菌落的照片；圖6表示在實(shí)施例中培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中的菌落的Ziehl-Neelsen染色的照片；圖7Α和7Β在實(shí)施例5中通過質(zhì)譜分析法所獲得的譜；圖8Α和8Β表示在參照固體培養(yǎng)基(圖8Α)和與浸入了抗生素的印跡試紙條接觸的本發(fā)明的固體培養(yǎng)基(圖8Β)上細(xì)菌生長的照片。實(shí)施例1 結(jié)核組分枝桿菌在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)在本實(shí)施例中，本發(fā)明人在具有補(bǔ)充物F和PANTA的Middlebrook 7Η9參照培養(yǎng)基(Becton-Dickinson，Grenoble, France)和自己發(fā)明的三種培養(yǎng)基之一中，并行接種結(jié)核分枝桿菌的菌株，對于40ml的瓶而言，所述三種培養(yǎng)基之一的組成在下文給出，試驗(yàn)以所述40ml的體積進(jìn)行實(shí)施例IA 培養(yǎng)基B25%的最終組成(對于IOOOml而言)I-Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基無菌蒸餾水750ml硫酸銨IgL-谷氨酸0.5g枸櫞酸鈉0. Ig吡哆醇Img生物素0.5mg磷酸氫二鈉2. 5g磷酸二氫鉀Ig枸櫞酸鐵銨0. Ig硫酸鎂0.05g
氯化鈣0.5mg￠1 酸鋅lmg硫酸銅Img酪蛋白水解產(chǎn)物Ig補(bǔ)充物H:3g甘油Ig聚山梨醇酯80 :0. 05g氯高鐵血紅素0. 005g2-附加生長因子乳酸168mg聚氧乙烯硬脂酸酯1 IOmg牛血清白蛋白5. 6g葡萄糖IlOOmg生物素0.57mg3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素多粘菌素40 000個(gè)單位萘啶酮酸16mg甲氧芐啶4mg阿洛西林4mg萬古霉素20mg兩性霉素B:4mg4-本發(fā)明的其他成分去補(bǔ)體胎牛血清250ml去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.5g實(shí)施例IB 培養(yǎng)基C15%的最終組成(對于IOOOml而言)I-Middlebrook 7H9 medium無菌蒸餾水750ml硫酸銨IgL-谷氨酸0. 枸櫞酸鈉0. Ig[1比唆酉事Img生物素0.5mg磷酸氫ニ鈉2. 5g磷酸ニ氫鉀Ig枸櫞酸鐵銨0. Ig硫酸鎂0.O5g氯化鈣0.5mg硫酸鋅Img
硫酸銅Img酪蛋白水解產(chǎn)物lg補(bǔ)充物H:3g甘油Ig聚山梨醇酯80 :0. 05g氯高鐵血紅素0. 005g2-附加生長因子乳酸168mg聚氧乙烯硬脂酸酯1 IOmg牛血清白蛋白5. 6g葡萄糖IlOOmg生物素0.57mg3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素多粘菌素40 000個(gè)單位萘啶酮酸16mg甲氧芐啶4mg阿洛西林4mg萬古霉素20mg兩性霉素B:4mg4-本發(fā)明的附加成分去補(bǔ)體胎牛血清150ml去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.5g實(shí)施例IC :培養(yǎng)基D5%的最終組成(對于IOOOm而言)I-Middlebrook 7H9 培養(yǎng)基無菌蒸餾水750ml硫酸銨IgL-谷氨酸0. 枸櫞酸鈉0. Ig批唆醇Img生物素0.5mg磷酸氫ニ鈉2. 5g磷酸ニ氫鉀Ig枸櫞酸鐵銨0. Ig硫酸鎂0.O5g氯化鈣0.5mg硫酸鋅Img硫酸銅Img酪蛋白水解產(chǎn)物Ig
補(bǔ)充物H:3g甘油Ig聚山梨醇酯80 :0. 05g氯高鐵血紅素0. 005g2-其他生長因子乳酸168mg聚氧乙烯硬脂酸酯IlOmg牛血清白蛋白5. 6g葡萄糖IlOOmg生物素0.57mg3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素多粘菌素40 000個(gè)單位萘啶酮酸16mg甲氧節(jié)啶4mg阿洛西林4mg萬古霉素20mg兩性霉素B :4mg4-本發(fā)明的附加組分去補(bǔ)體胎牛血清50ml去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.5g在本實(shí)施例中，將10株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株并行接種于對照培養(yǎng)基A0%和三種稱為B25%、C15%以及D5%的本發(fā)明的培養(yǎng)基中。這10株菌株包含6株對抗結(jié)核抗生素敏感的菌株、抗鏈霉素和抗異煙胼的結(jié)核分枝桿菌菌株No. 9、抗鏈霉素和抗利福平的結(jié)核分枝桿菌菌株No. 10和抗鏈霉素、抗利福平、抗乙胺丁醇以及抗異煙胼的2株結(jié)核分枝桿菌菌株No. 11和No. 12 (所謂的多藥物抗性MDR菌株)。對于一相同(one and the same) 菌株，將相同的接種體并行接種于這4種培養(yǎng)基中。在孵育于37°C的恒定溫度下的BACTEC 9000MB自動培養(yǎng)箱(Becton-Dickinson, Grenoble, France)中的玻璃瓶中，制備液體培養(yǎng)基。以相同的菌株，將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。自動培養(yǎng)箱檢測瓶中氧消耗即細(xì)菌生長標(biāo)志的存在， 并表示所述檢測和將瓶置于自動培養(yǎng)箱中之間的時(shí)間。該時(shí)間是本實(shí)施例所用的標(biāo)準(zhǔn)。因此本實(shí)施例中的評估標(biāo)準(zhǔn)是待通過BACTEC 9000MB自動培養(yǎng)箱檢測的所鑒定的分枝桿菌生長所花費(fèi)的時(shí)間。在本實(shí)施例中，對來自瓶中的上清液進(jìn)行革蘭氏染色(以證實(shí)缺少污染性細(xì)菌)， 對來自瓶中的上清液的進(jìn)行Kinyoim染色(以證實(shí)存在醇酸抗性細(xì)菌，這是分枝桿菌的特征)，隨后通過實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌有特異性的插入序列IS6110，之后，證實(shí)通過自動培養(yǎng)箱檢測分枝桿菌的特異性。根據(jù)以下方案，進(jìn)行Kinyoim染色在制備細(xì)胞涂片載玻片(cytospin slide)后， 將載玻片浸入甲醇中l(wèi)Omin，然后將其浸入Kinyoun溶液(堿性Fushine 40g、苯酚80ml、乙醇200ml、水，終體積1升)，3小時(shí)。在用水漂洗后，將載玻片用Gabett溶液(亞甲藍(lán)10g、硫磺酸60° B 200ml、無水乙醇300ml以及水，終體積500ml)覆蓋5分鐘，用水漂洗，干燥、 并用光學(xué)顯微鏡在X1000放大倍率下讀數(shù)。當(dāng)在藍(lán)色細(xì)胞背景中存在紅色細(xì)菌染色時(shí)，染色是陽性的。對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌具特異性的插入序列IS6110描述于[van Embden JD et al.Strain identification of Mycobacterium tuberculosis by DNA Fingerprinting-recommendation for a standardized methodology. J. Clin. Microbiol. 1993 ；31 :406-409]中。本發(fā)明人還觀察到，添加5 %、15 %或25 %的去纖維蛋白的綿羊血液不誘導(dǎo)自動培養(yǎng)箱所檢測的A消耗，因此無假陽性；該實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3次。本發(fā)明人因此試驗(yàn)了從公共收集物(public collection)獲得的分枝桿菌屬幾個(gè)種類的標(biāo)準(zhǔn)菌株，以及來自自己實(shí)驗(yàn)室診斷活性的一些臨床菌株，包括海分枝桿菌菌株。標(biāo)準(zhǔn)菌株是結(jié)核分枝桿菌H37RV、牛分枝桿菌CIP 105050、牛分枝桿菌BCG牛痘 CIP 105060、非洲分枝桿菌CIP 105147τ、海豹分枝桿菌CIP 7177、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種 (M. avium ssparatuberculosis) ATCC 196981"。與Middlebrook 7Η9培養(yǎng)基相比，在用本發(fā)明的培養(yǎng)基培養(yǎng)的情況下，檢測時(shí)間總是減少，特別是對于非洲分枝桿菌，時(shí)間從375小時(shí)減少到55小時(shí)，對于海豹分枝桿菌， 時(shí)間從336小時(shí)減少到四小時(shí)，并且對于牛分枝桿菌，時(shí)間從450小時(shí)減少到35小時(shí)。對于結(jié)核分枝桿菌種類，本發(fā)明人小心試驗(yàn)了對抗結(jié)核藥物敏感的臨床菌株和對某些抗結(jié)核藥物敏感的臨床菌株。這些試驗(yàn)的結(jié)果顯示于圖1-4的圖表中，其在縱坐標(biāo)上表示結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群不同種類菌株的數(shù)量，在橫坐標(biāo)上表示，相對于參照培養(yǎng)基Α0% (圖1)，對于本發(fā)明3種培養(yǎng)基中的每一種(培養(yǎng)基Β25% (圖2)、C15% (圖3)以及D5% (圖4))，檢測縱坐標(biāo)上所示的高達(dá)10株不同的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群種類的菌株的數(shù)量的、以小時(shí)表示的累積時(shí)間。這些圖表表示1/-本發(fā)明的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌的優(yōu)越性，因?yàn)橄鄬τ趨⒄张囵B(yǎng)基，在本發(fā)明的培養(yǎng)基中，觀察細(xì)菌生長檢測的培養(yǎng)時(shí)間較少，2/_事實(shí)是，本發(fā)明的培養(yǎng)基允許獨(dú)立于結(jié)核分枝桿菌菌株的抗結(jié)核抗生素抗性的特征培養(yǎng)所述菌株。在不到15天或甚至不到10天內(nèi)，檢測細(xì)菌生長總是可能的。而且，用本發(fā)明的培養(yǎng)基，允許檢測50%所接種的菌株的中值時(shí)間小于或等于一周。實(shí)施例2 分枝桿菌在固體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)在本實(shí)施例中，本發(fā)明人用3株結(jié)核分枝桿菌的臨床菌株并行接種不同的含有瓊脂的固體培養(yǎng)基。所述培養(yǎng)基是(I)Middlebrook 7H10，加瓊脂0. 5%，(2)Middlebrook 7H10，加瓊脂1%、加5%去纖維蛋白的綿羊血液、加5%胎牛血清、加0. 5%卵卵磷脂，(3) Middlebrook 7H10，加瓊脂0. 5 %、加5 %去纖維蛋白的綿羊血液、加15 %胎牛血清、加 0. 5 %卵卵磷脂，(4)Middlebrook 7H10,加瓊脂0. 5 %、加5 %去纖維蛋白的綿羊血液、加 25%胎牛血清、加0. 5%卵卵磷脂。系統(tǒng)地并行使用兩種對照瓊脂，即瓊脂Middlebrook 7H10加瓊脂和瓊脂Middlebrook 7H10加瓊脂1%、加5%去纖維蛋白的綿羊血液、加5%胎牛血清、加0.5%卵卵磷脂。于37°C在含有5% CO2的空氣中、在防止脫水的塑料袋中， 孵育對照瓊脂(沒有接種)和接種的瓊脂。每天檢查瓊脂。本實(shí)施例所用的評估標(biāo)準(zhǔn)是出現(xiàn)菌落的時(shí)間，所述菌落是肉眼檢查瓊脂所檢測的，并通過Ziehl-Neelsen染色和測序證實(shí)為結(jié)核分枝桿菌菌落。所用的固體培養(yǎng)基具有下列組成為了明確證實(shí)菌落的出現(xiàn)，本發(fā)明人對所述菌落進(jìn)行照相。然后，本發(fā)明人對來自所述菌落的樣品，以及離開所述菌落，對來自物菌落的相同瓊脂的一區(qū)域的樣品進(jìn)行 Kinyoun染色。在所有的情況下，離開所述菌落，都檢測不到醇酸抗性細(xì)菌，而在菌落中檢測到所述細(xì)菌。菌落的實(shí)例如圖6所示。圖5.表示用結(jié)核分枝桿菌的臨床菌株10天前接種的含有瓊脂的培養(yǎng)基C15%，顯示2個(gè)菌落(圓)。圖6.表示，對在10天內(nèi)從固體培養(yǎng)基C15%中的結(jié)核分枝桿菌的臨床菌株獲得的菌落進(jìn)行的Ziehl-Neelsen染色。實(shí)施例2A :1000ml的固體培養(yǎng)基B25%
I-Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基
無菌蒸餾水750ml
硫酸銨:0. 50g
磷酸二氫鉀1. 50mg
磷酸氫二鈉1. 50g
枸櫞酸鈉0. 4g
硫酸鎂:0. 025g
氯化鈣0. 00050g
硫酸鋅:0. OOlOg
硫酸銅:0. OOlOg
L-谷氨酸:0. 50g
枸櫞酸鐵銨0. 04g
吡哆醇鹽酸鹽0. OOlOg
生物素0. 000050g
孔雀綠0. 0000250g
瓊脂15g
2-附加生長因子
氯化鈉:8. 50g
牛白蛋白(級份V) :50g
葡萄糖20g
過氧化氫酶:0. 030g
油酸0. 60ml
甘油0. 5%
3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素
多粘菌素40 000個(gè)單位兩性霉素B :4mg萘啶酮酸16mg甲氧芐啶4mg阿洛西林:4mg萬古霉素20mg4-本發(fā)明的附加成分去補(bǔ)體胎牛血清250ml去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.50g實(shí)施例2B :1000ml的固體培養(yǎng)基C15% I-Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基無菌蒸餾水750ml硫酸銨0.50g磷酸二氫鉀1.50mg磷酸氫二鈉1.50g枸櫞酸鈉0. 4g硫酸鎂0.025g氯化鈣0.00050g硫酸鋅0.OOlOg硫酸銅0.OOlOgL-谷氨酸0. 50g枸櫞酸鐵銨0. 04g吡哆醇鹽酸鹽0. OOlOg生物素0.000050g孔雀綠0.0000250g瓊月旨15g2-附加生長因子氯化鈉8.50g牛白蛋白(級份V) :50g葡萄糖20g過氧化氫酶0. 030g油酸0. 60ml甘油0.5%3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素多粘菌素40. 000個(gè)單位兩性霉素B :4mg萘啶酮酸16mg甲氧芐啶4mg西林4mg萬古霉素20mg4-本發(fā)明的附加成分去補(bǔ)體胎牛血清150ml去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.50g實(shí)施例2C :1000ml的固體培養(yǎng)基D5% I-Middlebrook 7H10 培養(yǎng)基無菌蒸餾水750ml硫酸銨0.50g磷酸二氫鉀1.50mg磷酸氫二鈉1.50g枸櫞酸鈉0. 4g硫酸鎂0.025g氯化鈣0.00050g硫酸鋅0.OOlOg硫酸銅0.OOlOgL-谷氨酸0. 50g枸櫞酸鐵銨0. 04g吡哆醇鹽酸鹽0. OOlOg生物素0.000050g孔雀綠0.0000250g瓊脂15g2-附加生長因子氯化鈉8.50g牛白蛋白(級份V) :50g葡萄糖20g過氧化氫酶0. 030g油酸0. 60ml甘油0.5%3-無抗分枝桿菌和抗真菌活性的抗生素多粘菌素40. 000個(gè)單位兩性霉素B :4mg萘啶酮酸16mg甲氧芐啶4mg阿洛西林4mg萬古霉素20mg4-本發(fā)明的附加成分去補(bǔ)體胎牛血清50ml
去纖維蛋白的綿羊血液50ml卵磷脂0.50g實(shí)施例3 分枝桿菌的凈化和液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)必須從通常污染有共生菌群的臨床樣品中分離和培養(yǎng)分枝桿菌，例如在為實(shí)驗(yàn)室內(nèi)最常見的痰樣品的情況下，或大便樣品。幾個(gè)凈化方法已經(jīng)在文獻(xiàn)中提出。它們基本上包括用氫氧化鈉凈化。用與二硫蘇糖醇混合的2% N-乙?；?L-半胱氨酸預(yù)處理使得將氫氧化鈉的終濃度減少為-2%成為可能。本發(fā)明人的有關(guān)分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌、特別是從大便樣品中分離的經(jīng)歷是，該方案不能提供令人滿意的凈化， 特別是對于大便樣品的凈化。因此，本發(fā)明人試驗(yàn)了另一種基于使用氯己定的方案，即用于從患有粘液粘稠病的患者的呼吸樣品分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群外的分枝桿菌的凈化 [Ferroni A， Vu-Thien H， Lanotte P， Le Bourgeois M， Sermet-Gaudelus I， Fauroux B， Marchand SiVaraigne FiBerche PiGaillard JL,Offredo C. Value of the chlorhexidine decontamination method for recovery of nontuberculous mycobacteria from sputum samples of patients with cystic fibrosis. J Clin Microbiol· 2006 ;44 :2237-9]。然而，該方法在接種含有卵的固體培養(yǎng)基(羅氏培養(yǎng)基，例如Coletsos培養(yǎng)基)的過程中進(jìn)行，但不用于液體培養(yǎng)基?？墒?，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的液體培養(yǎng)基與用于滅活抑制分枝桿菌生長的污染性細(xì)菌的氯己定凈化相容，而不抑制分枝桿菌的生長，如下文所述。從20%葡萄糖酸氯己定(chlorhexidine digluconate, Sigma, Illkirch,France) 開始，通過在無菌蒸餾水即時(shí)稀釋，本發(fā)明人制備并使用的葡萄糖酸氯己定。稀釋的氯己定保存M小時(shí)。凈化方案如下-在50-ml !^alcon 管中制備 5ml 樣品，-添加3體積(即15ml)葡萄糖酸氯己定-渦旋-在攪拌器上于室溫下攪拌15min-添加30mlpH 6. 8的磷酸鹽緩沖液-通過倒置搖動-以 3500rev/min 離心 20min-輕輕倒出上清液-將沉淀置于500μ 1 pH 6. 8的磷酸鹽緩沖液中-渦旋-200-300 μ 1該懸浮液/瓶的比率接種。該方案成功地用于用作全分枝桿菌屬的對照菌株的戈氏分枝桿菌 (Mycobacterium gordonae)的臨床菌株。實(shí)施例4 通過在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)臨床樣品分離分枝桿菌在本實(shí)施例中，本發(fā)明人并行比較了自己發(fā)明的培養(yǎng)基與用于從在 Ziehl-Neelsen染色后表現(xiàn)出醇酸抗性細(xì)菌存在的臨床樣品中分離結(jié)核分枝桿菌分枝桿菌的參照培養(yǎng)基。根據(jù)醫(yī)藥文獻(xiàn)已知，醇酸抗性細(xì)菌的存在是樣品的接種體> IO4分枝桿菌/mL 的證據(jù)[Hobby GL, Holman AP, Iseman MD, Jones JM. Enumeration of tuberclebacilli in sputum of patients with pulmonary tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 1973 ；4 :94-104]。在本實(shí)施例中，本發(fā)明在下述培養(yǎng)基中并行接種了用氫氧化鈉凈化的表現(xiàn)出表示分枝桿菌的醇酸抗性細(xì)菌的各種臨床樣品=Middlebrook 7H9培養(yǎng)于，其添加有 Becton-Dickinson銷售的抗生素和兩性霉素B (抗真菌劑)與字母縮略PANTA的混合物， 以及實(shí)施例1的培養(yǎng)液，其包含Middlebrook培養(yǎng)基7H9-PANTA、加5%去纖維蛋白的綿羊血液、25%去補(bǔ)體胎牛血清加0. 5%卵卵磷脂。將所述培養(yǎng)基包含于并行孵育在37°C的 BACTEC 9000MB自動培養(yǎng)箱中的瓶中，同時(shí)如上述檢測氧消耗。如上述，證實(shí)分枝桿菌的存在并鑒定它們。所用的評估標(biāo)準(zhǔn)是用于通過BACTEC 9000MB自動培養(yǎng)箱檢測分枝桿菌生長的時(shí)間。通過在Middlebrook 7H9加血液中培養(yǎng)3. 22天，對比Middlebrook 7H9中培養(yǎng) 5天，檢測支氣管抽吸樣品；通過在Middlebrook 7H9加血液中培養(yǎng)8天和在Middlebrook 7H9中培養(yǎng)13天，檢測痰樣品；通過在Middlebrook 7H9加血液中培養(yǎng)4. 52天和在 Middlebrook 7H9中培養(yǎng)7. 34天，檢測支氣管肺泡灌洗樣品。本實(shí)施例說明了本發(fā)明的培養(yǎng)基分離分枝桿菌特別是分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌的優(yōu)越性。這構(gòu)成了對用于診斷和預(yù)后的時(shí)間的重要的結(jié)果。^MM^通過質(zhì)譜分析法直接從液體培養(yǎng)基鑒定分枝桿菌由液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)物鑒定分枝桿菌目前基于Ziehl染色，隨后根據(jù)文獻(xiàn)所公開的各種方法進(jìn)行分子鑒定。這些方法的局限是它們數(shù)個(gè)小時(shí)G-24小時(shí))的時(shí)間和花費(fèi)。本發(fā)明人設(shè)想，利用通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行的蛋白特征譜分析鑒定細(xì)菌，用于根據(jù)本發(fā)明的培養(yǎng)基之一直接從培養(yǎng)瓶的上清液快速鑒定結(jié)核分枝桿菌。實(shí)際上，通過質(zhì)譜分析法分析蛋白特征譜目前僅研發(fā)用于分離和培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基中的分枝桿菌菌株，而未用于包含培養(yǎng)于固體或液體培養(yǎng)基中的分枝桿菌的生物學(xué)樣品的培養(yǎng)物[Hettick JM, Kashon ML, Simpson JP, Siegel PD, Mazurek GH, Weissman DN. Proteomic profiling of intact mycobacteria by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 2004 ；76 :5769-76 ；Hettick JM, Kashon ML，Slaven JE, Ma Y， Simpson JP, Siegel PD, Mazurek GN, Weissman DN.Discrimination of intact mycobacteria at the strain level :a combined MALDI-TOF MS and biostatistical analysis. Proteomics. 2006 ；6 :6416-25 ；Pignone M，Greth KM，Cooper J，Emerson D， Tang J.Identification of mycobacteria by matrix-assisted laser desorption ionization-time—of-flight mass spectrometry.J Clin Microbiol. 2006 ；44 1963-70]。使用質(zhì)譜分析法直接在它們的培養(yǎng)的生物學(xué)樣品中快速鑒定結(jié)核分枝桿菌分枝桿菌遇到許多困難，這些困難與一旦將樣品收集于液體培養(yǎng)基的瓶中需要滅活分枝桿菌而不改變它們的蛋白特征譜有關(guān)。例如使用在具有2. 5%三氟乙酸(TFA)或具有戊二醛的培養(yǎng)基中滅活分枝桿菌的幾個(gè)方案，未提供區(qū)別性的譜。最后，本發(fā)明人利用下文詳述的熱滅活方案獲得鑒定譜。制備用于通過質(zhì)譜分析法檢測和鑒定本發(fā)明培養(yǎng)基中分枝桿菌培養(yǎng)基的方案如下
1-在安全水平為P3的實(shí)驗(yàn)室，從培養(yǎng)瓶中取5ml上清液置于5個(gè)無菌管(lml/ 管)中2-于 95 °C 加熱 Ih3-從P3實(shí)驗(yàn)室取出4-以 500rev/min 的低速離心 15min5-從5個(gè)管中的每一個(gè)管中回收上清液，并置于新的無菌管中6-以14000rev/min的高速，離心上清液10分鐘7-棄去上清液8-用lml PBS洗滌顆粒9-以 14000rev/min 離心 10 分鐘10-棄去上清液11-添力口 5yL 20% 三氟乙酸(TFA)12-添加 5 μ 1 100% 乙腈13-靜置 IOmin14-渦旋15-將1 μ 1混合物存放于質(zhì)譜分析板上16-靜置干燥17-存放1 μ 1基質(zhì)溶液18-靜置干燥19-對板進(jìn)行質(zhì)譜分析。對于每個(gè)樣品，本發(fā)明人在質(zhì)譜儀平板上并行做了 4次存放。存放物用2yL基質(zhì)溶液覆蓋，即α-氰基-4-羥基肉桂酸在50%乙腈中的飽和溶液和2. 5%三氟乙酸的飽和溶液。使基質(zhì)溶液在室溫下結(jié)晶5分鐘。利用裝備有337nm波長的氮激光Autoflex II分光計(jì)(Bruker Daltonik)，進(jìn)行質(zhì)譜分析。以線性模式記錄譜型(時(shí)間170ns、離子源I(ISl)電壓20kV ；離子源2(IS2)電壓18. 5kV ；鏡頭電壓7kV ；分子量介于2_20kDa)。 自動模式下以可變的激光電源和30-60秒/存放物的收集時(shí)間675次放電(firing)后， 獲得每個(gè)譜型。自動數(shù)據(jù)采集由AutoXecute收集對照軟件提供。對于每個(gè)樣品，將4個(gè)獲得的譜型輸入BioTyper版本2.0軟件(Bruker Daltonik GmbH)，并利用缺省參數(shù)進(jìn)行分析。將譜型與本發(fā)明人制備的分枝桿菌的本地譜型庫進(jìn)行比較。選擇代表在文獻(xiàn)中和以本發(fā)明人的經(jīng)歷主要在人類病理學(xué)中發(fā)現(xiàn)的組/種類的分枝桿菌的種類，即鳥分枝桿菌鳥亞種(Mycobacterium avium ss avium)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(Mycobaterium avium ss paratuberculosis)作為緩慢升值的分枝桿菌,和恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmalis)作為快速生長的分枝桿菌。所述分析方法包括介于3_15kDa之間的m/z比。圖7A-7D表示在質(zhì)譜分析法中由本發(fā)明的液體培養(yǎng)基的培養(yǎng)物獲得的不同分枝桿菌菌株的譜型。圖7A和7B表示通過質(zhì)譜分析法由培養(yǎng)于本發(fā)明的液體培養(yǎng)基B25 %中的10株結(jié)核分枝桿菌臨床菌株獲得的蛋白特征譜。圖7C表示從相同的未接種的液體培養(yǎng)基B25%獲得的陰性對照譜型，并用于比較。圖7D從相同的本發(fā)明液體培養(yǎng)基B25%獲得的譜型，所述培養(yǎng)基接種有鳥分枝桿菌鳥亞種(11)、鳥分枝桿菌副結(jié)核亞種(1 以及恥垢分枝桿菌(13)。對于相同結(jié)核分枝桿菌種類的不同的上述的菌株的圖7A和7B的譜型，表現(xiàn)出菌株間很大的可再現(xiàn)性，而且不同于圖7D的其他分枝桿菌菌株的譜型，另一方面，不同于圖 7C中的對照。比較圖7A-7D中的譜型，就會觀察到，對于結(jié)核分枝桿菌而言，特異性地獲得對應(yīng)于具有下列分子量的4種蛋白的峰(單位道爾頓)8548士 1、62觀士 1、6025士 15415士 1。制備用于通過質(zhì)譜分析法檢測和鑒定本發(fā)明固體培養(yǎng)基中分枝桿菌培養(yǎng)基的方案如下1-搖動后，從瓶中取Iml上清液，置于無菌管中2-通過于95°C加熱1小時(shí)，滅活分枝桿菌3-以500rpm的低速離心15分鐘4-將上清液回收于新的無菌管中5-以14000rev/min將上清液離心10分鐘6-棄去上清液7-用Iml緩沖溶液PBS洗滌顆粒8-以 14000rpm 離心 10 分鐘9-棄去上清液10-添加 5 μ L 20% TFA11-添加 5 μ 1 100% 乙腈12-靜置10分鐘13-渦旋 14-將1 μ 1混合物存放于光譜測定板上15-靜置干燥16-存放1 μ 1基質(zhì)溶液17-室溫下靜置干燥10分鐘18-對板進(jìn)行質(zhì)譜分析。所有操作必須在排風(fēng)罩下、在全安全裝備(帽子、面罩、防護(hù)服(over-jacket)和手套)中進(jìn)行。實(shí)施例6 結(jié)核分枝桿菌對抗生素的敏感性的表型測定a/-方法本發(fā)明人試驗(yàn)了在其臨床微生物實(shí)驗(yàn)室中在常規(guī)診斷中從呼吸樣品分離的結(jié)核分枝桿菌種類的6株臨床菌株。通過其Ziehl染色后的成串特征形態(tài)、隨后通過PCR擴(kuò)增以及基因間間隔區(qū)測序，將這6株菌株鑒定為結(jié)核分枝桿菌種類[Djelouadji Z et al. A Single-Step Sequencing Method for Identification of Mycobacterium tuberculosis Complex Species. PLoS Negl Trop Dis. 2008 Jun 18 ；2 (6) :e253]。在固體培養(yǎng)基中利用參照表型試驗(yàn)，對于所試驗(yàn)的4種抗生素，僅試驗(yàn)了所謂的臨界濃度異煙胼0. 2μ g/ml ；利福平lyg/ml ；乙胺丁醇5 μ g/ml以及鏈霉素5 μ g/ml，這6株菌株經(jīng)試驗(yàn)對一線抗生素敏感。[Woods GL,ffarren NG,Inderlind CB. Susceptibility test methods !Mycobacteria, Nocardia, and other Actinomycetes in:Manual of Clinical Microbiology,9thedition(Nurray PR, Baren EJ, Jorgensen JH, Bry NL, Pfaller MA. American Society for Microbiology, 2007, page 1223-1M7]。并行試驗(yàn)了在固體培養(yǎng)基中通過參照方法所測定的抗抗結(jié)核藥物的臨床菌株(利福平的最小抑制濃度> 1 μ g/ml) [Woods GL, Warren NG, Inderlind CB. Susceptibility test methods !Mycobacteria，Nocardia，and other Actinomycetes in Manual of Clinical Microbiology,9th edition(Nurray PR，Baren EJ，Jorgensen JH，Bry NL，Pfaller MA. American Society for Microbiology,2007,page 1223-1M7)。將這些菌株以IO6菌落/ml的濃度懸浮于無菌的磷酸鹽緩沖液中。根據(jù)上文的實(shí)施例2B，將懸浮液并行用于充滿含有參照標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基即補(bǔ)充有油酸、白蛋白、葡萄糖和過氧化氫酶(OADC)的混合物的Middlebrook 7H10培養(yǎng)基的無菌皮氏培養(yǎng)皿和含有本發(fā)明的15%固體培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿。本發(fā)明人使用稱為Ε-test (Biomerieux,France)的系統(tǒng)確定菌株對各種抗生素的敏感性。該系統(tǒng)由試紙條構(gòu)成，連續(xù)濃度梯度的抗生素(異煙胼或乙胺丁醇)沿著所述試紙條浸入所述試紙條。該裝置允許肉眼讀取這樣的濃度，即從所述濃度開始，不再觀察到結(jié)核分枝桿菌的生長，因此對于正試驗(yàn)的結(jié)核分枝桿菌而言，限定了抗生素(異煙胼或乙胺丁醇)的最小抑制濃度。在含有5% CO2空氣中，于37°C，將皮氏培養(yǎng)皿孵育2周，同時(shí)從孵育的第6天開始，每天觀察?；谒鼈兊耐庥^和Ziehl染色后，表現(xiàn)出成串的醇酸抗性細(xì)菌，證實(shí)所述菌落為結(jié)核分枝桿菌。在含有濃度高于最小抑制濃度的抗生素區(qū)的試紙條周圍，形成細(xì)菌生長抑制盤，這可以理解為，后者可以通過試紙條與抑制盤的交叉點(diǎn)測定。b/_ 結(jié)果:本發(fā)明人觀察到-(1)結(jié)核分枝桿菌菌落在本發(fā)明的培養(yǎng)基上孵育7天后和在參照培養(yǎng)基上孵育 11天后出現(xiàn)，-( 在7本發(fā)明的培養(yǎng)基上孵育7天后，在這些條件下，E試驗(yàn)讀數(shù)是可能的，因?yàn)榇嬖谠试S讀數(shù)的足夠數(shù)量的菌落和菌落間非常好的對比，所述對比在本發(fā)明培養(yǎng)基的紅色背景下看起來呈灰色；而由于菌落在參照培養(yǎng)基中的不完全生長和菌落顏色(半透明) 與參照培養(yǎng)基間的低劣對比，在參照培養(yǎng)基上孵育11天后，讀數(shù)僅是局部的且困難的，-(3)本發(fā)明培養(yǎng)基中所獲得的異煙胼和乙胺丁醇E試驗(yàn)的結(jié)果與預(yù)先通過參照方法所獲得的結(jié)果相似，-(4)在本發(fā)明的培養(yǎng)基中所獲得的異煙胼和乙胺丁醇E試驗(yàn)的結(jié)果比參照試驗(yàn)的結(jié)果更準(zhǔn)確，從而允許測定真實(shí)的最小抑制濃度。本實(shí)驗(yàn)證明，通過使用本發(fā)明的固體培養(yǎng)基，根據(jù)E試驗(yàn)方法，進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌對抗結(jié)核藥物的敏感性的表型試驗(yàn)，能夠比在固體參照培養(yǎng)基上進(jìn)行E試驗(yàn)更快速且更便利。圖8A和8B表示在接種結(jié)核分枝桿菌種類的一相同(one and the same)菌株后孵育的含有參照培養(yǎng)基(圖8A)和本發(fā)明培養(yǎng)基的(圖8B)皮氏培養(yǎng)皿的照片，表現(xiàn)出存在結(jié)核分枝桿菌菌落，所述菌落在本發(fā)明的培養(yǎng)基中7天后易于可見(圖.8B)，但在參照培養(yǎng)基上在11天后難以觀察(圖.8A)，從而允許方便地讀取第一試紙條上的異煙胼(IZ)和第二試紙條上的乙胺丁醇(ET)的抑制濃度。在圖8A和8B中，我們可以觀察到，在試紙條周圍，在部分含有抑制濃度的抗生素的試紙條周圍卵形盤形式的細(xì)菌生長抑制圈，以致所述抑制圈的較低界限與試紙條的交叉點(diǎn)使得在色調(diào)漸降試紙條上讀取抗生素的最小抑制濃度成為可能。
權(quán)利要求
1.分枝桿菌培養(yǎng)基，包含分枝桿菌生長因子并優(yōu)選地包含無抗分枝桿菌活性的抗生素，其特征在于其包含下列附加成分-卵磷脂，和-去纖維蛋白血液，和-去補(bǔ)體胎牛血清。
2.權(quán)利要求1所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所含的所述卵磷脂的重量比為 0. 1-5%，優(yōu)選 0. 5-1%。
3.權(quán)利要求2所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述卵磷脂是蛋黃卵磷脂。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所含的所述血液的體積比為 2. 5-15%，優(yōu)選 5-10%。
5.權(quán)利要求4所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述血液是去纖維蛋白兔血液或優(yōu)選地去纖維蛋白綿羊血液。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所含的所述去補(bǔ)體胎牛血清的體積比為2. 5-25%，優(yōu)選10-20%。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于其包含分枝桿菌的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基除了蒸餾水外還包含下列成分硫酸銨、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、 枸櫞酸鈉、枸櫞酸鐵銨、氯化鈉、氯化鈣、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、L-谷氨酸、生物素和吡哆
8.權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述無抗分枝桿菌活性的抗生素是多粘菌素、兩性霉素B、萘啶酮酸、甲氧芐啶、阿洛西林和萬古霉素，且所述培養(yǎng)基還包含抗真菌劑，優(yōu)選兩性霉素B。
9.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。
10.權(quán)利要求9所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于其包含基礎(chǔ)培養(yǎng)基，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基是參照號為7H9的Middlebrook液體培養(yǎng)基；并包含分枝桿菌的下列附加生長因子酪蛋白水解產(chǎn)物、甘油、聚山梨醇酯、氯高鐵血紅素、乳酸、生物素、聚氧乙烯硬脂酸酯、牛血清白蛋白、葡萄糖和補(bǔ)充物H。
11.權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于所述培養(yǎng)基是含有膠凝劑的固體培養(yǎng)基，所述膠凝劑優(yōu)選地選自瓊脂，所述膠凝劑的重量比優(yōu)選地為0. 5-5%, 更優(yōu)選地為1_2%。
12.權(quán)利要求11所述的分枝桿菌培養(yǎng)基，其特征在于其是參照號為7H10的 Middlebrook類型的固體培養(yǎng)基，添加有所述膠凝劑和分枝桿菌的下列附加生長因子油酸；牛白蛋白、優(yōu)選牛白蛋白的級份V ；葡萄糖；過氧化氫酶和甘油。
13.通過權(quán)利要求1-12中任一項(xiàng)所述的分枝桿菌培養(yǎng)基培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于在30-37°C的溫度下，在所述分枝桿菌培養(yǎng)基中，加熱含有所述分枝桿菌的樣品，所述 30-37°C的溫度適合培養(yǎng)包含于所述樣品中的分枝桿菌。
14.權(quán)利要求13所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于將含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌的樣品于37°C培養(yǎng)于所述分枝桿菌培養(yǎng)基中。
15.權(quán)利要求13或14所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于進(jìn)行下列階段-培養(yǎng)可能含有分枝桿菌的生物學(xué)樣品，直到細(xì)菌的生長是可檢測的，和-通過染色試驗(yàn)鑒定所檢測到的細(xì)菌是分枝桿菌屬的細(xì)菌，和-如果需要，通過分子分析，優(yōu)選通過質(zhì)譜分析法，鑒定所述分枝桿菌的種類。
16.權(quán)利要求13-15中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于在不到15天、優(yōu)選不多于10天內(nèi)，檢測到所述結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌的生長，從而允許在不到1周內(nèi)檢測50%的所述分枝桿菌。
17.權(quán)利要求13-16中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其中培養(yǎng)可能含有分枝桿菌和污染性細(xì)菌的生物學(xué)樣品，所述污染性細(xì)菌的生長可抑制所述分枝桿菌生長，所述方法的特征在于1/用氯己定對所述培養(yǎng)基中的所述樣品進(jìn)行有限時(shí)期的初步階段的初始凈化，以便將氯己定的作用限制在針對除了分枝桿菌以外的其他細(xì)菌的活性，優(yōu)選在氯己定溶液中處理約15分鐘，同時(shí)攪拌，和2/通過以下方式除去氯己定用中性緩沖液洗滌來自階段1/的如此處理的樣品，隨后離心并回收含有如此滅活的污染性細(xì)菌和沒有被滅活的分枝桿菌的細(xì)菌團(tuán)，將所述細(xì)菌團(tuán)接種于所述分枝桿菌培養(yǎng)基中。
18.權(quán)利要求17所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于所述分枝桿菌培養(yǎng)基是分枝桿菌的液體培養(yǎng)基。
19.權(quán)利要求13-18中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于進(jìn)行生物學(xué)樣品的培養(yǎng)，所述生物學(xué)樣品是從大便樣品獲得的。
20.權(quán)利要求13-19中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基是所述的分枝桿菌的液體培養(yǎng)基，且通過定期分析培養(yǎng)容器中的氧濃度來檢測所述分枝桿菌的生長。
21.權(quán)利要求13-17中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于所述培養(yǎng)基是固體培養(yǎng)基，且當(dāng)在所述固體培養(yǎng)基中可觀察到細(xì)菌菌落的形成時(shí)，用肉眼檢測所述分枝桿菌的生長。
22.權(quán)利要求21所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其中使用固體培養(yǎng)基，其特征在于進(jìn)行下述階段，其中i/_在存在不同的已知濃度的至少一種給定的抗生素的情況下，將所述分枝桿菌，優(yōu)選結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的分枝桿菌，培養(yǎng)于所述固體培養(yǎng)基中，和ii/_測定抑制所述細(xì)菌的所有可見生長的抗生素的最小濃度，所述抗生素優(yōu)選地選自利福平、異煙胼、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和鏈霉素。
23.權(quán)利要求22所述的培養(yǎng)分枝桿菌的方法，其特征在于在階段i/_，將至少一試紙條放置在所述固體培養(yǎng)基上，其中沿著所述試紙條按濃度梯度浸有不同濃度的所述抗生素。
24.權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)和鑒定分枝桿菌的方法，其特征在于通過分子分析鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌的種類，所述分子分析包括分析通過質(zhì)譜分析法所獲得的蛋白特征譜，并將其與用培養(yǎng)于相同培養(yǎng)條件下的不同種類的分枝桿菌的參照菌株的樣品所獲得的一系列蛋白特征譜進(jìn)行比較。
25.權(quán)利要求對和權(quán)利要求15-19中任一項(xiàng)所述的培養(yǎng)和鑒定生物學(xué)樣品中的分枝桿菌的方法，其特征在于，在所述分枝桿菌的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述生物學(xué)樣品，并且通過分子分析鑒定分枝桿菌屬細(xì)菌的種類，所述分子分析包括分析通過質(zhì)譜分析法所獲得的蛋白特征譜，并將其與用培養(yǎng)于相同培養(yǎng)條件下的多種分枝桿菌的參照菌株的樣品所獲得的一系列蛋白特征譜進(jìn)行比較，并且為了進(jìn)行質(zhì)譜分析法，根據(jù)下述階段，對直接從培養(yǎng)液通過雙離心所獲得的細(xì)菌團(tuán)進(jìn)行分析a-通過在90°C以上，優(yōu)選在95°C，加熱1小時(shí)，優(yōu)選同時(shí)攪拌，滅活培養(yǎng)的生物學(xué)樣品的細(xì)菌，其中已經(jīng)檢測了所述樣品中的細(xì)菌的生長，b-以低速、優(yōu)選500rev/min，對所述的培養(yǎng)的生物學(xué)樣品的上清液進(jìn)行第一次離心， 其中已經(jīng)檢測了所述樣品中的細(xì)菌的生長，進(jìn)行所述第一次離心，直到所述樣品中所含的血液中的紅細(xì)胞發(fā)生沉淀，和C-從階段b-的第一次離心回收上清液，并以高速、優(yōu)選至少10，OOOrev/min、優(yōu)選約 14，OOOrev/min，進(jìn)行第二次離心，進(jìn)行所述第二次離心，以便獲得細(xì)菌團(tuán)的沉淀，和d-優(yōu)選地，用中性緩沖液，如PBS，洗滌來自階段C-的所述細(xì)菌團(tuán)，并進(jìn)行化學(xué)處理，優(yōu)選地用乙腈和三氟乙酸的混合物，以便從所述細(xì)菌中分離蛋白，從而使得它們可以通過質(zhì)譜分析法進(jìn)行分析，以及回收來自階段d-的細(xì)菌蛋白團(tuán)，并將其放置在質(zhì)譜分析板上。
全文摘要
本發(fā)明涉及新的分枝桿菌培養(yǎng)基，特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基明顯減少培養(yǎng)分離時(shí)間，并因此減少診斷分枝桿菌特別是結(jié)核病分枝桿菌的時(shí)間。本發(fā)明的培養(yǎng)基含有去纖維蛋白血液、卵磷脂和去補(bǔ)體的胎牛血清。本發(fā)明還涉及培養(yǎng)和鑒定分枝桿菌、特別是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的細(xì)菌的方法。更具體而言，本發(fā)明涉及新的凈化方法，其中用氯己定處理所謂的新的分離和分枝桿菌培養(yǎng)基中的生物學(xué)樣品。本方面還涉及通過本發(fā)明的固體培養(yǎng)基，通過表型確定分枝桿菌對抗生素敏感性的方法。最后，本發(fā)明還涉及通過質(zhì)譜分析法在液相中進(jìn)行鑒定的新方法，因此有助于明顯縮短診斷分枝桿菌病特別是結(jié)核的時(shí)間。為了進(jìn)行質(zhì)譜分析，根據(jù)本發(fā)明，分析通過雙離心直接由培養(yǎng)液所獲得的細(xì)菌。
文檔編號C12R1/32GK102449137SQ200980153939
公開日2012年5月9日 申請日期2009年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年12月5日
發(fā)明者D·拉烏爾, M·德朗古 申請人:地中海(?？怂?馬賽第二)大學(xué), 馬賽公立醫(yī)院