專利名稱：抗muc1抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體領(lǐng)域的技術(shù)。若進(jìn)一步特定，則涉及抗粘蛋白-1的抗體和使用該抗體的癌癥治療技術(shù)。
背景技術(shù)：
作為一種粘蛋白的粘蛋白-KMucinl，本說(shuō)明書以下也記作MUC1)是腫瘤相關(guān)抗原，是在多種腺癌中表達(dá)的高分子量糖蛋白。研究表明在該蛋白中，不可缺少的膜糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域主要由富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的20個(gè)氨基酸核心序列(本說(shuō)明書以下也稱作“jTr^O-Hier” ；HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO :1))的 30 90 個(gè)串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成。 “Tn20-mer”通過(guò)個(gè)體表達(dá)的重復(fù)數(shù)由遺傳決定，產(chǎn)生大小多態(tài)性。幾乎所有的MUCl反應(yīng)性單克隆抗體的最小序列識(shí)別存在于APDTRPAP內(nèi)，認(rèn)為是 1型β轉(zhuǎn)角。MUCl串聯(lián)重復(fù)中的序列SAPDTRP是免疫優(yōu)勢(shì)B細(xì)胞表位，串聯(lián)重復(fù)的T細(xì)胞表位位于五聚體PDTRP上。腫瘤MUCl通常被低糖基化，糖基化位點(diǎn)經(jīng)常具有異常型糖鏈伸長(zhǎng)。該異常型糖基化產(chǎn)生露出正常的潛在性(cryptic)肽表位和創(chuàng)造出新型碳水化合物表位的結(jié)果。為了它們的高分子量OX IO5 5X IO7道爾頓)以及廣范圍的糖基化，細(xì)胞膜粘蛋白以柔軟的桿狀體的形式存在，以較大的距離自細(xì)胞表面突出。因此，粘蛋白形成多糖外皮的重要成分， 也許是抗體與免疫系統(tǒng)的細(xì)胞的細(xì)胞接觸的第一要點(diǎn)。而且，專利文獻(xiàn)1記載抗MUCl抗體DF3-P。該DF3-P與脫糖鏈MUCl反應(yīng)，但糖鏈特異性尚未明確。專利文獻(xiàn)2記載抗MUCl抗體7F11、1E4。7F11、1E4與添加有糖鏈的MUCl結(jié)合，但糖鏈特異性尚未明確。專利文獻(xiàn)3記載抗MUCl抗體Alt-I。Alt-I不依賴于糖鏈而結(jié)合，但糖鏈特異性尚未明確。非專利文獻(xiàn)1記載抗MUCl抗體Pankol、Panko2。若抗MUCl抗體Pankol、2的串聯(lián)重復(fù)短則結(jié)合弱?？筂UCl抗體Pank0l、2的糖鏈特異性尚未明確。非專利文獻(xiàn)2公開(kāi)了在免疫原中使用糖肽方面利用同樣的方法制作的抗MUCl抗體VU-2G7。記載著具有糖鏈特異性識(shí)別的能力。在專利文獻(xiàn)4公開(kāi)的Panko單克隆抗體中，選擇性尚不充分，因此，現(xiàn)在仍然需要能夠選擇性地與腫瘤相關(guān)MUCl結(jié)合、并減少、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防其在癌癥中的影響的新型治療用組合物。因此，特別需要含有結(jié)合劑的治療用組合物，所述結(jié)合劑含有肽和腫瘤特異性碳水化合物兩者、并可以與MUCl的表位結(jié)合。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1 專利第3698370號(hào)說(shuō)明書專利文獻(xiàn)2 日本特表2002-502521公報(bào)
專利文獻(xiàn)3 日本特表2003-519096公報(bào)專利文獻(xiàn)4 美國(guó)專利申請(qǐng)公開(kāi)2006/(^擬643非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn) 1 :Cancer Immunol Immunother 55 :1337-1347(2006)非專利文獻(xiàn)2 Tumor Biology 第 21 卷，No. 4，197-210，(2000)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明的課題是提供不易與正常細(xì)胞結(jié)合、對(duì)癌細(xì)胞特異性的抗體。解決課題的方法本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)使用2，3ST 糖肽(與 HGVTSAPD TRPAPGSTAPPA (SEQ ID NO 1)的氨基酸序列一致的表位)作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，由此得到的抗體出乎意料地、顯著且特異性地識(shí)別癌特異性的糖鏈，進(jìn)而可以識(shí)別、殺傷表達(dá)具有這樣的癌細(xì)胞特異性糖鏈的 MUCl的癌細(xì)胞，從而解決了上述課題。因此，在1個(gè)局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其具有抗體依賴性細(xì)胞毒性。在另一局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，與正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相比具有至少為1000倍的與癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性。在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì) MUCl的癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性與對(duì)MUCl的正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性相比，為100倍以上。這里，在1實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)選自Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R (2，3ST6L)和 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Neu5A c α 2 — 3Gal β 1 — 4G1 cNAc β 1 — 6] GalNAc α -R (2，3ST6SL)。這里，Neu5Ac 為 N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal為半乳糖，GlcNAc為N-乙酰葡糖胺，GalNAc為N-乙酰半乳糖胺，R為非糖部分。在1實(shí)施方案中，本發(fā)明中使用的癌相關(guān)結(jié)構(gòu)選自 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 G a 1 NA c α - R ( 2，3 S T)、G a 1 NA c α - R (T η)禾口 Gal β 1 ^ 3GalNAca-R(T)。在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子對(duì)癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性可以通過(guò)與2，3ST的交差反應(yīng)性來(lái)表現(xiàn)。交差反應(yīng)性通過(guò)算式(對(duì)2，3ST的 IC50/對(duì)進(jìn)行比較的糖鏈結(jié)構(gòu)的IC50) X100(% )來(lái)計(jì)算。在1個(gè)實(shí)施方案中顯示本發(fā)明的抗體與上述正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)的交差反應(yīng)性為0. 以下，而對(duì)于癌相關(guān)結(jié)構(gòu)(100% ) 具有1000倍以上的特異性。在又一實(shí)施方案中，該特異性是對(duì)于上述癌相關(guān)結(jié)構(gòu)，IC50為IOOnM以下。在又一局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì)癌細(xì)胞的特異性較對(duì)正常細(xì)胞的特異性強(qiáng)至少100倍。在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì)癌細(xì)胞的特異性較對(duì)正常細(xì)胞的特異性強(qiáng)至少100倍。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該癌細(xì)胞為MUCl表達(dá)細(xì)胞。在又一具體實(shí)施方案中，使用的癌細(xì)胞為T-47D株。
在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其具有特異性地與MUCl結(jié)合或與MUCl發(fā)生相互作用，以殺傷癌細(xì)胞的能力。在1實(shí)施方案中，使用的癌細(xì)胞為表達(dá)腫瘤相關(guān)MUCl的癌細(xì)胞。在另一實(shí)施方案中，對(duì)于TnlOO-mer生物素的解離常數(shù)低于1. 0X10_9(M)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該抗體為1B2。在優(yōu)選的局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子， 其具有與Tn20-mer串聯(lián)結(jié)構(gòu)片段結(jié)合的能力。在又一局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，使用jTr^O-Iiier生物素時(shí)的450nm的吸光度(A20)與使用TnlOO-mer生物素時(shí)的450nm 的吸光度(A100)之比(A100/A20)為2以下。在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，使用 Tn20-mer生物素時(shí)的450nm的吸光度(A20)與使用TnlOO-mer生物素時(shí)的450nm的吸光度 (A100)之比(A100/A20)為 2 以下。在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，與正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相比具有至少為100倍的對(duì)癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性，該抗體的特征在于對(duì)于與HGVTSA PDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列一致的表位是特定的，該表位的位置9結(jié)合有糖鏈，對(duì)癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性較對(duì)普通IgGh高至少10%。在又一局面中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，其是針對(duì)2，3ST糖肽(與HGVTSAPDT RPAPGSTAPPA (SEQ ID NO 1)的氨基酸序列一致的表位)而特異性產(chǎn)生的。在又一局面中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，，其中，是針對(duì)2，3ST糖肽(與HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO 1)的氨基酸序列一致的表位)而特異性產(chǎn)生的。在特定的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中具有抗體1B2的全長(zhǎng)序列(包含SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)或其一部分。在又一特定實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl 結(jié)合分子，所述抗MUCl抗體是具有包含免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和免疫球蛋白輕鏈(VL)的至少1個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的抗體，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū)CDRl、CDR2、CDR3, CDRl由序列NYGLS(SEQ ID NO :4)或其變體組成，CDR2由序列 ENHPGSGIIYHNEKFRG(SEQ ID NO 5)或其變體組成，CDR3 由序列 SSGTRGFAY(SEQ ID NO 6) 或其變體組成，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū)⑶Rl，、⑶R2，、⑶R3，，⑶Rl，由序列 RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO 7)或其變體組成，CDR2，由序列 KVSNRFS (SEQ ID N0: 8)或其變體組成，⑶R3’由序列FQGSHGPWT(SEQ ID NO 9)或其變體組成。在又一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，所述抗體是具有包含免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH)和免疫球蛋白輕鏈(VL)的至少1個(gè)抗原結(jié)合位的抗體，該重鏈可變結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū)⑶R1、⑶R2、⑶R3，⑶Rl由序列 NYGLS(SEQ ID NO 4)或其變體組成，CDR2 由序列 ENHPGSGIIYHNEKFRG(SEQ ID NO 5) 或其變體組成，⑶R3由序列SSGTRGFAY (SEQ ID NO 6)或其變體組成，該輕鏈可變結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū) CDR1，、CDR2，、CDR3，，CDR1，由序列 RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ IDNO 7)或其變體組成，CDR2，由序列KVSNRFS (SEQ ID NO 8)或其變體組成，CDR3，由序列 FQGSHGPffT(SEQ ID NO 9)或其變體組成。在又一局面中，本發(fā)明涉及藥物，該藥物包含本發(fā)明的抗體、其抗原結(jié)合性片段或 MUCl結(jié)合分子。在又一局面中，本發(fā)明的藥物為抗癌藥。在又一局面中，本發(fā)明提供核酸分子(例如DNA等)，該核酸分子編碼本發(fā)明的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子。在又一局面中，本發(fā)明涉及診斷劑，該診斷劑包含本發(fā)明的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子。在又一局面中，本發(fā)明涉及診斷試劑盒，該試劑盒包含本發(fā)明的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子。在又一局面中，本發(fā)明提供生產(chǎn)抗MUCl抗體的方法，該方法包括下述步驟A)提供 2，3ST 糖肽(與 HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO :1)的氨基酸序列一致的表位)的步驟；B)用該2，3ST糖肽對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫以得到雜交瘤的步驟；以及C)從該動(dòng)物中選擇對(duì)2，3ST(糖)顯示出親和性的雜交瘤的克隆的步驟。本發(fā)明抗體的串聯(lián)重復(fù)依賴性低，這可用以下理由解釋。S卩，MUCl中帶有多種糖鏈，是因?yàn)槟軌蝾A(yù)想到串聯(lián)重復(fù)依賴性低的抗體中有多個(gè)抗體與MUCl結(jié)合，而多個(gè)抗體所結(jié)合的MUCl對(duì)癌癥的治療效果更好。即，可以說(shuō)明如下串聯(lián)重復(fù)依賴性高的抗體只能夠與表位結(jié)構(gòu)(〇)重復(fù)的部分強(qiáng)力結(jié)合(與〇-〇-〇-〇_〇的親和性高，但與口 - Δ -〇-■ - ▲的親和性低(這里，Α、Δ、·和□彼此不同，各〇表示不同的其他表位結(jié)構(gòu)。))，而串聯(lián)重復(fù)依賴性低的抗體，即使有ι個(gè)表位結(jié)構(gòu)(〇)，也可以強(qiáng)力結(jié)合(與〇-〇-〇-〇-〇的親和性高，與 □-Δ-0-·-▲的親和性也高)。在所有這些局面中，只要本說(shuō)明書所記載的各實(shí)施方案可以應(yīng)用，即可理解為在其他局面中也能夠應(yīng)用。發(fā)明效果提供幾乎不與正常細(xì)胞結(jié)合、而與癌細(xì)胞特異性結(jié)合的抗體。該抗體甚至還具有癌細(xì)胞殺傷能力，被期待作為副作用少的抗癌藥。


圖1顯示各種MUCl糖肽對(duì)于抗體1Β2和生物素- (DT*R)-100 (表1的化合物編號(hào)21)的結(jié)合的取代曲線?？v軸顯示以沒(méi)有添加各種MUCl糖肽時(shí)的450nm的吸光度為 100%時(shí)的、添加了各種MUCl糖肽時(shí)的450nm的吸光度的比例，橫軸顯示各種MUCl糖肽的濃度。黑菱形顯示2，3ST，星號(hào)顯示T，白菱形顯示Tn，黑三角顯示2，3ST6L，白三角顯示2， 3ST6SL。圖2顯示各種MUCl糖肽對(duì)于抗體PankoMab和生物素- (DT*R)-100 (表1的化合物編號(hào)21)的結(jié)合的取代曲線?？v軸顯示以未添加各種MUCl糖肽時(shí)的450nm的吸光度為100%時(shí)的、添加了各種MUCl糖肽時(shí)的450nm的吸光度的比例，橫軸顯示各種MUCl糖肽的濃度。黑菱形顯示2，3ST，星號(hào)顯示T，白菱形顯示Tn，黑三角顯示2，3ST6L，白三角顯示 2，3ST6SL。圖3顯示抗體1B2的MUCl串聯(lián)重復(fù)依賴性。縱軸顯示450nm的吸光度，橫軸顯示MUCl糖肽的濃度。白菱形顯示20-mer，黑菱形顯示40_mer，黑圓顯示60_mer，星號(hào)顯示 80-mer,白圓顯示 100-mer。圖4顯示抗體PankoMab的MUCl串聯(lián)重復(fù)依賴性?？v軸顯示450nm的吸光度，橫軸顯示MUCl糖肽的濃度。涂成白色顯示20-mer，水珠圖案顯示40_mer，橫線顯示60_mer， 涂成黑色顯示100-mer。圖5顯示抗體1B2的人乳癌免疫組織的染色圖像。左側(cè)顯示對(duì)照IgG，右側(cè)顯示抗體1B2。上圖(panel)顯示腫瘤部分，下圖顯示相鄰的正常部分。圖6顯示抗體1B2的抗體依賴性細(xì)胞毒性?？v軸顯示發(fā)生抗體依賴性細(xì)胞死亡的細(xì)胞的比例，橫軸顯示抗體的濃度。黑菱形顯示抗體1B2，白三角顯示IgGh。圖7顯示通過(guò)FACS研究在癌細(xì)胞膜表面表達(dá)的MUCl蛋白與1B2抗體是否結(jié)合的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。顯示通過(guò)FACSAria分析的結(jié)果。上部分顯示對(duì)于乳癌細(xì)胞T-47D的結(jié)果，下部分顯示對(duì)于作為對(duì)照的乳腺上皮細(xì)胞184A的結(jié)果。點(diǎn)線顯示對(duì)照抗體，實(shí)線顯示1B2抗體。 該結(jié)果顯示1B2抗體與乳癌細(xì)胞強(qiáng)烈反應(yīng)，而幾乎不與乳腺上皮細(xì)胞反應(yīng)。圖8顯示抗體1B2的可變區(qū)的氨基酸序列(SEQ ID NO 14和SEQ ID NO :15)。上兩列顯示重鏈(SEQ ID NO 14)，下兩列顯示輕鏈(SEQ ID N0:15)。下線顯示各⑶R位點(diǎn)。圖9顯示抗體1B2的可變區(qū)(SEQ ID NO 2和SEQ ID NO 3)與Pankol的可變區(qū) (SEQ ID NO: 10 禾口 SEQ ID NO: 11)以及 Panko2 的可變區(qū)(SEQ ID NO: 12 禾口 SEQ ID NO: 13) 之間的比對(duì)。上兩列顯示重鏈，下兩列顯示輕鏈。下線顯示各⑶R位點(diǎn)。圖10顯示用于通過(guò)夾層免疫測(cè)定來(lái)定量MUCl的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式以下，關(guān)于本發(fā)明，說(shuō)明發(fā)明的實(shí)施方式。在本說(shuō)明書整體中，只要沒(méi)有特別言及， 則單數(shù)形式的表達(dá)(例如英語(yǔ)中的“3”、“皿”、“讓^等、其他語(yǔ)言中對(duì)應(yīng)的冠詞、形容詞等) 應(yīng)理解為還包含其復(fù)數(shù)形式的概念。另外，本說(shuō)明書中使用的用語(yǔ)，只要沒(méi)有特別言及，則應(yīng)該理解為以該領(lǐng)域中通常使用的意義使用。因此，本說(shuō)明書中使用的所有專門用語(yǔ)和科學(xué)技術(shù)用語(yǔ)，只要沒(méi)有另外定義，則具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常所理解的意義相同的意義。發(fā)生矛盾時(shí)，本說(shuō)明書(包含定義)優(yōu)先。(用語(yǔ)的定義)本說(shuō)明書中，“蛋白”、“多肽”、“寡肽”和“肽”在本說(shuō)明書中以相同意義使用，是指任意長(zhǎng)度的氨基酸的聚合物。該聚合物可以是直鏈也可以是支鏈，還可以是環(huán)狀。氨基酸可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸，還可以是經(jīng)改變的氨基酸。該用語(yǔ)還可以包含將多個(gè)多肽鏈裝配成復(fù)合體。該用語(yǔ)還包含天然或人工改變的氨基酸聚合物。作為這樣的改變，例如有二硫鍵形成、糖基化、脂質(zhì)化、乙酰基化、磷酸化或任意的其他操作或改變(例如與標(biāo)記成分形成結(jié)合體)。該定義中，例如還包含含有氨基酸的1或2個(gè)以上類似物的多肽(例如包含非天然氨基酸等)、肽樣化合物(例如擬肽)和該領(lǐng)域中公知的其他改變。本說(shuō)明書中，“氨基酸”只要滿足本發(fā)明的目的，可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸。本說(shuō)明書中，“核酸”也可以與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互換使用。特定的核酸序列還包含“剪接變體”。同樣，由核酸編碼的特定的蛋白默認(rèn)包含由該核酸的剪接變體編碼的任意的蛋白。如其名稱所暗示，“剪接變體”是指基因的可變剪接的產(chǎn)物。轉(zhuǎn)錄后，最初的核酸轉(zhuǎn)錄物可以被剪接，以使不同的(其他)核酸剪接產(chǎn)物編碼不同的多肽。 雖然剪接變體的產(chǎn)生機(jī)理發(fā)生變化，但包含外顯子的可變剪接。該定義還包含通過(guò)連讀轉(zhuǎn)錄來(lái)自相同核酸的不同多肽。該定義包含剪接反應(yīng)的任意產(chǎn)物(包括重組形式的剪接產(chǎn)物)?；蛘?，等位基因突變體也納入該范圍內(nèi)。本說(shuō)明書中，“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本說(shuō)明書中以相同的意義使用，是指任意長(zhǎng)度的核苷酸的聚合物。該用語(yǔ)還包含“寡核苷酸衍生物”或“多核苷酸衍生物”?！肮押塑账嵫苌铩被颉岸嗪塑账嵫苌铩卑塑账岬难苌?，或者是指核苷酸間的結(jié)合與平常不同的寡核苷酸或多核苷酸，可互換使用。作為這樣的寡核苷酸，具體例示例如2’ -0-甲基-核苷酸、寡核苷酸中的磷酸二酯鍵被變換成硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的磷酸二酯鍵被變換成N3’ -P5’氨基磷酸酯鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的核糖與磷酸二酯鍵被變換成肽核酸鍵的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被 C-5丙炔基尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的寡核苷酸衍生物、寡核苷酸中的胞嘧啶被吩噁嗪修飾的胞嘧啶(phenoxazine-modified cytosine)取代的寡核苷酸衍生物、DNA中的核糖被2’ -0-丙基核糖取代的寡核苷酸衍生物以及寡核苷酸中的核糖被2’ -甲氧基乙氧基核糖取代的寡核苷酸衍生物等。除非另有指明，否則特定的核酸序列與所明示的序列一樣，企圖包含其保守性改變的變體(例如簡(jiǎn)并密碼子取代體)和互補(bǔ)序列。具體而言，簡(jiǎn)并密碼子取代體通過(guò)制作1個(gè)或多個(gè)所選擇的(或所有)密碼子的第 3位的位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列可以達(dá)成(Batzer等人，Nucleic Acid Res. 19:5081(1991) ；Ohtsuka 等人，J. Biol. Chem. 260 :2605-2608 (1985) ；Rossolini 等人，Mol. Cell. Probes 8 :91-98 (1994))。本說(shuō)明書中，“核苷酸”只要保持目標(biāo)功能，可以是天然核苷酸，也可以是非天然核苷酸。在本說(shuō)明書中，氨基酸可以通過(guò)其通常公知的三字母符號(hào)或由IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission推薦的單字母符號(hào)談及。核苷酸也一樣，可以通過(guò)通常認(rèn)知的單字母密碼談及。本說(shuō)明書中，“糖鏈”是指1個(gè)以上的單元糖(單糖和/或其衍生物)相連形成的化合物。2個(gè)以上的單元糖相連時(shí)，各單元糖彼此之間通過(guò)糖苷鍵的脫水縮合而結(jié)合。作為這樣的糖鏈，例如有生物體中含有的多糖類(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及它們的復(fù)合體和衍生物)；以及由分解的多糖、糖蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、糖脂等復(fù)合生物體分子分解或誘導(dǎo)的糖鏈等廣范圍的糖鏈，但并不限于這些。因此，本說(shuō)明書中，糖鏈可以和“糖”、“多糖”、“糖精(glucide)”、“碳水化合物”互換使用。另外，沒(méi)有特別言及時(shí)，在本說(shuō)明書中，“糖鏈”有時(shí)包含糖鏈和含糖鏈的物質(zhì)兩者。代表性的有約20種單糖(葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰半乳糖胺、唾液酸以及它們的復(fù)合體和衍生物等)連接成鏈狀的物質(zhì)，附著在生物體的細(xì)胞內(nèi)外的蛋白或脂質(zhì)上。功能根據(jù)單糖的序列而不同，通常形成復(fù)雜的分支，預(yù)想人體中具有數(shù)百種以上的各種結(jié)構(gòu)的糖鏈，并且，認(rèn)為人體中有用的結(jié)構(gòu)有數(shù)萬(wàn)種以上。發(fā)現(xiàn)其與細(xì)胞間的分子、細(xì)胞識(shí)別功能等蛋白或脂質(zhì)在生物體內(nèi)發(fā)揮的高級(jí)功能有關(guān)，但其機(jī)理還有許多未解明的部分。作為次于核酸、蛋白的第3生命鏈，在目前的生命科學(xué)中受到關(guān)注。尤其期待作為細(xì)胞識(shí)別中的配體(信息分子)的糖鏈的功能，人們?cè)谘芯科湓诟吖δ懿牧祥_(kāi)發(fā)中的應(yīng)用。本說(shuō)明書中，“糖鏈基”是指糖鏈與其他基團(tuán)結(jié)合時(shí)所給予的名稱。糖鏈基根據(jù)情況是指一價(jià)或二價(jià)的糖鏈基。例如，作為糖鏈基，有唾液酸化的Lewis X基、N-乙?；樘前坊?、α 1-6甘露二糖基。在本說(shuō)明書中使用的糖的簡(jiǎn)稱中，Neu5Ac是指N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal是指半乳糖， GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺，GalNAc是指N-乙酰半乳糖胺，R是指非糖部分(例如肽、蛋白、 脂質(zhì)等)。另外，關(guān)于糖鏈的特定名稱，可如下定義。2，3ST6L :Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R2,3ST6SL :Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R2，3ST :Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3GalNAc α -RTn : Ga INAc α -RT =Gal β 1 — 3GalNAc α -R本說(shuō)明書中，基因的“同源性”是指2個(gè)以上的基因序列彼此的相同性的程度。因此，某2個(gè)基因的同源性越高，它們的序列的相同性或類似性越高。2種基因是否具有同源性，這可以通過(guò)序列的直接比較、或者當(dāng)為核酸時(shí)通過(guò)在嚴(yán)格條件下的雜交法來(lái)研究。直接比較2個(gè)基因序列時(shí)，其基因序列間DNA序列代表性地至少80%相同、優(yōu)選至少90%相同、 更優(yōu)選至少95%相同時(shí)，它們的基因具有同源性。本說(shuō)明書中，關(guān)于氨基酸序列和核苷酸序列的類似性、相同性以及同源性的比較， 使用作為序列分析用工具的BLAST，利用缺省參數(shù)算出。相同性的檢索例如可以使用NCBI 的BLAST 2.2.1K2004.5. 12發(fā)行)來(lái)進(jìn)行。本說(shuō)明書中的相同性的值通常是指使用上述 BLAST在缺省的條件下比對(duì)時(shí)的值。其中，當(dāng)通過(guò)參數(shù)的變更而得到更高的值時(shí)，以最高的值作為相同性的值。在多個(gè)區(qū)評(píng)價(jià)相同性時(shí)，以其中的最高值作為相同性的值。本說(shuō)明書中，“對(duì)應(yīng)的”基因是指，在某種中與作為比較的基準(zhǔn)的種中規(guī)定的基因具有同樣的作用、或者預(yù)測(cè)具有同樣的作用的基因，當(dāng)存在多個(gè)具有這樣的作用的基因時(shí)， 是指在進(jìn)化學(xué)方面具有相同起源的基因。因此，與某種基因(例如MUC1)對(duì)應(yīng)的基因可以是其基因的直向同源物。因此，與人的基因?qū)?yīng)的基因在其他動(dòng)物(小鼠、大鼠、豬、兔、豚鼠、牛、綿羊等)中也可以發(fā)現(xiàn)。這樣的對(duì)應(yīng)的基因可以利用該領(lǐng)域中眾所周知的技術(shù)來(lái)鑒定。因此，例如某種動(dòng)物中的對(duì)應(yīng)的基因，可以使用作為對(duì)應(yīng)基因的基準(zhǔn)的基因序列作為檢測(cè)序列(query sequence)，通過(guò)檢索該動(dòng)物(例如小鼠、大鼠、豬、兔、豚鼠、牛、綿羊等)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)可以發(fā)現(xiàn)。在本說(shuō)明書中，“斷片”或“片段”是指相對(duì)于全長(zhǎng)的多肽或多核苷酸(長(zhǎng)度為η) 具有1 η-1的序列長(zhǎng)度的多肽或多核苷酸。片段的長(zhǎng)度根據(jù)其目的可以適當(dāng)變更，例如， 作為其長(zhǎng)度的下限，當(dāng)為多肽時(shí)，可以列舉3、4、5、6、7、8、9、10、15，20、25、30、40、50及其以上的氨基酸，以其中沒(méi)有具體列舉的整數(shù)表示的長(zhǎng)度(例如11等)作為下限也是適合的。 另外，當(dāng)為多核苷酸時(shí)，可以列舉5、6、7、8、9、10、15，20、25、30、40、50、75、100及其以上的核苷酸，以其中沒(méi)有具體列舉的整數(shù)表示的長(zhǎng)度(例如11等)作為下限也是適合的。本說(shuō)明書中，多肽和多核苷酸的長(zhǎng)度可以如上所述以各氨基酸或核酸的個(gè)數(shù)表示，但上述個(gè)數(shù)不是絕對(duì)的，只要具有相同的功能，作為上限或下限的上述的個(gè)數(shù)意為還包含其個(gè)數(shù)的上下多個(gè)(或例如上下10% )數(shù)。為了表現(xiàn)這樣的意圖，在本說(shuō)明書中，有時(shí)在個(gè)數(shù)前添加 “約”來(lái)表達(dá)。但在本說(shuō)明書中，應(yīng)理解為有沒(méi)有“約”對(duì)其數(shù)值的解釋沒(méi)有影響。本說(shuō)明書中，有效片段的長(zhǎng)度可以根據(jù)在作為其片段基準(zhǔn)的全長(zhǎng)蛋白的功能中是否保持至少一種功能來(lái)確定。本說(shuō)明書中，“變體”、“改變序列，，或“類似物，，是指，相對(duì)于原來(lái)的多肽或多核苷酸等物質(zhì)，有一部分發(fā)生變更的物質(zhì)。作為這樣的變體，例如有取代變體、添加變體、缺失變體、截短的(truncated)變體、等位基因突變體等。等位基因(allele)是指屬于同一基因座、互相有別的遺傳性變體。因此，“等位基因突變體”是指對(duì)于某種基因存在等位基因的關(guān)系的變體?！胺N相同體或同系物(homolog)”是指，在某種中與某種基因在氨基酸水平或核苷酸水平具有同源性(優(yōu)選80%以上的同源性、更優(yōu)選90%以上的同源性)的種。獲得這樣的種相同體的方法由本說(shuō)明書的記載而明了。在本說(shuō)明書中，為了制作功能上等價(jià)的多肽，除氨基酸的取代以外，還可以進(jìn)行氨基酸的添加、缺失或修飾。氨基酸的取代是指用1個(gè)以上、例如1 10個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、 更優(yōu)選1 3個(gè)氨基酸取代原來(lái)的肽。氨基酸的添加是指在原來(lái)的肽鏈上添加1個(gè)以上、 例如1 10個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、更優(yōu)選1 3個(gè)氨基酸。氨基酸的缺失是指從原來(lái)的肽中缺失1個(gè)以上、例如1 10個(gè)、優(yōu)選1 5個(gè)、更優(yōu)選1 3個(gè)氨基酸。氨基酸修飾包括酰胺化、羧基化、硫酸化、鹵化、烷基化、磷酸化、氫氧化、?；?例如乙?；?等，但并不限于這些。被取代或添加的氨基酸可以是天然氨基酸，也可以是非天然氨基酸或氨基酸類似物，但優(yōu)選天然氨基酸。編碼這樣的多肽的核酸可以利用眾所周知的PCR法而得到，還可以進(jìn)行化學(xué)合成。例如可以將位點(diǎn)特異性誘變法、雜交法等與這些方法組合。在本說(shuō)明書中，多肽或多核苷酸的“取代、添加和/或缺失”是指，相對(duì)于原來(lái)的多肽或多核苷酸，分別取代、添加或去除氨基酸或其代替物、或者核苷酸或其代替物。這樣的取代、添加和/或缺失的技術(shù)在該領(lǐng)域眾所周知，這樣的技術(shù)的例子有位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)等。作為基準(zhǔn)的核酸分子或多肽中的這些變化，只要保持目標(biāo)功能(例如在抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子中與MUCl結(jié)合等)，可以在該核酸分子的5’末端或3’末端發(fā)生、或者在顯示該多肽的氨基酸序列的氨基末端位點(diǎn)或羧基末端位點(diǎn)發(fā)生、或者在它們的末端位點(diǎn)之間的任何位置發(fā)生、或者分別散在于基準(zhǔn)序列中的殘基間。取代、添加或缺失的數(shù)當(dāng)為1個(gè)以上時(shí)，可以是任意的數(shù)，只要在具有該取代、添加或缺失的變體中保持目標(biāo)功能(例如與MUCl的結(jié)合等)，對(duì)這樣的數(shù)沒(méi)有限制。例如，這樣的數(shù)可以是1個(gè)或數(shù)個(gè)，而且優(yōu)選為整體長(zhǎng)度的5%以內(nèi)、或25個(gè)以下等。本說(shuō)明書中，“類似的氨基酸”是指，存在保守取代的關(guān)系的氨基酸，以下的氨基酸適合。而且，可理解為由本發(fā)明的特定序列(例如1B2)進(jìn)行了以下取代的變體也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。
A :G, I, V, LC:M (含S氨基酸)D :N、Q 或 EE :N、Q 或 DF:Y、A 等G :AH:W 等I :A, L, V, (G)K :RL :A, I, V, (G)M:S 等N:E、D 或 QP =HyPQ:N、E 或 DR:KS:T、YT :S,YV:I，L，A、(G)W:HY:F、S，T
這些氨基酸間的取代在本說(shuō)明書中也稱作“保守取代”。
本說(shuō)明書中，“MUC1”是指粘蛋白的一種即粘蛋白1的蛋白或其基因、DNA、核酸。 MUCl是腫瘤相關(guān)抗原，是在多種腺癌中表達(dá)的高分子量糖蛋白。研究表明在該蛋白中，不可缺少的膜糖蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域主要由富含絲氨酸、蘇氨酸和脯氨酸的20個(gè)氨基酸核心序列(本說(shuō)明書以下還稱作“!"r^O-mer” ；HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA(SEQ ID NO :1))的 30 90個(gè)串聯(lián)重復(fù)構(gòu)成。“Tn20-mer”通過(guò)個(gè)體表達(dá)的重復(fù)數(shù)由遺傳決定，產(chǎn)生大小多態(tài)性。(抗體)本說(shuō)明書中，“抗體”總體上是指在免疫反應(yīng)中通過(guò)抗原的刺激在生物體內(nèi)產(chǎn)生且與抗原特異性結(jié)合或反應(yīng)的蛋白、或通過(guò)化學(xué)合成等生產(chǎn)與它們具有相同序列的蛋白。實(shí)體是免疫球蛋白，也稱作Ab。本說(shuō)明書中，抗體的“抗原結(jié)合性片段”是指，關(guān)于某種抗體，對(duì)于與該抗體的抗原相同的抗原具有結(jié)合性的片段。是否納入這樣的“抗原結(jié)合性片段”的范圍，這可以通過(guò)本說(shuō)明書中記載的親和性的測(cè)定來(lái)評(píng)價(jià)。在本說(shuō)明書中，這樣的親和性可以以抑制標(biāo)記 MUCl分子與抗體的結(jié)合量的50%的濃度(IC50值)為指標(biāo)來(lái)顯示，IC50值例如可以通過(guò)邏輯增長(zhǎng)曲線的回歸模型(Rodbard等人，Synposium on RIA and related procedures in medicine, P165, Int. Atomic Energy Agency, 1974)算出。在本說(shuō)明書中，“抗MUCl抗體”是指針對(duì)MUCl而產(chǎn)生的、或者與其具有同等的結(jié)合能力的抗體。在本說(shuō)明書中，“抗體依賴性細(xì)胞毒性”是指依賴于抗體來(lái)殺傷細(xì)胞的能力。為了測(cè)定該能力，例如可以利用本說(shuō)明書中記載的鉻釋放試驗(yàn)等。在本說(shuō)明書中，“正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)”是指在未發(fā)生癌化的正常細(xì)胞或正常組織中高度表達(dá)的結(jié)構(gòu)(例如糖鏈結(jié)構(gòu))。已知該結(jié)構(gòu)在癌組織或癌細(xì)胞中表達(dá)量低。作為這樣的正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)的糖鏈，例如有Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1-3 [Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 —6] GalNAc α -R (2，3ST6L)禾口 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R (2，3ST6SL)等。在本說(shuō)明書中，“癌相關(guān)結(jié)構(gòu)”是指在癌組織或癌細(xì)胞中高度表達(dá)的結(jié)構(gòu)(例如糖鏈結(jié)構(gòu))。已知該結(jié)構(gòu)在正常組織或正常細(xì)胞中表達(dá)量低。作為這樣的癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的糖鏈，例如有 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3GalNAc α -R (2，3ST)、GalNAc α -R(Tn)和 Gal β 1 — 3GalNAc α -R(T)。這里，Neu5Ac為N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal為半乳糖，GlcNAc為 N-乙酰葡糖胺，GalNAc為N-乙酰半乳糖胺，R為非糖部分。在本說(shuō)明書中，與正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相比的、對(duì)癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的“特異性”是指，與正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相比，與癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的親和性更高的性質(zhì)。這樣的特異性可以通過(guò)交差反應(yīng)性的不同來(lái)表現(xiàn)。交差反應(yīng)性通過(guò)算式(對(duì)癌相關(guān)結(jié)構(gòu)2，3ST的IC50/對(duì)進(jìn)行比較的糖鏈結(jié)構(gòu)的IC50)X100(%)來(lái)計(jì)算。在本說(shuō)明書中， 具有特異性是指具有2倍以上的差。另外，在本說(shuō)明書中，IC5tl是指抑制50%的濃度，是指抑制某種抗體與抗原的結(jié)合的50%所必需的濃度。IC50值可以通過(guò)邏輯增長(zhǎng)曲線的回歸模型(Rodbard等人， Synposium on RIA and related procedures in medicine, P165, Int. Atomic Energy Agency, 1974)算出。在本說(shuō)明書中，“癌細(xì)胞”以與腫瘤細(xì)胞相同的意義使用，是指惡性細(xì)胞。作為本發(fā)明的對(duì)象的代表性的癌細(xì)胞，有MUCl表達(dá)細(xì)胞。具體可以列舉T-47D細(xì)胞株。作為對(duì)照細(xì)胞，可以使用正常乳腺細(xì)胞的184A1株。需要說(shuō)明的是，作為未表達(dá)MUCl的乳癌細(xì)胞，例如有 MDA-MB-231 細(xì)胞、MCF-7 細(xì)胞。在本說(shuō)明書中，與某種抗原發(fā)生“相互作用”是指甚至沒(méi)有結(jié)合就相互產(chǎn)生某些影響。在本說(shuō)明書中，“殺傷癌細(xì)胞的能力”是指某種抗體殺傷癌細(xì)胞的能力。這樣的能力可以通過(guò)實(shí)施例所記載的、以癌細(xì)胞為對(duì)象的鉻釋放試驗(yàn)(實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)別冊(cè)在所有生物研究中起作用的免疫學(xué)操作規(guī)程)來(lái)實(shí)施。在本說(shuō)明書中，“串聯(lián)依賴性”是指，MUCl的串聯(lián)結(jié)構(gòu)的重復(fù)越多，抗體越強(qiáng)力結(jié)合的性質(zhì)。串聯(lián)依賴性例如可以通過(guò)研究使用Tn20-mer生物素時(shí)的450nm的吸光度(A20) 與使用！"nIOO-mer生物素時(shí)的450nm的吸光度(AlOO)之比(A100/A20)為2以下來(lái)判定。在本說(shuō)明書中，“與TnlOO-mer生物素的親和性”是指與使Tn20-mer重復(fù)5次而得到的串聯(lián)結(jié)構(gòu)(TnlOO-mer)上結(jié)合有生物素的產(chǎn)物的親和性，可以按照實(shí)施例中記載的方法進(jìn)行試驗(yàn)。在本說(shuō)明書中，“Tn20-mer串聯(lián)結(jié)構(gòu)片段”是指單一的Tn20-mer串聯(lián)結(jié)構(gòu)?！安淮嬖诖?lián)依賴性”是指不管該串聯(lián)結(jié)構(gòu)的數(shù)目是多少(即使是一個(gè))均可發(fā)生反應(yīng)。在本說(shuō)明書中，免疫球蛋白“重鏈可變結(jié)構(gòu)域(VH) ”和“輕鏈可變(VL)結(jié)構(gòu)域” 以該領(lǐng)域中通常使用的意義使用。免疫球蛋白是基本結(jié)構(gòu)相同的2條L鏈(輕鏈、lightchain)和2條H鏈(重鏈、heavy chain)通過(guò)S_S鍵相連接，H鏈的C末端側(cè)的Fc (可結(jié)晶段)和N末端側(cè)的Fab (抗原結(jié)合片段)這2個(gè)片段在鉸鏈部彎曲相連，整體呈Y字形。 在L鏈和H鏈雙方中，自N末端起約110個(gè)氨基酸(L鏈的約一半的長(zhǎng)度)的序列是根據(jù)抗原特異性而部分性不同的序列。將該部分稱作可變部分(可變區(qū)、V部)，L鏈和H鏈兩者的可變部分(VL、VH)與決定抗原特異性有關(guān)?？勺儾糠忠酝獾牟糠值拿恳粋€(gè)綱或亞綱幾乎恒定，稱作恒定部分(恒定區(qū)、constant region、C部)。在恒定部分中，包含約110個(gè)氨基酸的多肽單元(同源單元)在L鏈中有一個(gè)(CL)，而在H鏈中，在IgG、IgA、IgD中有3個(gè) (CH1、CH2、CH3)，在IgM、IgE中有4個(gè)相連接，各單元或通過(guò)與對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)結(jié)合而產(chǎn)生的區(qū)稱作結(jié)構(gòu)域(domain)。(抗體分子的表達(dá)方法、抗原結(jié)合性片段、結(jié)合分子)在本說(shuō)明書中，只要沒(méi)有格外指示為其他意義，則抗體等任意的多肽鏈作為具有以 N 末端(N-terminal extremity)開(kāi)始、以 C 末端(C-terminal extremity)終結(jié)的氨基酸序列的多肽鏈記載?？乖Y(jié)合位點(diǎn)包含Vh和\結(jié)構(gòu)域兩者時(shí)，它們可以位于同一多肽分子中，或者優(yōu)選各結(jié)構(gòu)域可以位于其他鏈上，此時(shí)，Vh結(jié)構(gòu)域?yàn)槊庖咔虻鞍准纯贵w的重鏈或其片段的一部分，而\是免疫球蛋白即抗體的輕鏈或其片段的一部分。在本說(shuō)明書中，“MUC1結(jié)合分子”是指單獨(dú)或與其他分子相關(guān)，通過(guò)任一個(gè)能夠與 MUCl抗原結(jié)合的任意的分子。因此，MUCl結(jié)合分子在定義上可理解為除了包含抗體和抗體的抗原性結(jié)合片段以外還包含含結(jié)合部分的其他分子。這樣的結(jié)合反應(yīng)可以通過(guò)與抗體的親和性的試驗(yàn)相同的試驗(yàn)來(lái)判定。在本說(shuō)明書中，所使用的“抗體或抗原結(jié)合性片段”的例子包括通過(guò)B細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的抗體和嵌合抗體、CDR移植抗體或人的抗體或其任意片段、例如F(ab’)2和Fab 片段、單鏈抗體和單一結(jié)構(gòu)域抗體。因此，在本說(shuō)明書中，所使用的“MUC1結(jié)合分子”的例子可以理解為包括通過(guò)這些B細(xì)胞或雜交瘤產(chǎn)生的抗體和嵌合抗體、CDR移植抗體或人的抗體或其任意片段、例如F(ab’)2和Fab片段、在單鏈抗體和單一結(jié)構(gòu)域抗體中結(jié)合有其他分子的抗體等。單鏈抗體包含通過(guò)包含10 30個(gè)氨基酸、優(yōu)選15 25個(gè)氨基酸的肽接頭進(jìn)行共價(jià)結(jié)合的抗體的重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域。因此，其結(jié)構(gòu)不包含重鏈和輕鏈的恒定部分，認(rèn)為小的肽間隔的抗原性較整個(gè)恒定部分的抗原性低。“嵌合抗體1指雖然重鏈或輕鏈或其雙方的恒定區(qū)來(lái)源于人、而重鏈和輕鏈雙方的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于非人(例如小鼠)或來(lái)源于人，但由其他人抗體誘導(dǎo)的抗體?！癈DR移植抗體”是指，超可變位點(diǎn)區(qū)(CD 由非人(例如小鼠)抗體或其他人抗體這樣的供體抗體誘導(dǎo)、而免疫球蛋白的其他部分全部或?qū)嵸|(zhì)上全部例如恒定區(qū)和可變結(jié)構(gòu)域的高度保存部分、即構(gòu)架區(qū)由受體抗體(accepter antibody)、 例如來(lái)源于人的抗體誘導(dǎo)的抗體。但是，CDR移植抗體在構(gòu)架區(qū)中、例如與超可變區(qū)相鄰的構(gòu)架區(qū)的一部分中包含供體序列的數(shù)個(gè)氨基酸?！叭嗽椿贵w”是指重鏈和輕鏈兩者的恒定區(qū)和可變區(qū)全部來(lái)源于人或者實(shí)質(zhì)上與來(lái)源于人的序列相同、但未必是來(lái)源于同一抗體的抗體，而且包括小鼠免疫球蛋白可變部分和恒定部分的基因被人對(duì)應(yīng)物(counterpart，負(fù)體)、例如歐州專利054607;3B1、美國(guó)專利5545806等中以普通用語(yǔ)記載的人對(duì)應(yīng)物取代的小鼠產(chǎn)生抗體。因此，優(yōu)選的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其重鏈和輕鏈的可變結(jié)構(gòu)域來(lái)源于人，例如能夠具有在SEQ ID NO 2,SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :14或SEQ ID NO 15 的變體(例如可以列舉包含1個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、插入、添加或缺失的變體，但并不限于此。)中所示的序列。恒定區(qū)結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包含適當(dāng)?shù)娜撕愣▍^(qū)結(jié)構(gòu)域、例如Kabat E.A.等人’ US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Institute ofHealth中記載的結(jié)構(gòu)域。通過(guò)將可變區(qū)的氨基酸序列適用在由Kabat等人制作的抗體的氨基酸序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(“kquence of Proteins of Immunological Interest "US Dept. Health and Human Services, 1983)中以研究同源性，可以找到 CDR 區(qū)。 只要在保持本發(fā)明所期望的生物學(xué)活性(例如結(jié)合活性或中和活性)的范圍內(nèi)，通過(guò)至少1 個(gè)添加、插入、取代或缺失而產(chǎn)生的CDR區(qū)的序列的變體也包括在本發(fā)明中。另外，可以列舉與各⑶R區(qū)的同源性為90 100%的序列的CDR區(qū)。在本說(shuō)明書中，“抗體效價(jià)(titer)”是指，在血清反應(yīng)中，抗血清的單位容量中所含的、與抗原結(jié)合的抗體量。實(shí)際的測(cè)定通過(guò)在抗血清的稀釋系列中加入一定量的抗原來(lái)進(jìn)行，測(cè)定值以反應(yīng)發(fā)生的終點(diǎn)的稀釋倍數(shù)表示。在本說(shuō)明書中，“親和性(affinity)”是指抗體與其識(shí)別物質(zhì)間的結(jié)合力。在本說(shuō)明書中中，以抗體與抗原等其識(shí)別物質(zhì)的解離常數(shù)為指標(biāo)來(lái)顯示親和性(Kd)。親和性(Kd) 的測(cè)定方法對(duì)于該領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是常識(shí)，例如還可以使用傳感器芯片來(lái)求得。構(gòu)架可以與任意種類的構(gòu)架區(qū)相關(guān)，但優(yōu)選為來(lái)源于人的構(gòu)架。適當(dāng)?shù)臉?gòu)架區(qū)可以參照Kabat E.A.等人的文獻(xiàn)來(lái)選擇。優(yōu)選的重鏈構(gòu)架為人重鏈構(gòu)架，例如為SEQ ID N0 2或SEQ ID NO 14中所示的抗MUCl抗體的構(gòu)架。這可以參照上述文獻(xiàn)由SEQ ID NO 2或 SEQ ID N0:14所示的序列來(lái)決定，包含F(xiàn)R1、FR2、FR3和FR4區(qū)的序列。按照同樣的方法， 關(guān)于抗MUCl輕鏈構(gòu)架，可以參照上述文獻(xiàn)由SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 15所示的序列來(lái)決定，包含F(xiàn)Rl，、FR2，、FR3，和FR4，區(qū)的序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供MUCl結(jié)合分子，該MUCl結(jié)合分子含有包含第 1結(jié)構(gòu)域或第2結(jié)構(gòu)域中的任一個(gè)結(jié)構(gòu)域的至少1個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，所述第1結(jié)構(gòu)域具有與 SEQ ID NO 2或SEQ ID NO :14(1B2的VH序列)的構(gòu)架實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列，第2結(jié)構(gòu)域具有與SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :15 (1B2的VL序列)的構(gòu)架實(shí)質(zhì)上同源的氨基酸序列。對(duì)于所有在人體內(nèi)天然發(fā)現(xiàn)的蛋白而產(chǎn)生的單克隆抗體，典型地可以在非人系統(tǒng)、例如小鼠中生產(chǎn)。作為其直接的結(jié)果，對(duì)人給予該單克隆抗體時(shí)，由雜交瘤產(chǎn)生的異種個(gè)體抗體使通過(guò)異種個(gè)體免疫球蛋白的恒定部分優(yōu)勢(shì)介導(dǎo)的不期望的免疫應(yīng)答表面化。這明顯限制了無(wú)法長(zhǎng)期給藥的抗體的使用。因此，特別優(yōu)選單鏈、單一結(jié)構(gòu)域、嵌合、CDR移植、 或者特別是預(yù)測(cè)對(duì)人給藥時(shí)不會(huì)顯示出實(shí)質(zhì)性的變態(tài)反應(yīng)應(yīng)答的人的抗體的使用。本發(fā)明的更優(yōu)選的抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段、或MUCl結(jié)合分子選自下述抗體，所述抗體至少包含下述a)和b) :a) (i)免疫球蛋白重鏈可變結(jié)構(gòu)域(Vh)或其片段， 其中，序列中包含超可變位點(diǎn)、⑶Rl、⑶R2和⑶R3，此時(shí)，⑶Rl具有氨基酸序列TNYGLS (SEQ ID NO 4)，CDR2 具有氨基酸序列 ENHPGSGIIYHNEKFRG (SEQ ID NO 5), CDR3 具有氨基酸序列 SSGTRGFAY(SEQ ID NO 6)；和(ii)人重鏈的恒定部分或其片段；以及b)⑴免疫球蛋白輕鏈可變結(jié)構(gòu)域或其片段，其中，序列中包含超可變位點(diǎn)、⑶Rl ’、⑶R2’和⑶R3’，此時(shí)，⑶Rl ’ 具有氨基酸序列 RSSQSIVHSNGNTYLE(SEQ ID NO :7)，CDR2，具有氨基酸序列 KVSNRFS (SEQ IDNO :8)，CDR3，具有氨基酸序列FQGSHGPWT(SEQ ID NO 9)；和(ii)人輕鏈的恒定部分或其片段、以及它們的直接的等價(jià)物。此外，本發(fā)明的抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子可以選自單鏈結(jié)合分子，所述單鏈結(jié)合分子包含下述a)、b)、c) :a)第1結(jié)構(gòu)域，其中，序列中包含作為超可變區(qū)的⑶Rl、⑶R2和⑶R3，此時(shí)，該超可變區(qū)具有如SEQ ID NO :2或SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；b)第2結(jié)構(gòu)域，其中，序列中包含超可變位點(diǎn)、⑶R1’、⑶R2’和⑶R3’，此時(shí)，該超可變區(qū)具有如SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 15所示的氨基酸序列；c)抗原結(jié)合位點(diǎn)，其中包含與第1結(jié)構(gòu)域的N末端和第2結(jié)構(gòu)域的C末端、或第1結(jié)構(gòu)域的C末端和第2結(jié)構(gòu)域的N末端中的任一個(gè)末端結(jié)合的肽接頭以及它們的直接等價(jià)物。眾所周知，通過(guò)1個(gè)氨基酸或多個(gè)氨基酸的缺失、添加、插入或取代等微小改變， 可以生產(chǎn)實(shí)質(zhì)上具有同源性的原始蛋白(original protein)所對(duì)應(yīng)的蛋白。在本說(shuō)明書中，上述“直接等價(jià)物”是指任意抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或 MUCl結(jié)合分子的任意分子，其中，(i)超可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3作為整體相對(duì)于SEQ ID NO 4, SEQ ID NO :5或SEQ ID NO :6所示的超可變區(qū)具有至少80%以上的同源性、優(yōu)選至少90%以上的同源性、更優(yōu)選至少95%以上的同源性，而其中(i)超可變區(qū)⑶R1，、⑶R2， 和⑶R3，作為整體相對(duì)于SEQ ID NO :7、SEQ ID NO 8或SEQ ID NO 9所示的超可變區(qū)具有至少80%以上的同源性、優(yōu)選至少90%以上的同源性、更優(yōu)選至少95%以上的同源性。 本說(shuō)明書中，在多個(gè)氨基酸序列中，在與最佳排列該序列的相同的位置具有至少80 %以上相同氨基酸殘基時(shí)，彼此具有至少80 %以上同源性，此時(shí)，氨基酸序列中的缺口或插入可以數(shù)作是不相同的殘基。人重鏈的恒定部分可以是Y” Υ2、Υ3、Υ4、μ、α” α2、δ或ε型，優(yōu)選Y型， 更優(yōu)選Y1型，而人輕鏈的恒定部分可以是κ或λ型(包括入3亞型)，但優(yōu)選為κ型。所有這些恒定部分的氨基酸序列由Kabat等人提供。因此，在通常的方法中，提供(i) DNA分子，其編碼本發(fā)明的單一結(jié)構(gòu)域MUCl結(jié)合分子、本發(fā)明的單一鏈MUCl結(jié)合分子、本發(fā)明的抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子的重鏈或輕鏈或其片段；(ii)本發(fā)明的DNA分子在通過(guò)重組方法進(jìn)行的本發(fā)明的抗 MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子的產(chǎn)生中的應(yīng)用。本發(fā)明的抗MUCl抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，可以參考以下序列， 以采用其序列的信息。例如，在以下的表中，優(yōu)選本發(fā)明的抗體中使用的優(yōu)選的構(gòu)架序列在重鏈可變區(qū)(Vh)中為FRH1、FRH2、FRH3和FHR4所對(duì)應(yīng)的序列，而在輕鏈可變區(qū)中為 FRL1、FRL2、FRL3和FRL4所對(duì)應(yīng)的序列。CDR的序列為SEQ ID NO 4 SEQ ID NO :9，本說(shuō)明書中在其他場(chǎng)所也有詳述。Vh可以由FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4構(gòu)成， 而Vl可以由FRLl-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4構(gòu)成。表中的L表示輕鏈，H表示重鏈，氨基酸為單字母表記。L106A等的A是指在輕鏈的第106位氨基酸與第107位氨基酸之間插入氨基酸。[表1A1]表 IA-I
權(quán)利要求
1.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì)MUCl的癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性與對(duì)MUCl的正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性相比，為100倍以上。
2.權(quán)利要求1所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)選自 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R 禾口 Neu5 Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3 [Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 4GlcNAc β 1 — 6] GalNAc α -R,上述癌相關(guān)結(jié)構(gòu)選自 Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3GalNAc α -R、GalNAc α -R 禾口 Gal β 1 — 3GalNAc α -R,這里， Neu5Ac為N-乙酰神經(jīng)氨酸，Gal為半乳糖，GlcNAc為N-乙酰葡糖胺，GalNAc為N-乙酰半乳糖胺，R為非糖部分。
3.權(quán)利要求1所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述特異性為 1000倍以上。
4.權(quán)利要求1所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述特異性是 以癌相關(guān)結(jié)構(gòu)Neu5Ac α 2 — 3Gal β 1 — 3GalNAc α -R為100%時(shí)的交差反應(yīng)性在上述正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)中均為0. 以下。
5.權(quán)利要求2所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述特異性是 對(duì)于上述癌相關(guān)結(jié)構(gòu)，IC50為IOOnM以下。
6.權(quán)利要求1所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì)癌細(xì)胞的特異性較對(duì)正常細(xì)胞的特異性強(qiáng)至少100倍。
7.權(quán)利要求6所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述癌細(xì)胞為 MUCl表達(dá)細(xì)胞。
8.權(quán)利要求6所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，上述癌細(xì)胞為 T-47D 株。
9.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，對(duì)于TnlOO-mer生物素的解離常數(shù)小于 1. OXlO-9Mo
10.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，使用Tn20-mer生物素時(shí)的450nm 的吸光度A20與使用TnlOO-mer生物素時(shí)的450nm的吸光度AlOO之比A100/A20為2以下。
11.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其特征在于與正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)相比具有至少為100倍的對(duì)癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性，其中，該抗體與下式
12.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其是針對(duì)下式
13.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，具有抗體1B2的全長(zhǎng)序列，所述全長(zhǎng)序列包含 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 14 以及 SEQ ID NO 3 或 SEQ ID NO :15。
14.抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子，其中，具有包含免疫球蛋白重鏈可變區(qū) VH結(jié)構(gòu)域和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)VL結(jié)構(gòu)域的至少1個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，該重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū)CDRl、CDR2、CDR3, CDRl由NYGLS即SEQ ID NO 4的序列或其變體組成，CDR2由ENHPGSGIIYHNEKFRG即SEQ ID NO 5的序列或其變體組成，CDR3由 SSGTRGFAY即SEQ ID NO 6的序列或其變體組成，該輕鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域在其序列中包含超可變區(qū)⑶R1’、⑶R2’、⑶R3’，⑶R1，由 RSSQSIVHSNGNTYLE 即 SEQ ID NO 7 的序列或其變體組成，CDR2，由 KVSNRFS 即 SEQ ID NO 8的序列或其變體組成，⑶R3’由FQGSHGPWT即SEQ ID NO 9的序列或其變體組成。
15.藥物組合物，其中含有權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或 MUCl結(jié)合分子或MUCl結(jié)合分子。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物，該藥物組合物為抗癌藥。
17.診斷試劑盒，其中含有權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或 MUCl結(jié)合分子或MUCl結(jié)合分子。
18.核酸分子，該核酸分子編碼權(quán)利要求1 14中任一項(xiàng)所述的抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUCl結(jié)合分子。
全文摘要
本發(fā)明的課題是提供不與正常細(xì)胞結(jié)合、對(duì)癌細(xì)胞特異性的抗體。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)使用2，3ST糖肽作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫，所得抗體出乎意料地、顯著且特異性地識(shí)別癌特異性的糖鏈，進(jìn)而可以識(shí)別、殺傷表達(dá)具有這樣的癌細(xì)胞特異性糖鏈的MUC1的癌細(xì)胞，從而解決了上述課題。本發(fā)明提供抗體、其抗原結(jié)合性片段或MUC1結(jié)合分子，所述抗體例如對(duì)MUC1的癌相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性與對(duì)MUC1的正常組織相關(guān)結(jié)構(gòu)的特異性相比，為100倍以上。
文檔編號(hào)C12N15/13GK102264765SQ20098015387
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2009年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月28日
發(fā)明者內(nèi)藤正一, 大藪巨樹(shù), 小野田順二, 比能洋, 沼田義人, 西村紳一郎 申請(qǐng)人:國(guó)立大學(xué)法人北海道大學(xué), 鹽野義制藥株式會(huì)社